（植物学专业论文）水稻和拟南芥中类三磷酸肌醇受体蛋白的免疫学证据.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取徭的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意 研究生虢眇需 日垌 年拥嘶 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描 等复制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 彤够彳 时间 巧年g 月溯 导师签名 南墨鹚 l r 时间 彻中年6 月诊扫 l j 圆农业人学顿l 学位论文 中文摘要 二磷酸肌醇 i p c 矿信号传导通路在信号传导过程中起着t t 1 泛的作j j 在哺乳动物 中 已知三磷酸肌醇通过三磷酸肌醇受体 1 p 3 r 起作用 细胞膜上的g 蛋白耦连的受体接受 外界的刺激 激活磷骺酶c p l c 的活性 从而使肌醇4 5 一二磷酸 p i p z 水解产生二脂酰甘油 d g 和三磷酸肌醇 三磷酸肌醇释放到细胞质中 乖i 磷酸肌醇受体相互作用促使钙离子从胞 内钙库 包括内质网 肌质网 的释放 胞内游离的钙离子和钙调素 c a m 结合 激活下游的靶蛋 白 从而导致细胞产生一系列的生理反应 主要包括分泌 细胞生长 肌肉收缩 感觉和神经信 号传导 转录因子的表达 卵激活后受精膜的形成等许多重要的生理过程 到目前为止 在高等植物中 虽然已广泛证明三磷酸肌醇信号参与细胞的信号传导过程 但 是否存在类似动物的三磷酸肌醇受体报道很少 本实验用s d s p a g e 电泳和免疫印迹的方法 用 哺乳动物大鼠三磷酸肌醇受体的多肽做抗体对类三磷酸肌醇受体蛋白鉴定 结果表明 抗体与水 稻和拟南芥微粒体蛋白分子量大约为2 0 0 k d 的蛋白交叉反应 同时还发现在水稻微粒体蛋白6 2 k d 和拟南芥微粒体蛋白4 5 k d 处有交叉反应的蛋白条带存在 表明在植物中有类三磷酸肌醇受体蛋白 的存在 用免疫胶体金方法 发现类三磷酸肌醇受体蛋白主要分布于液泡膜和细胞质膜上 为了确定类三磷酸肌醇受体蛋白是否具有生物学功能 我们用表皮条分析技术 研究了甲 基紫精 刺激三磷酸肌醇产生 和肝素 动物三磷酸肌醇受体的特异竞争性抑制剂 对气j l 运动 的调节作用 拟南芥表皮条用甲基紫精处理 可以引起气孔的关闭 当处理9 0 分钟的时候 气 孔的相对开度由1 0 0 降到5 8 统计学分析气孔开度的变化有显著差异 甲基紫精引起气孔关闭 的作用可以被肝素部分抑制 当甲基紫精和肝素同时处理9 0 分钟静时候 气孔的相对开度由1 0 0 降到9 2 统计学分析气孔开度的变化没有显著差异 说明气孔的相对开度基本上没有变化 表 明了植物中存在的类三磷酸肌醇受体蛋白可能介导了三磷酸肌醇信号对气孔保卫细胞运动的调 节作用 以上所有的结果显示 植物细胞中可能存在着类三磷酸肌醇受体蛋白 并且参与磷脂酰肌醇 系统信号传导通路 关键词 免疫学证据甲基紫精气孔三磷酸肌醇三磷酸肌醇受体微粒体 a b s t r a c t l n o s i t o l l 4 5 t r i p h o p h a t e i e 3 一c a s i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y p l a y s a v e r y i m p o r t a n tr o l ei na n i m a lc e l l s i p 3 一i p 3r e c e p t o r i p 3 r i n t e r a c t i o nm e d i a t e st h er e l e a s eo f c 一 f r o mt h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u mi nr e s p o n s et om a n yd i f f e r e n te x t r a c e l l u l a rs t i m u l u s f o rh i g h e rp l a n t s h o w e v e r t h o u g hi ti sn o w g e n e r a l l ya c c e p t e dt h a ti p 3p a r t i c i p a t e s i ns i g n a lt r a n s d u c t i o ni nm a n yi m p o r t a n tc e l l u l a rp r o c e s s e s o n l yl i m i t e de v i d e n c ei s a v a i l a b l ef o rt h ep r e s e n c ea n dp r o p e r t i e so ft h ei p s r l i k ep r o t e i ns of a r h e r e u s i n gt h e i m m u n o l o g i c a lm e t h o d sw i t ha na n t i b o d yr a i s e da g a i n s tam a m m a l i a ni n o s i t o l1 4 5 t r i p h o p h a t er e c e p t o r t y p e1 w ef o u n dt h a t 1 t h ea n t i b o d ya c r o s s r e a c t e dt h ep r o t e i n s i t l la b o u t2 0 0 k di nm i c r o s o m e sf r o mo r y z as a t i v aa n da b o u t2 0 0 k df r o m a r a b i d o p s i s t h a l i a n ar e s p e c t i v e l y a d d i t i o n a l l y p r o t e i nb a n d sw e r ef o u n di nt h er a n g eo f6 2k di n m i c r o s o m e sf r o mo r y z as a t i v aa n d4 5k df r o m a r a b i d o p s i st h a l i a n a 2 t h ei p 3 r l i k e p r o t e i nw a sn m i n l yl o c a l i z e di nt h ev a c u o l a rm e m b r a n e t o n o p l a s t a n dp l a s m am e m b r a n e i nt h el e a f a n dr o o tt i po f a r a b i d o p s i st h a l i a n a f o rc o n f m n i n gt h e b i o l o g i e a l r o l eo ft h ei p 3 r l i k ep r o t e i n w e i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t so f m e t h y lv i o l o g e n s t i m u l a t i n gi p 3p r o d u c e a n dh e p a r i n ac o m p e t i t i v ei n h i b i t o r o fi n o s i t o l 1 4 5 t r i p h o p h a t e i n a n i m a l o ns t o m a t a lm o v e m e n tb ye p i d e r m a ls t r i p b i o a s s a y w h e nt h ee p i d e r m a ls t r i p so fa r a b i d o p s i st h a l i a n aw e r et r e a t e dw i t hm e t h y l v i o l o g e n i ts t i m u l a t e st h es t o m a t a lc l o s u r e b u tt h ee f f e c t sa r ei n h i b i t e dp a r t i a l l y b y h e p u r i n i ts h o w e dt h a tt h ei p s r l i k ep r o t e i ni np l a n tm a ym e d i a t ei p ss i g n a lt or e g u l a t e t h es t o m a t a l g u a r d c e l lm o v e m e n t a l la b o v er e s u l t s s u g g e s t t h a tt h ep l a n ti p 3 r l i k ep r o t e i n m a y o c c u ri np l a n tc e l l sa n d p a r t i c i p a t e i nt h e p h o s o h o i n o s i t i d es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y k e y w o r d s i m m u n o l o g i c a le v i d e n c e m e t h y l v i o l o g e n s t o m a t a i n o s i t o l 1 4 5 t r i p h o p b a t e 0 p 3 i n o s i t o l1 4 5 t r i p h o p h a t er e c e p t o r i p 3 r m i c r o s o m e s 2 中国农业人学硕士论文 缩写表英文名称 p i p e s f i t c p b s b s a f a g e s d s n c b c i p a p d r r m e s p m s f v c p v p 英文缩写表 p i p e r a z i n e n n b i s 2 m o r p h o l i n o f l u o r e s c e i ni s o t h i o e y a n a t e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n b o v i n es e l u n la l b u m i n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s o d i u m d o d e y ls u l f a t e n i t r o c e l l u l o s e 5 b r o m o 4 c h l o r o 一3 i n k o l y lp h o s p h a t e a l k a l i n ep h o s p h a t e d i t h i o e r y t h r e i t o l 2 f n m o r p h o l i n o e t h a n e s u l f o n i ca c i d p h e n y l m e t h y l s u l f o n y b f l u o r i d e a s c o r b i ca c i d v i t a m i nc 1 p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 3 中固扯业人学坝i 学位论文 鞲 章文献练述 第一章文献综述 生活的细胞使州信号传导途径去指导发育过样 获得营养 控制代谢以及适应环境 s a n d e r s e ta l 1 9 9 9 钙是许多细胞生理作州的原始的渊控冈子 住许多的信号传导通路中足个关键点 从1 9 世纪 当英国生理学家s y d n e yr i n g e r 发现钙离子能够刺激心肌的收缩 它f 1 为胞问信使 的作川就已经被发现 r i n g e r 1 9 8 3 c a 2 十可以从胞内c a 库释放或者是胞外c 一 内流产生 在 许多细胞类型中 主要的胞内钙库是内质网 肌质网或者液泡 胞内c 2 释放有两条主要的途径 其中三磷酸肌醇和三磷酸肌醇受体 i p r 相互作用释放c i 是胞内钙库释放钙离子的一条重要 的途径 三磷酸肌醇是通过产生胞内钙信号调控许多细胞过程的第二信使 它通过受体来操纵 这个胞内钙通道家族促使诱导钙释放的过程 产生钙波和钙振荡的复杂的时空模式 调控了许多 细胞过程 主要包括分泌 细胞生长 肌肉收缩 感觉和神经信号传导 b e r r i d g e 1 9 9 3 转录 因子的表达 n e g u l e s e ue ta l 1 9 9 4 卵激活后受精膜的形成 n u c c i t e l l ie ta l 1 9 9 3 等 1 磷酸肌醇信号传导通路 许多细胞表面受体通过与激素 神经递质 生长因子等结合 导致磷脂酶c p l c 的激活 从而使肌醇4 5 二磷酸 p i p z 水解产生二脂酰甘油 d g 和三磷酸肌醇 i p a 二脂酰甘油和细 胞质膜结合激活蛋白激酶c 蛋白激酶c 磷酸化下游靶蛋白的苏氨酸和丝氨酸残基 从而启动下 游的信号传导 在细胞的生长和分化 细胞的代谢和转录激活中有重要的作用 n i s h i z u k a 1 9 8 8 三磷酸肌醇的产生有二种方式 一种是通过g 一蛋白耦连的受体起作用 另一种是直接或间接地和 酪氨酸激酶相互作用 i r v i n e 1 9 9 0 三磷酸肌醇释放到细胞质中 与三磷酸肌醇受体相互作用 促使钙离子从胞内钙库 包括内质网 肌质网 释放 t a y l o r a n d r i c h a r d s o n 1 9 9 1 p u t n e va n d b i r d 1 9 9 3 a 及胞外钙离子内流 而后钙离子和钙调素 c a m 结合 激活下游的靶蛋白 从而导致细胞产 生一系列的反应 p u t n e y e t a l 1 9 9 0 b b e r r i d g e 1 9 9 5 b 如分泌 细胞生长 肌肉收缩 感觉和神 经信号传导等 图1 4 图1 肌醇信号传导通路 磷脂酰肌酵 p i 被磷酸化为肌醇4 5 一二磷酸 p i p z 在激活的磷脂酶c p l c 的作用下 水解产生二脂 酰甘油和三磷酸肌醇 脂酰甘油 0 g 激活蛋白激酶c 蛋白激酶c 磷酸化下游靶蛋白的苏氨酸和丝氨酸 残基 从而启动下游的信号传导 三磷酸肌醇和三磷酸肌醇受体相互作用促使钙离子从胞内钙库 包括内质 网 肌质网 的释放 激活下游的靶蛋白 从而导致细胞产生一系列的反应 瞿礼嘉等译植物生化与分子生 物学科学m 版社 三磷酸肌醇可以被c a m p 依赖的蛋白激酶a 蛋白激酶c 和c f e a l m o d u l i n d e p e n d e n t 的蛋 白激酶i i c a mk i n a s e i i 磷酸化为ip i p 5 i p f e n i se ta l 1 9 9 1 i n 有助于钙离子从 胞外或其他的胞内钙库进入三磷酸肌醇介导的钙库 i p 5 i r 可能作为神经递质的成分 v a l l e j o 1 9 8 7 2 动物三磷酸肌醇受体的研究进展 2 1 三磷酸肌醇受体简述 三磷酸肌醇受体从第一次被报道至今已经二十多年过去了 s 劬c t a l 1 9 8 3 在哺乳动物中 b e r r i d g e 1 9 9 3 已经发现了受体是如何产生并且是如何代谢的 三磷酸肌醇受体也已经被克隆 并开始研究与三磷酸肌醇的相互作用启动钙信号的关系 如图2 一1 5 继跑鼹l 4 5 一三磷 酸辫l 豁 图2 1 三磷酸肌醇受体释放c a z 的模式图 三磷酸肌醇受体位于内质网 通过构蒙改变传递信号 瞿礼嘉等译植物生化与分子生物学 科学出版社 2 2 三磷酸肌醇受体的细胞和亚细胞定位 2 2 1 三磷酸肌醇受体定位于内质网 三磷酸肌醇受体第一次被定位和详细的被描述主要是通过放射自显影技术 在哺乳动物的脑 中 三磷酸肌醇受体主要分布于小脑皮层 并且和蒲肯野氏细胞广泛的结合 w o r d l ye l a i 1 9 8 9 更详细的定位主要是通过免疫组化的技术 用纯化的三磷酸肌醇受体的抗体来定位 这些免疫组 化的结果和通过放射自显影技术以及原位杂交所得到的结果是相一致的 r o s se ta 1 1 9 8 9 三磷 酸肌醇受体不仅在小脑的蒲肯野氏细胞内质网中有丰富的表达 而且在其他的组织中也有三磷酸 肌醇受体的存在 如 肝 心 平滑肌 胸腺 脊髓等 s t r be ta 1 1 9 8 3 在电镜水平 免疫组化技术已经澄清了三磷酸肌醇调节的c a 2 释放的亚细胞定位 表明了 三磷酸肌醇受体主要分布在内质网膜上 m i g n e r ye ta l 1 9 8 9 a a t o he ta l 1 9 9 0 而且粗面内质 6 中用农业人学硬 学位论文 第一章义献综述 网膜和滑而内质网膜都有三磷酸肌醇受体的存在 2 2 2 三磷酸肌醇受体定位于核膜 在i u 镜水平 蒲占野氏神经元的研究也表明了三磷酸肌醇受体在山质网膜上靠近核膜的地方 或者在核膜本身 r o s se ta l 1 9 8 9 a m a ke ta l 1 9 9 4 a 利川膜片钳技术从分离的爪蟾卵母细胞的 外层核膜有三磷酸肌醇受体的存在 因为膜片钳的电极很难接触到内膜 所以三磷酸肌醇受体单 通道原位研究还没有做 由于1 i j 质网是和细胞的外层核膜连接的 d i n g w a l la n dl a s k e y 1 9 9 2 可以推断三磷酸肌醇受体定位于内质网膜上的离子通道也有可能位于细胞核的外层核膜 2 3 三磷酸肌醇受体的跨膜拓扑学结构和三维结构 2 3 1 三磷酸肌醇受体的跨膜拓扑学结构 三磷酸肌醇受体是一个高分子量的糖蛋白 有单体 二聚体 三聚体和四聚体 有功能的三 磷酸肌醇受体是由四个相似的单链亚基非共价铰链组成 每个亚基有2 7 0 0 个左右的氨基酸 分 子量是3 2 0 k d 二聚体分子量是6 5 0 k d 三聚体分子量1 0 0 0 k d 四聚体分子量1 2 5k d m a e d ae ta 1 1 9 9 1 三磷酸肌醇受体有三个结构区 三磷酸肌醇的结合区 调控区和离子通道区 即在c 一末端有 一个短的胞质尾巴和一个大的在c 末端带有p 一环和6 个疏水序列的跨膜螺旋 把蛋白锚定在膜 上 四个亚基结合形成有功能的三磷酸肌醇敏感的钙通道 p a u l ae ta l 2 0 0 3 在n 末端游离于胞 质中有一个3 0 0 至4 0 0 的氨基酸序列 这个序列对于配体的结合是非常必要的 m i g n e r ye ta l 1 9 8 9 b 并且在琉水区和匹配区之间有重要的磷酸化调控位点 a t p 结合位点和可变拼结位点 在 疏水区和匹配区中 已知的可变拼接位点被掩盖 现在 公认的配体 i p 3 和a t p 结合位点在 n 一末端 三磷酸肌醇的结合位点在2 2 6 和5 7 6 氨基酸处 y o s h i k a w ae ta l 1 9 9 9 而且通过三磷酸 肌酵受体各种切除截短实验 表明三磷酸肌醇受体的第四个多肽对于配体的结合是必要的 这个 多肽是可溶的 暗示配体的结合发生并不需要跨膜区或者受体蛋白四聚体的存在 m i n e r e ta 1 1 9 9 0 c 同时三磷酸肌醇受体的s c a t c h a r dp l o t 分析也表明了有三磷酸肌醇的高亲和性的结合 位点 m a e d ae ta l 1 9 9 0 需要强调的是受体的其他区域决定配体的亲和性和特异性 并且这个 己知的位点可以被蛋白酶a 磷酸化 三磷酸肌醇的结合诱使受体构象的变化 可能与通道开放和 匹配过程相关 如图2 2 7 图2 2 三磷酸肌醇受体氨基酸序列 a 和三磷酸肌醇受体的分布图 b 三磷酸肌醇受体有2 7 5 0 个左右的氮基陵 圈中 f 同的颜色代表三磷酸肌醇受体结构n 细胞中小酬的分 布 粉红色代表胞质区 包括三磷酸肌醇的结合位点 暗红色 离子通道区 蓝色 包括跨膜区 深 蓝色 以及船质区 灰色 f i n s e e ae ta l 2 g 0 3 2 3 2 三磷酸肌醇受体三维结构 三磷酸肌醇受体三维结构有大约1 8 x1 8 x1 8 n m 象花一样的外观 如图a 它组成了一个火 的区域 代表了花的花柱和花瓣 粉红色代表了花柱 灰色代表了花瓣 和一个小的茎区域 蓝 色 如图b 与三磷酸肌醇受体的氨基酸序列结合起来考虑 大的花柱和花瓣区和小的茎区分 别代表了离子通道和胞质区 如图c 从内质网的内腔看 离子通道有一个1 2 6 n m 的正方形 7 n r a 深的轮廓 在这个低密度的中心区 有一个2 5 n m 宽是四倍体对称轴通过的区域 如图a 扶胞质区看 胞质区是一个1 8 n m 宽和l l n m 深的区域 图b 粉红色和灰色 它有四个象花瓣样 亚区组成 灰色 胞质区也包括了临近对称轴代表了花柱的亚区 粉红色 p a u l a e la l 2 0 0 3 s e r y s h e v a e la 1 2 0 0 3 图2 3 三磷酸肌醇受体三维结构 8 a 是从内质嘲内层的四倍体对称轴的方向看三磷酸肌孵受体的三维结构 b 是胞质面的叫倍体对称轴的方向 看三磷酸肌醇受体的三维结构 c 足正直膜的方向看三磷陵儿儿醇受体的二维结构 d 足c 的切 酗 把胞赝 选t 电柱l 显和花瓣去分开 t 3 if i n s c c ae ta 1 2 0 0 3 a 2 3 3 三磷酸肌醇受体结构的比较 以前通过电子显微镜研究 报道了有各种各样的三磷酸肌醇受体的结构 c h a d w i c k 等 1 9 9 0 描述了风车样的结构 是一个2 5 2 5 a m 四倍体对称的结构 k a t a y a m a 等 1 9 9 6 在冰冻蚀刻的蒲 肯野氏细胞的神经原中描述了2 维格子状的结构 1 4 1 6 n m 2 4 三磷酸肌醇受体受体的分予克隆和表达 m i k o s h i b 和同事 1 9 8 9 克隆了编码小鼠小脑的三磷酸肌醇受体的c d n a 1 9 9 8 年 n o r d q u i s t 等克隆并测序了蒲肯野氏细胞特异蛋白部分的c d n a 随后应用通过n o r d q u i s t 等 1 9 9 8 描述的 从预测的氨基酸序列合成的多肽的抗体 m i g n e r y 等 1 9 9 0 分析该蒲肯野氏细胞特异蛋白即是 三磷酸肌醇受体 随后 他们应用这种信息进行了分子克隆大鼠小脑三磷酸肌醇受体 m i g l l e r ye t a l 1 9 9 0 这个三磷酸肌醇受体超过2 7 0 0 个氨基酸 是迄今为止已被克隆和袭达的最大的蛋白质 之一 并且它有很大的保守性 在大鼠和小鼠中只有不到1 的氨基酸不同 而有超过9 0 的氨基 酸在大鼠 小鼠和人中是保守的 通过比较老鼠和果蝇i p 受体的蛋白序列发现在整个序列中二者 有很大的同源性 7 5 的同源性和5 7 的一致性 三磷酸肌醇受体序列在不同物种中的相似性表 明了他们是由单个基因编码的 结构上的变化主要是由进化上环境适应而造成的 三磷酸肌醇受体家族被鉴定主要有三种 i 型 i i 型和i i i 型 i 型和i i 型大约7 0 同源 i 型 和i i i 型大约6 4 同源 b l o n d e le t a l 1 9 9 3 s u d h o f e t a l1 9 9 1 三种受体可能是三磷酸肌醇受体m r n a 的可变拼接而造成的 r o s se ta l 1 9 9 2 s u o n o te ta l 1 9 9 1 b 三种三磷酸肌醇受体的表达 以及表达量有细胞特异性 例如 小脑蒲肯野氏细胞广泛的表达i 型三磷酸肌醇受体 胰腺腺泡 细胞表达i i 和i i i 型三磷酸肌醇受体 而几种上皮细胞三种类型的三磷酸肌醇受体都表达饵u s h e t a l 1 9 9 4 n a t h a n s o ne ta l 1 9 9 4 w o j e i k i e w i c z 1 9 9 5 三磷酸肌醇受体家族的表达同时表现出组织 特异性 而且在发育上被调控 d es m e d t 1 9 9 4 a1 9 9 7 b n a k a g a w ae ta l 1 9 9 1 r o s se ta 1 1 9 9 2 但在细胞类型中不同异型体的结合形成异源四聚体 可以表达多样异形体 j o s e p h e t a l 1 9 9 5 m o n k a w a e ta l1 9 9 5 这些有功能的异形体的表达的多样性调控了钙离子的释放 n e w t o n e ta l 1 9 9 4 w o j e i k i e w i c ze t a l 1 9 9 5 虽然三种三磷酸肌醇受体序列有很大的相似形 但是它们 的异形体对于三磷酸肌醇有不同亲和力 亲和力的相对顺序是i i 型 i 型 i i i 型三磷酸肌醇受体 m a r a n t o 1 9 9 4 i i 型三磷酸肌醇受体对于三磷酸肌醇结合的亲和力是i 型三磷酸肌醇受体的2 3 9 倍 s u d h o fe ta l 1 9 9 1 i 硝和i i 州二磷酸肌醇受体对丁三磷酸肌醇的相对亲和 力主要是由 r 二磷酸肌醇受4 本货r 1 调控区的结孛勾决定的 2 5 三磷酸肌酵受体和其他的四聚体离子通道的比较 r y a n o d i n e 受体 r y r 起源j 植物的生物碱 与通道蛋闩结合引起胞内c a 从肌肉细胞州 质网释放 所以与三磷酸肌醇受体一样也是一个胞内c a 的通道 二者在功能上相似 f l e i s c h e r e ta 1 1 9 8 9 两个蛋白都可以结合a t p 和钙调素 释放钙离子秆i 钠离子 电子显微镜实验结果显 示二者在大分子结构上也是相似的 都是同源四聚体 四倍体对称 超微结构显示三磷酸肌醇受 体有可移动的臂 而r y a n o d i n e 受体在结构上更稳定 尽管r y a n o d i n e 受体有5 0 0 0 个氨基酸 残基 三磷酸肌醇受体有2 7 5 0 个左右氨基酸残基 分子量是三磷酸肌醇受体的二倍 但是三磷 酸肌醇受体和r y a n o d i n e 受体在氨基酸序列上部分同源 在形成离子通道的跨膜区部分相似 r y a n o d i n e 受体家族通过c y r o e m 和单颗粒图象分析技术 在2 3 r i m 的分辨率的 肯况下 i 型 i i 型和i i i 型的三维结构也已经被鉴定 s a m s oe ta l 1 9 9 8 另一方面 在两个通道的匹配机 制上二者也有明显的不同 r y a n o d i n e 并不能引起三磷酸肌醇受体通道的活性 与r y a n o d i n e 受 体不同的是 磷酸肌醇受体的单通道的对于铺离子传导性是小于钙离子的 l a ie ta l 1 9 8 8 a n d e r s o ne ta 1 1 9 8 9 s h a k e r 是电压配体k 离子通道 与三磷酸肌醇受体一样 有p 一环和6 个疏水序列的跨膜螺 旋 它的三维结构已被通过分辨率2 5 n m 的负染色的电子显徽镜的单颗粒分析鉴定 s o k 0 1 0 v ae t a l 2 0 0 1 并且被作成卡通图片 图c 与三磷酸肌醇受体的离子通道区一样 有一个正方形的 轮廓 当从四倍体对称勒看 尽管看起来有点象箭头 不同之处是s h a k e r 正方形是l o 而三 磷酸肌醇受体正方形是1 2 6m 离子通道区和胞质区通过4 对细长的臂连接起来 m t h k 是一种原核c a 配p f lk 离子通道 图d 离子通道区有两个跨膜螺旋和一个p 环 j i a i l g e ta l 2 0 0 2 a 以上四种不同四聚体离子通道 它们胞质区和离子通道区之间的连接可能是相似的 当被调 控或者配体结合在胞质区的时候 离子通道区构象发生变化 通道被打开 j i a n ge ta 1 2 0 0 2b 离子被释放 从而引起细胞的生理反应 1 0 a 邮 b 种c 蕊篙 o 燃 图2 4 三磷酸肌醇受体三雏结构 上 从内质罔内层的方向看一下 从垂直于膜的方向看 与其他的四聚体离子通道的三维结构的比较 a 是i 型r y a n o d i n e 受体通道的卡通圈 b 是三磷酸肌醇受体通道三维 结构 c 是s h a k e r 通道的卡通圈 d 是m t h k 通道卡通图 引f i n s e c ae ta l 2 0 0 3 2 6 三磷酸肌醇受体的调控 通过三磷酸肌醇受体通道的c a 2 的释放可以被各种各样的因子和细胞过程所调控 包括三磷 酸肌醇受体磷酸化 胞内游离c a 2 a t p 和胞内p h 等因素 f c r r i s c ta l 1 9 9 1 a b f i n c he ta l 1 9 9 1 i i n o 1 9 9 0 m i s s i a e ne ta l 1 9 9 2 s u p a t t a p o n ee ta l 1 9 8 8 2 6 1 磷酸化调控 纯化的三磷酸肌醇受体可咀被依赖c a m p 的蛋白激酶a p k a 磷酸化 f e r r i se ta l 1 9 9 1 a 一 种纯化的蒲肯野氏细胞特异的磷脂蛋白 p c p p 一2 6 0 已被鉴定和三磷酸肌醇受体是一样的 w e e k s e ta l 1 9 8 9 蛋白激酶c p k c 和c 2 钙调素依赖的蛋白激酶 c a mk i n a s ei i 也可以特异 的磷酸化三磷酸肌醇受体 f c r r i se t a l 1 9 9 1 a 这三种蛋白激酶的磷酸化作用是一分子的磷酸结合 三磷酸肌醇受体的一个亚基 而且磷酸化的作用位点是不一样的 尽管都是丝氨酸被磷酸化 在 适合的条件下 蛋白激酶a 磷酸化兰磷酸肌醇受体的两个丝氨酸残基 第1 5 8 9 和1 7 5 5 位的氨 基酸残基 在小脑皮层三磷酸肌醇受体的1 7 5 5 位丝氨酸残基可以被低浓度的蛋白激酶a 磷酸化 随后 第1 5 8 9 丝氨酸残基被磷酸化需要高浓度的虽白激酶a f e r r i se ta l 1 9 9 1 b 三磷酸肌醇受体的磷酸化作用可能在很重要的方式上调控它的功能 蛋白激酶a 的在小脑皮 层膜上的磷酸化 可能导致了三磷酸肌酵受体释放c f 能力的破坏 s u p a t l a p o n e e ta 1 1 9 8 8 在 肝细胞中的实验表明了依赖c a m p 的激素可以增加对于三磷酸肌醇作用钙库的敏感性 b u r g e s se t a l 1 9 9 1 这种作用可以通过蛋白激酶a p k a 磷酸化三磷酸肌醇受体调控 这样 三磷酸肌 醇受体磷酸化在提供了c a m p 和磷脂酰双信使系统的c r o s s t a l k 的方式 而在磷脂酰信号通路中 中国农业人学硕 l 学位论文 第一章文献综述 蛋白激酶c p k c 和c 矛 钙调素依赖的蛋白激酶 c a mk i n a s ei i 磷酸化三磷酸肌醇受体提 供了反馈抑制的方式 由丁 信号分子的刺激 磷脂酰肌醇产q 三一二脂酰甘油和二磷酸肌醇 二脂酰 干t 油和细胞质麒结合激活蛋白激酶c 货向激酶c 磷酸y l t 磷酸肌醇受体丝氨酸残基 而三磷酸 肌醇作用释放胞内c 一 饩接激活了c a mk i n a s e1 1 提供了 另 个二磷酸肌阵受体丝氨酸残基反 馈抑制的磷酸化 忙常有意思的是 免瘦组1 t 表明了在小脑皮层的蒲肯野氏细胞中 有c a m k i n a s e i i 存在的地方 二磷酸肌醇受体也 i f 常多 o u i m e t e ta i 1 9 8 4 w a l a a se ta l 1 9 8 8 f u k u n a g a e t a 1 1 9 8 8 近米的研究表明 体内平滑肌中i 型三磷酸肌醇受体可以被依赖c g m p 的蛋白激酶 p k g 选 择性的磷酸化 在胃的平滑肌中表达p k g fq 和p k g ib 一种c g m p 激酶亚基 使依赖c g m p 的 蛋白激酶结合到三磷酸肌醇受体的蛋白 i 型三磷酸肌醇受体和i i i 型三磷酸肌醇受体也被表达 但是在体外只有i 型三磷酸肌醇受体被p k a 和p k g 磷酸化 在体内i 型三磷酸肌醇受体被p k g 磷 酸化 p k g 磷酸化的位点和p k a 磷酸化位点一样 都是在三磷酸肌醇受体i 型的两个丝氨酸残基 第1 5 8 9 和1 7 5 5 位的氨基酸残基 这种磷酸化作用抑n t 依赖三磷酸肌醇的钙离子从胞内钙库 的释放 m u n h ya n d z h o u 2 0 0 3 2 6 2a t p 的调控 s m i t h 等 1 9 8 5 和s u e m a t s u 等 1 9 8 5 就已经报道了在平滑肌肉细胞中a 1 p 可以刺激三磷 酸肌醇诱导的钙离子的释放 随后发现 三磷酸肌醇受体在n 末端的三磷酸肌醇结合位点和c 末端的离子通道区之间的凋控区除了磷酸化作用位点之外 确实还有a t p 结合位点 m i k o s h i b a 1 9 9 3 核苷酸结合位点的保守序列 g l y x g l y x x g l y 位于小鼠小脑皮层三磷酸肌醇受体n 末端的胞质区t 氮基酸序列位于2 0 1 6 2 0 2 1 腺苷酸的结合是有选择性的并且是有顺序的 h t p a d p a m p a t p 的结合可以通过变构调控提高三磷酸肌醇受体和配体的结合力 b e z p r o z v a n n ya n d e h r l i c h 1 9 9 3 m a ke ta l 1 9 9 9 但是h t p 本身并不能开放三磷酸肌醇受体这个离子通道 虽然三 磷酸肌醇檄活三磷酸肌醇受体是同 型特异性的 但是a t p 的调控对于三种周工型是相似的 a t p 的刺激作用是浓度依赖性的 低浓度a t p 6 n t 降低离子通道的活性 在三磷酸肌醇存在的条件下a t p 变构调控三磷酸肌酵受体的活性 有利于调节细胞内c a 信号 h a g a ra n de h r l i c h 2 0 0 1 因为三磷酸肌醇受体有a t p 的结合位点 它可以被认为可能是c 矛 钙调索依赖的a t p 酶 一 种蛋白激酶或者是三磷酸肌醇激酶 但是 到目前为止 在c a 2 一存在或者不存在的情况下 这些 酶的活性没有 种被检测出来 1 2 2 6 3r a c k l 的调控 r a c k i 要通过蛋白结合实验 结合磷酸化的 激活的蛋白激酶c p k c 而被发现的 r o n e ta l1 9 9 4 r a c k l 并不是g 蛋白 但是与异源三聚体g 蛋向gp 弧基批常相似 5 0 的氨基 酸序列是吲源的 分f 鼙人约是3 6 k d 主要是起骨架蛋白的作 i i 把激活的蛋自激酶c p k c 和其他蜇向联系起米 b i r i k h c ta l 2 0 0 3 c e c ie ta l 2 0 0 3 r a c k i 可以和二磷酸肌醇受体结合 通过提高三磷酸肌醇和二 磷酸肌醇受体结合的亲和力 提高了胞内c 一 离子的浓度 但是 如果r a c k i 过表达或者通过r n a 干涉的r a c k l 的表达 量减少 会影响胞内c a 21 离子的浓度的增加或减少 p a t t e r s o ne ta l 2 0 0 4 因此 r a c k l 可以调控通过g 蛋白耦连的受体米调控细胞内的c a 2 离子浓度 2 6 4 其它 j 除了三磷酸肌醇受体磷酸化 a l p 和r a c k l 的调控之外 c a 2 胞内p h 以及在三磷酸肌 醇受体调控区上其他蛋白结合的调控在c a 2 离子的释放上起着非常重要的作用 2 7 三磷酸肌醇受体研究的最新进展 目前研究主要集中在三磷酸肌醇受体的功能分析上及信号通路上下游的调控上 包括在逆境 条件下各个因素的相互作用和相互影响 2 7 1 三磷酸肌醇受体和t r p t r a n s i e n tr e c e p t o rp o t e n t i a l t r p 在果蝇中有7 个t r p 的同系物 t r p l w p 2 t r p 3 仃p 4 t r p 5 t r p 6 t r p 7 是胞外c 2 流入 的通道成分 是被三磷酸肌醇受体和钙库衰竭所激活 这个通道直接被三磷酸肌醇受体所调控 b o u l a ye t a l 1 9 9 9 1 9 9 8 年 k i s e l y o u 等在h e k 2 9 3 细胞中获得了i n 受体和t r p 相互作用的 直接证据 结合区主要位于三磷酸肌酵受体的n 一末端和t r p 的c 一末端 在t r p 的c 末端有钙调 素的结合位点 它和i p 3 受体重叠 进而可以抑制t r p 的活性 三磷酸肌醇受体有两个t r p 相互 作用的序列 f 2 q 和f 2 9 f 2 9 的亚片段f 2 t 7 6 8 8 0 5 也和t r p 的c 一末端有积极的相互作用 z h a n ge ta l 2 0 0 1 t r p c 通道蛋白家族是一个超家族 根据结构类似物的分析在结构和功能上 有几方面的推测 是跨膜6 次的虽白 功能蛋白是四聚体 t h o m a se ta 1 2 0 0 2 2 7 2 三磷酸肌醇受体和其他蛋白相互作用对细胞的程序化死亡的调控 b c i 2 家族的蛋自在细胞程序化死亡过程中起着十分重要的作用 a d m se ta l 1 9 9 8 在细胞 粘附性降低 d n a 的损伤等作用下 多细胞有机体的细胞都可以通过细胞凋亡来开始细胞的死 亡 在这样的情况下 抗细胞捅亡的b c l 2 家族的蛋白的表达 包括b c l 2 和b c l x 1 都能阻止 1 3 细胞启动细胞凋亡的反应及维持细肥的生存和促使细胞的恢复 b c l 2 和b c l x i 主要住内质网 核周 线粒体的外膜存在利表达 在b c l x i 过表达的细胞中 i p 3 受体生向表达减少 同时受体 依赖的c a 2 的流入雨l 受i p 3 介导c f 的释放减少 也辩是浣b c l x i 可以通过改变i p 3 受体的表达 来影响胞内c a 2 的稳态平衡 l i e ta l 2 0 0 2 线粒体细胞色素c 年 二磷酸肌醇受体渊1 反麻刺激舶从内质网的钙离子的释放可以嗣1 细胞 捅亡 b o e h n i n 2e ta 1 2 0 0 3 细胞色素c 是一个在电子传递链中小的包含i 缸红素的酶 在许多凋 亡的模式中 细胞色索c 从线粒体的内腔释放到细胞质中 s t r a s s e r e ta l 2 0 0 0 而且细胞色素c 从线粒体的内脏释放是通过一个未知的机制迅速释放 g o l d s t e i n e ta l 2 0 0 0 在稠亡的早期 细 胞色素c 定位到内质两 在内质网上选择性的和二磷酸肌醇受体结合 结合位点是三磷酸肌醇受 体c 末端2 5 8 9 到2 7 4 9 的氨基酸序列 这种结合导致了钙离子的释放 而且钙离子是和细胞色素 c 从线粒体的释放是协同发生 从而导致了后期的细胞凋亡的发生 2 7 3 激活的三磷酸肌醇受体调控核孔复合体 n p c s 构象的变化 控制核内外物质 的交换 核孔复合体 n p c s 是一个巨大的1 2 5 m d a 跨核膜的蛋白通道 在核和胞质之间形成通道 这个大分子的复合体包括1 5 0 个不同的蛋白亚基 形成8 倍体对称的孔道镶嵌于核膜上f g o l d b e r g e t a l 1 9 9 7 b f a h r e n k r o g e t a l 2 0 0 1 k i s e l e v a e t a l 2 0 0 0 p a n t ea n d a e b i 1 9 9 6 研究表明中央颗粒 在核内外物质运输中起着非常重要的作用 高分辨率显微镜和原子力显微镜研究发现 在c a 2 缺少的情况下 核孔复合体 n p c s 中央颗粒处被一些物质所代替 g o l d b e r ga n d a l l e n 1 9 9 3 a p e r e z t e r z i ce ta l 1 9 9 6 在核三磷酸肌醇受体被激活后 中央颗粒处被一些物质所代替 调节核 内外物质的运输 这些结果表明c a 浓度的敏感性核孔复合体 n p c s 构象变化可以改变核i l 复 合体 n p c s 的通透性 m a ke ta l 2 0 0 1 b t a k a h a s h ie ta l 1 9 9 4 3 植物中三磷酸肌醇受体的研究 自从1 9 8 5 年b o s sa n dm a s s e l 在植物中第一次证实有多聚磷酸肌醇的出现 现在大家己普遍 接受它主要通过肌醇磷酸酯和肌醇磷酸化在植物的发育和环境适应中起着十分重要的作用 b o s s e t a l 1 9 8 5 c o t ea n d c r a i n t 9 9 3 g r o s se t a l 1 9 9 3 显然 这条信号通路在植物和动物王国中是 非常保守的 研究人员的研究表明在高等植物中三磷酸肌醇诱导c a 2 的释放和动物的释放方式非 常相似 尽管如此 对于植物类三磷酸肌醇受体蛋自的了解还是很有限 到目前为止 仅仅有几篇相关的文献报道植物推测的三磷酸肌醇受体 但也只是在电生理和 生化水平上鉴定有类动物三磷酸肌醇受体蛋白的存在 s a n d e r se ta l 2 0 0 2 b 如 b m s n