《细胞工程》第2章：(1)分子生物学基础31.ppt

细胞工程 CellEngineering Chapter2 细胞工程基础 1 2 1分子生物学基础2 1 1基因与基因调控2 1 2基因组学与基因工程2 1 3蛋白质组学与蛋白质工程2 1 4糖组学与糖工程2 1 5脂组学与脂工程 2 1分子生物学基础 2 1 1基因与基因调控一 基因的组成和结构变化1 组成和结构变化 1 基因的精细结构 细胞分子生物学角度 基因 Gene 是具有遗传效应的一段DNA序列 它是一个转录单位 并通过表达产生专一性效应 2 基因和基因组组成或结构特点 重叠基因功能相关的基因成串排列 原核其转录受共同调节 称操纵子 生物表达采用硬件控制 可动基因 转座子 比较经济 少 断裂基因表达采用软件控制 真核转座子 假基因多层次协调调控机制 生物丰余基因 基因簇 无明显操纵子结构 3 结构变化 移码基因突变置换转换突变结构 缺失 重复 倒位 易位染色体单个增减 单体 2n 1 三体 2n 1 畸变缺体 2n 2 双三体 2n 1 1 数量 四体 2n 2 同源多倍体 3n 4n 倍数5n 6n 8n 增减异源多倍体 2n1 2n2 3n1 3n2 4n1 4n2 二 基因的表达和调控 1 基因的功能 2 基因的表达调控 DNA 转录调控hnRNA 加工调控细胞核mRNA 转运调控mRNA细胞质翻译调控mRNA降解调控 蛋白质失活mRNA 蛋白质活性调控失活蛋白质 2 1 2基因组学与基因工程 20世纪中期 随着蛋白质空间结构的X衍射解析和DNA双螺旋的发现 开始了分子生物学时代 对遗传信息载体DNA和生命功能的承担者蛋白质的研究成了生命科学研究的主要内容 90年代初期 一项庞大的旨在破译人类所有遗传信息的研究计划 人类基因组计划开始实施 迄今为止 人类基因组计划的全部测序基本完成 即由A C G T四种碱基单位组成的蕴含着全部人类生物信息的一套线性DNA编码已展现在我们面前 人的23对同源染色体基因组含有大约3万多个基因由10多亿个碱基对组成 它们只占基因组很小部分 并且在人与人之间差别非常小 但这些微小差异往往引起如身高 肤色 指纹和血型等表型上的显著差异 而存在于非编码蛋白质区域的DNA差异 有些起调节基因的作用 更多的则起到了积累这些信息的作用 如为人类的起源 进化 人群迁移提供重要信息 伴随人类基因组计划的实施 探究各种人的DNA序列差异 DNA多态性的工作也在进行当中 对人类基因组DNA多态性开发工作很多 其中大规模的计划有旨在比较全世界不同人种差异的人类基因组多样性计划 区分对环境相关疾病易感性差异的环境基因组计划和研究对药物反应存在差异的药物基因组学 虽然对基因的识别将导致对其编码的蛋白质产物的序列的了解 但远不足以全面认识蛋白质的生物功能 事实上 我们对相当多的通过基因序列所认识的蛋白质产物很不了解 再明确一些说 蛋白质自身特有的活动规律 如蛋白质的修饰加工 转运定位 结构形式 蛋白质与蛋白质或其他生物大分子相互作用等活动信息 均无法在基因组水平上获知 细胞内蛋白质组成的极其多样性和复杂网络性动态变化 也难以在基因组水平上得到反映 正是在这种背景下 蛋白质组学应运而生 蛋白质组 Proteome 一词是马克 威尔金斯在1994年最先提出来的 它是指一个生物体的全部蛋白质组成 具体的可以指一个细胞或一个组织的基因组所表达的或所对应的全部蛋白质 蛋白质组学的研究目标包括鉴别生物体合成的全部蛋白质及其活动方式 随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的实施 生命科学迎来了一个革命性的飞跃 人类第一次有可能从生物大分子整体活动的角度来认识生命 也能从分子水平的动态的 整体的角度对生命现象的本质及其活动规律和重大疾病的机制进行研究 一 基因组与人类基因组计划 HGP 1 基因组 是指与表型有关的多个基因组成的基因 基因组学 是指在研究表型时不是针对单个基因开展工作而是对与其可能存在关系的多个基因组成的群体进行研究的学科 2 人类基因组计划 HGP 是指美国科学家于1985年在能源部 DOE 的一次会议上讨论酝酿 诺贝尔奖获得者RenatoDulbecco于1986年在 科学 Science 杂志上发表的一篇短文中率先提出的 旨在阐明人类基因组DNA长达3 109碱基对 bp 的序列 发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置 从而在整体上破译人类遗传信息 获得一张生命元素周期表 3 基因组作图与DNA测序 基因组作图 是指测序前将不能直接来进行测序人类染色体的基因组进行分解 使其较易变成较易操作的小结构区域的过程 根据使用标志和手段的不同 可以将其分为遗传连锁图 通过计算连锁遗传标志间的重组率确定它们距离的作图法 单位厘摩 和物理图 确定各遗传标志间实际物理距离 单位碱基对或Mb 遗传图绘制需要用多态性标志 如RFLP 限制酶切长度多态性 STR 短串联重复序列 又称微卫星MS或SSR 和SNP 单个碱基多态性 物理图有两层含义 一是明确分布于整个基因组的序列标签位点 使每隔一定距离有一个标志 另一是构建覆盖每条染色体的大片段的YAC 酵母人工染色体 物理图是连锁图的前提和基础 人类基因组转录图 或基因图 是连锁图雏形 DNA测序 是指测定DNA碱基组成和顺序的技术和方法 基因组DNA要进行大规模测序需要策略和大能量测序技术 如下图 4 人类基因组单体型图及其国际单体型图计划 TheInternationalHaplotypeMapProject 简称HapMapProject HapMap计划如同测序计划的续集 测序揭示了遗传的总体和共同特性 HapMap计划则研究有关个体差异的遗传规律 个体差异为遗传的多态性所致 最常见的是单核苷酸多态性 Singlenucleotidepolymorphism SNP 指DNA序列某一位置上不同个体可能有不同的核苷酸组成 单体型指单条染色体片段或一段DNA在世代传递中连锁遗传 不发生重组 的SNP的顺序组合 亦即分别来自父母的单条染色体上多态位点的分布和传递模式 人群中SNP位点超过1000万 每200 300个核苷酸就有一个多态位点 个体的性状差异包括罹患某种疾病的易感性 对不同环境或药物的敏感性等也就蕴藏在这些SNP位点和单体型中 HapMap计划就是构建不同人群的高密度SNP图谱 确立SNP在人群中的常见分布和传递模式 从而揭示人类作为群体的遗传机制 为发现复杂性疾病的相关易感基因提供基础数据 研究策略和先进技术 HapMap计划于2002年10月29日宣布正式启动 第一阶段是针对非 亚 欧裔的270个样品以平均每5000个核苷酸 5kb 一个SNP位点的密度构建5kb单体型图 第二阶段将密度增至2kb 尼日利亚提供非裔样品 中国和日本共同提供亚裔样品 欧裔样品来自美国 加拿大 中国 日本 英国和美国分别承担全基因组10 10 25 24 和31 的SNP分型任务 2005年10月26日 国际协作组宣布了拥有数亿数据的人类基因组单体型图成功构建 以及一个更精细的遗传图谱即将完成 2007年10月18日 国际协作组在 自然 杂志上发表了第二阶段数据构建的第二代HapMap HapMap对于基因组学发展和人类健康的深远影响 具体体现在以下几个方面 高精密度人类遗传用表对于全球范围复杂性疾病易感基因研究的巨大推动 如对脑瘤 卵巢癌和肺癌进行大规模研究 HapMap本身对于人类遗传多态性的最新发现及其对于基因组科学的极大推动 如对HapMap的分析利用使人类对于自身结构多态性产生了几乎全新的认识 也促进了Encode DNA元件全书 计划的完成 HapMap计划对于基因组研究技术的重大促进 如大大推动了SNP分型技术与策略的发展 高能量和低成本的多种分型技术不断出现或完善 全基因组扫描芯片 特别是基于HapMap的标签SNP的芯片为病例 对照研究提供了有效工具 HapMap再一次击退基因专利对于人类健康事业的挑战 最终 一个十数亿数据的高密度的HapMap成为全人类共享的宝贵财富 国际HapMap及其 中国卷 的完成对于我国基因组学研究和疾病易感基因定位的重要推动 中国构建3号 21号染色体和8号染色体短臂的单体型图及提供一半的亚洲样品 高能量测序技术成为研究复杂疾病 癌症和单基因病的有力工具 如基于基因芯片技术的基因组关联分析 Genomewideassociationstduy GWAS 已经广泛用于高血压 糖尿病 癌症 精神分裂症等200多种复杂疾病的研究 参见图 二 基因工程 又名重组DNA技术 1 基因工程 GeneTechnology 是指人为有目的地改变基因以生产产品并服务于人类的技术方法和工程 2 基因工程的内容 基因文库的构建 基因组DNA分子的消化DNA分子的连接制备基因文库应考虑的因素基因组DNA文库cDNA文库接头和衔接体RNA的浓缩方法消减杂交法克隆PCR方法 克隆载体 源于质粒的克隆载体 质粒筛选系统 pUC质粒克隆以病毒为基础的克隆载体 插入型与置换型克隆载体M13和以噬菌粒为基础的克隆载体 克隆 单链噬菌体载体以粘粒为基础的克隆载体具有插入大片段能力的克隆载体酵母人工染色体克隆载体真核细胞中使用的载体 基因探针与杂交 克隆DNA探针 RNA基因探针 基因文库的筛选 菌落与噬菌斑杂交通过PCR筛选基因文库筛选表达cDNA文库杂交选择 扣留翻译 基因克隆的应用 体外诱变克隆DNA的测序寡核苷酸指导的诱变基于PCR的诱变 外源基因的表达 产生融合蛋白在哺乳动物细胞中表达噬菌体蛋白展示 基因分析与基因表达 鉴定和分析mRNA逆转录PCR原位基因分析转基因学和基因打靶 微型阵列与DNA芯片 整个基因组分析 基因组物理图谱基因的发现和定位人类基因组作图计划 2 1 3蛋白质组学与蛋白质工程 一 蛋白质组学1 蛋白质组 Proteome 是指基因组表达的全部蛋白质 2 蛋白质组学 Proteomics 是指以基因组所表达的全部蛋白质为研究对象的科学 3 蛋白质组学目标 细胞的生命状态会受许多因素的影响而发生改变 细胞内蛋白质在质或量上的变化是产生这种现象和重要原因 而目前不管是在基因组水平或是转录水平上得到的结果 都不足以对这种变化进行准确的描述 采用蛋白质组分析方法 不但可以确定在导致这种变化的过程中 究竟有哪些蛋白质在表达 其表达量如何 以及有没有翻译后修饰等特征 而且可以通过将同种生物的二种或多种不同状态的细胞 正常或病态 样品进行比较 来识别出那些在质或量上发生特异性改变的蛋白质 4 蛋白质组分析 蛋白质组分析的一个最大的问题 是如何实现复杂蛋白质样品处理时的高度重复性和稳定性 即样品处理过程不能使其组分发生质和量的改变 双向电泳 2 DPAGE 技术可以在一块凝胶上分辨出1800多个蛋白质点 能同时分析成百上千的基因表达产物 非常适于平行分析大量的蛋白质系 因此成为目前蛋白质组研究方法中解决上述难题的首要方法 将双向电泳后的凝胶图像结果成像后 借助专门的软件分析 得到的实验数据资料可以在各研究小组间进行进一步的编录和比较 具体分析及过程如下 见下图 二 蛋白质工程 1 蛋白质工程 proteinengineering 是指依据基因原理设计或改变已有蛋白质结构来构建新型蛋白质分子的过程 2 蛋白质改造原因 为了了解蛋白质是如何装配的 以及一级序列的哪些成分对于折叠 稳定 功能有作用 在一个蛋白质分子内定向改变一个或更多的特定氨基酸 观察改变后产物表型可确定其特性 自然界相关蛋白质有类似但不完全相同的序列 其性质会有所不同 这种差异序列可用来指导改造蛋白质 原则上 一蛋白质只适用于一个特定的技术目的 但天然状态分子可能不具备最优特性 改造后更能发挥其特性 如作为工业用酶 其温度稳定性 最适PH值 辅助因子往往需要通过更改氨基酸才能达到目的 蛋白质工程化需要了解蛋白质结构的原理 蛋白质作为材料的知识以及对它缺陷的正确评估 最后才能合理设计或改构 设计人员必须掌握生产 分析目的蛋白质的工具 3 工具 序列鉴定表达结构测定与建模分析序列修饰得到结构域 通过噬菌体显示过程来修饰 并筛选或选择获得新功能蛋白从头循环改变序列顺序 不影响总体折叠 序列检测结构可塑性设计构建小蛋白成功刚性与柔性骨架匹配设计 2 1 4糖组学与糖工程 一 糖组学 糖生物学 1 糖生物学 glycobiology 是指在以糖链为 生物信息分子 水平上阐明多细胞生物的高层次生命现象的一门科学 糖生物学形成背景 1990 11 3个研究小组 发现糖结合蛋白E P L 选择素 血管内皮细胞与白细胞粘附因子 识别功能 具体过程为 损伤 组织感染内皮细胞与白细胞粘附沿血管壁滚动渗出血管外 灭菌过多血细胞渗出 引起炎症 自身免疫疾病 发现寡糖SLeX SLea间的识别功能 肺癌细胞 大肠癌细胞表面有SLeX SLea 进入血液循环的癌细胞可借机渗出血管而实现转移 华裔科学家 王启辉 用3种糖基转移酶合成了SLeX当时 20亿美元 克 Ctyel公司在生产 10万美元 克 二 糖工程 或糖生物工程 1 糖工程 glycotechnology 是指研究糖生物学的方法论和基本技术 以及把基础研究获得的知识进一步转化为生产技术等 2 糖工程内容 发展糖医药的管理重组工具 表达系统 宿主和载体发展宿主细胞的糖基化工程发展糖蛋白生产系统发展生物工程工序 药理学和诊断学 2 1 5脂生物学 或脂组学 与脂工程 一 脂生物学 Adipobiology 1 脂生物学 Adipobiology 是指研究脂类分子和脂肪组织具有超出原意义基础上的作用和功能的学科 2 脂生物学新的研究方向和成果 脂肪酸作用的新认识 体内必需 花生四烯酸 前列腺素不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸 大