PCR技术原理讲解及人的SRY基因扩增

PCR技术原理及人SRY基因扩增 DNA的结构 DNA的复制 模板 基因组DNA原料 游离的核苷酸A G C T催化剂 DNA聚合酶需要的条件 活细胞内的微观环境 DNA的复制 体内invivo体外invitro DNA的复制 PCR技术的发明 KaryB Mullis Californianhighway Khorana 1971 等提出在体外经DNA变性 与适当引物杂交 再用DNA聚合酶延伸 克隆DNA的设想 1983年 Mullis发明了PCR技术 使Khorana的设想得到实现 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 PCR技术的特点 1 高度的灵敏性 2 特异性 3 操作简便易行 4 用途广泛 30轮循环扩增量达230个拷贝 109拷贝 生命科学 DNA重组 转基因生物医学工程 基因疫苗 产前诊断疾病诊断 艾滋病 禽流感法医学 血迹 精斑等痕迹DNA考古学 远古人类 猛犸DNA PCR技术的应用 人的性别决定 人的性别决定 FatherMother 22pairs XY 22pairs XX 22 X 22 Y 22 X 22pairs XX 22pairs XY Girl Boy 1959年生物学家发现Y染色体决定人 和老鼠 的男性特征 1975年 Wachtel等提出Y染色体上有一个组织相容性抗原的基因H Y和男性决定有关 1987年 DavidPage认为Y染色体上一个特定的基因ZFY是决定男性的基因 1988年 澳大利亚的Sinclair实验室发现袋鼠类的ZFY基因不在Y染色体上 而是在常染色体上 1990年 澳大利亚女科学家MarshallGraves和英国的Lovell Badge两个实验室发现另外一个基因SRY 人的性别决定 Y SRY男性 利用PCR技术检测SRY基因 男性 有SRY 阳性结果女性 无SRY 阴性结果应用 奥运会运动员的性别鉴定犯罪现场血痕 毛发的性别鉴定野生动物的性别鉴定 男女 总体积25 lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶 反应体系 移液器 pipette 枪头 tips 反应管 tube 95 3min 94 30s 52 30s 72 30s30个循环 72 延伸5min 核酸电泳 1 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶 准确称量琼脂糖干粉 加入到配胶用的三角烧瓶内 定量加入电泳缓冲液 2 放入到微波炉内加热熔化 3 冷却片刻 加入一滴荧光染料 轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液 倒入电泳槽中 待其凝固 凝胶完全凝结 小心拔出梳子 将凝胶安放在电泳槽内 4 向电泳槽中倒入电泳缓冲液 其量以没过胶面1mm为宜 如样品孔内有气泡 应设法除去 5 在DNA样品中加入10 体积的载样缓冲液 loadingbuffer 混匀后 用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内 6 接通电源 红色为正极 黑色为负极 切记DNA样