基因工程的基本操作程序2--公开课ppt课件.ppt

1 2 2 能否用SARS病毒作为基因载体 3 作为载体 若没有切割位点将怎样 4 携带目的基因的载体是否进入了受体细胞 如何鉴定 5 假如目的基因导入受体细胞后不能复制 将怎样 1 从化学组成来看 载体应含有什么成分 双链DNA 不能 目的基因不能插入 载体上应有标记基因 可能造成基因丢失 分子搬运工 载体 3 四环素抗性基因 氨苄青霉素抗性基因 人胰岛素基因 目的基因插入点 4 目的基因插入点 目的基因 人胰岛素基因 5 含有四环素的完全培养基 含有氨苄青霉素的完全培养基 死亡 死亡 存活 存活 死亡 存活 6 1 2基因工程的基本操作程序 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 7 1 从基因文库中获取 序列未知 2 利用PCR技术扩增 序列已知 基因文库 基因组文库 部分基因文库 如 cDNA文库 聚合酶链式反应 一 目的基因的获取 3 人工合成 基因比较小 序列已知 反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA 化学合成 9 依据 目的基因的有关信息 如 根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性 从基因文库中获取目的基因 10 利用PCR技术扩增目的基因 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 原理 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 11 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的核苷酸序列 目的基因 化学合成 推测 推测 人工合成法 基因较小 核苷酸序列已知 反转录法 化学合成法 12 二 基因表达载体的构建 核心 1 目的 A 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 B 同时使目的基因能表达和发挥作用 13 2 基因表达载体的组成 a 目的基因 b 启动子 c 终止子 d 标记基因 14 质粒 目的基因 限制酶 3 基因表达载体的构建过程 15 1 用 切割质粒 使其出现切口露出 2 用 切割目的基因 使其产生 3 将目的基因插入质粒的 处 加入 形成了一个重组DNA分子 限制酶 黏性末端 同种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 16 三 将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 稳定 表达 受体细胞 17 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2 处理法 18 1 将目的基因导入植物细胞 1 农杆菌转化法 特点 a 能感染双子叶植物和祼子植物 对单子叶植物无感染能力 b Ti质粒的T DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 19 外源基因 20 2 基因枪法 特点 成本高 适用于单子叶植物 21 3 花粉通道法 我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得 22 2 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 程序 目的基因表达载体提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵新性状动物 23 3 将目的基因导入微生物细胞 1 方法 Ca2 处理法 增加细胞膜通透性 2 微生物作受体细胞原因 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 3 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 24 四 目的基因的检测与鉴定 检测 分子水平 是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定 个体生物学水平鉴定 25 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 A方法 DNA分子杂交 B过程 1 检测 26 基因探针通过分子杂交与目的基因结合 产生杂交带 能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来 27 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 方法 分子杂交法 过程 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 若出现杂交带 表明目的基因转录出了mRNA 28 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原 抗体杂交 29 提取 方法 抗原 抗体杂交 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 30 2 鉴定 个体生物学水平 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 31 目的基因的表达和检测 抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等 抗原 抗体杂交法 DNA RNA分子杂交法 DNA分子杂交法 32 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子 终止子 基因的结构 启动子 原核 真核 33 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质 原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗 连续 不连续 编码区 非编码 34 编码区 非编码区 非编码区 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码系列 即不含非编码区和内含子 35 模板DNA 36 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 37 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 38 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 39 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 40 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq 41 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 42 过程 a 变性 90 95 双链DNA在受热下 断裂 形成 b 复性 55 65 温度降低 引物与单链DNA结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 43 方式 以 方式扩增 即 条件 前提条件 结果 指数 2n 短时间内大量扩增目的基因 已知基因的核苷酸序列 44 PCR技术扩增与DNA复制的比较 高温 解旋酶 体外复制 主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 45 3 人工合成法 在基因较小 核苷酸序列已知的情况下 可以利用DNA合成仪人工合成 化学合成法 反转录法 46 蛋白质 mRNA DNA DNA 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 47 生物某个发育时期的mRNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组DNA 与载体连接 cDNA文库 反转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 cDNA文库的构建 逆转录法 48 目的基因所在片段 CTTAA G CTTAA G CTTAA CTTAA G G PSt 运载体的特点3 有标记基因 49 导入 接种培养 接种培养 接种培养 接种培养 含有四环素的完全培养基 完全培养基 大肠杆菌不含抗四环素基因 证明 不存活 含有四环素的完全培养基 证明 大肠杆菌含抗四环素基因 证明 大肠杆菌的受体细胞含有目的基因 四环素抗性基因 四环素抗性基因 完全培养基 存活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来 50 导入 接种培养 接种培养 接种培养 接种培养 含有四环素的完全培养基 完全培养基 大肠杆菌不含抗四环素基因 证明 不存活 含有四环素的完全培养基 证明 大肠杆菌含抗四环素基因 证明 大肠杆菌的受体细胞含有目的基因 四环素抗性基因 四环素抗性基因 完全培养基 存活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来 51 基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下 获得所需的目的基因 52 某种生物的全部DNA 限制酶 DNA片段 DNA片段与载体连接 重组DNA 基因组文库 导入受体菌中储存 基因组文库的构建 53 导入 接种培养 含有四环素的完全培养基 死亡 如何把导入了目的基因的受体细胞筛