（环境科学专业论文）海藻酸降解菌性质及微生物对石油污染土壤生物修复影响的研究.pdf

摘要 增多 不同处理中微生物种类不同 关键词 菌株a 7 褐藻酸裂解酶发酵产酶条件优化寡糖石油修复 a b s t r a c t ab s t r a c t a l g i r m t e sa r el i n e a rp o l y s a c c h a r i d e si nw h i c hp d m a n n u r o n i ca c i d m a n d a l g u l u r o n i ca c i d g a r e 1 4 一l i n k e dt of o r mb l o c k so fc o n s e c u t i v egr e s i d u e s g b l o c k s c o n s e c u t i v emr e s i d u e s mb l o c k s a n da l t e r n a t i n gma n dgr e s i d u e s m g b l o c k s a l g i n a t ea n da l g i n a t e d e r i v e do l i g o s a c c h a r i d e sh a v eb e e na p p l i e da sr a w m a t e r i a l si np h a r m a c e u t i c a l f o o d t e x t i l e a g r i c u l t u r a la n do i li n d u s t r i e s t h e d e v e l o p m e n to fv i a b l ep r o c e s s e sf o rd e g r a d a t i o no fa l g i ni sa na t t r a c t i n gg r o w i n g i n t e r e s t h o w e v e r f u r t h e ri n v e s t i g a t i o ni sr e q u i r e df o rp r a c t i c a la p p l i c a t i o no ft h i s e n z y m e t h e r ea r em a n yf a c t o r st h a ti n f l u e n c et h ea l g i n a s ep r o d u c t i o n t h es t r a i ng r e w s i g n i f i c a n t l yb e t t e ri no r g a n i cn i t r o g e nr e s o u r c e ss u c ha sy e a s te x t r a c tt h a ni n o r g a n i c n i t r o g e nr e s o u r c e sl i k e n h 4 2 s 0 4 s oi tp r o d u c e dm u c hl a r g e ra m o u n to fa l g i n a s ei n f e r m e n t a t i o nm e d i u mw h i c hc o n t a i n e do r g a n i c n i t r o g e nr e s o u r c e s w h e ni n c u b a t e da t 3 0 2f o r9 6 hw i t hi n i t i a lp h9 5i nt h el i q u i dm e d i u mw h i c hc o n t a i n s0 5 p e p t o n e 0 1 y e a s te x t r a c t 0 5 s o d i u ma l g i n a t e 0 5 m o l ln a c i t h es t r a i na 7p r o d u c e st h e h i g h e s ta m o u n to fa l g i n a s e t h eh i g h e s ta l g i n a s ea c t i v i t yi s1 2 7 9 u m 1 t h ea l g i n a s eo ft h es t r a i na 7i se x t r a c t e db ya m m o n i u ms u l f a t er e c i p i t a t i o n 8 0 s a t u r a t i o na t0 d i s s o l v e di nt h es o l u t i o nb u f f e ro fp h o s p h a t ea sr a wa l g i n a s e a n ds t o r e df o rl a t e ru s e t h es t u d ys h o w e dt h a tf o ra l g i n a s ed e g r a d a t i o n t h ee n z y m e h a da l lo p t i m a lt e m p e r a t u r eo f4 0 c a no p t i m a lp ho f8 0a n da no p t i m a ls u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o no f0 3 i th a dr e l a t i v e l yb r o a dp ha d a p t a b i l i t ya n di sd e m o n s t r a t e dt o b er e l a t i v e l yh e a tr e s i s t a n t t h ee n z y m ea c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yc u 十 z n 2 f e 3 a n ds l i g h t l ya c t i v a t e db ym 9 2 b u ts i g n i f i c a n t l ya c t i v a t e db yn a a ti o n c o n c e n t r a t i o nb e i n g0 5m o l l t h ed e g r a d i n gp r o d u c to fa l g i n a t ew a su s e dd u r i n gt h eb i o r e m e d i a t i o np r o c e s so f o i l c o n t a m i n a t e ds o i l b y m e x i c a n as c h r a d t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a t o l i g o s a c c h a r i d e sh a dp o s i t i v ee f f e c to nt h ee n z y m ea c t i v i t yo fs o i l a n dt h e ni m p r o v e d t h er e d u c t i o nr a t eo fo i l t h es o i lr e m e d i a t e db ym e x i c a n as c h r a dw a t e r e dw i t h o l i g o s a c c h a r i d e st h a td i l u t e db y2 0t i m e sa c h i e v e dt h eg r e a t e s to i lr e d u c t i o nr a t eo f 2 3 6 3 t h ep r o f i l eo fd g g es h o w e dt h a td i f f e r e n ts o i l sh a dd i f f e r e n tb a n d s p a t t e r n s w h i l et h es a m p l ew a t e r e dw i t ho l i g o s a c c h a r i d e st h a td i l u t e db y2 0t i m e sh a d i i i a b s t r a c t t h eb r i g h t e s tb a n d s t h es t u d yo fd i f f c r c n tt r e a t m e n to fg o s s y p i u mh i r s u t u mf o rt h eo i l c o n t a m i n a t e d s o i lr e m e d i a t i o ns h o w e dt h a tg o s s y p i u mh i r s u t u mc o m b i n e d 析mp g p ra n do i l d e g r a d i n gb a c t e r i ah a st h eg r e a t e s to i lr e d u c t i o nr a t eo f2 9 7 6 f o l l o w e db yt h e t r e a t m e n t so f g o s s y p i u m h i r s u t u m d e g r a d i n g b a c t e r i aa n d g o s s y p i u m h i r s u t u m p g p w h i c h w e r e2 8 3 a n d 2 7 7 8 r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l to f p c r d g g es h o w e dt h a td i f f e r e n ts o i ls a m p l eh a dd i f f e r e n tb a c t e r i a lc o m m u n i t y s t r u c t u r e s o m eb a n d sa r eu n i q u e l ye x i s t e di ns o m ec e r t a i ns a m p l e k e yw o r d s s t r a i na 7 a l g i n a s e o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n e n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n 16 sr r n a p c r d g g e 南开大学学位论文使用授权书 根据 南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法 我校的博士 硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定 南开大学拥有在 t 著作权法 规定范围内的学位论文使用权 即 1 学位获得者必须按规定提交学位论文 包 括纸质印刷本及电子版 学校可以采用影印 缩印或其他复制手段保存研究生学位论文 并编入 南开大学博硕士学位论文全文数据库 2 为教学和科研目的 学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读 在校园网上提供论文目录检索 文 摘以及论文全文浏览 下载等免费信息服务 3 根据教育部有关规定 南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文 4 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊 光盘 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库 通过其相关网站对外进行信息服务 同时本人保留在其他媒体发表论文的权利 非公开学位论文 保密期限内不向外提交和提供服务 解密后提交和服务同公开论文 论文电子版提交至校图书馆网站 h t t p h 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 8 0 0 1 i n d e x h t m 本人承诺 本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品 并已通过论文答辩 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致 如因不同造成不良后果由本人自负 本人同意遵守上述规定 本授权书签署一式两份 由研究生院和图书馆留存 作者暨授权人签字 2 0 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 姓名 学号答辩日期年月 日 论文类别博士口学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院 系 所专业 联系电话e m a i l 通信地址 邮编 备注 是否批准为非公开论文 注 本授权书适用我校授予的所有博士 硕士的学位论文 由作者填写 一式两份 签宇后交校图书 馆 非公开学位论文须附 南开大学研究生申请非公开学位论文审批表 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行 研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的 已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体 均己在文中以明确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担 学位论文作者签名 年月日 第一章文献综述 1 1 1 来源及组成 第一章文献综述 第一节褐藻酸 海藻酸是从海带 马尾藻 巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物 又称褐藻胶 褐藻酸 1 8 8 1 年 苏格兰的化学家s t a n f o r d 研究生长在海岸繁茂的大型藻 a s c o p h y l l u m 的化学成分 用碳酸钠的水溶液提取藻体 然后用盐酸调节液 体到酸性时 观察到液体出现了纤维状的固体物质 这是最初发现的褐藻酸 褐藻酸是褐藻细胞壁和细胞间质的主要组成部分 也是褐藻中含量较多的一种 多糖 其分子是由d d 1 4 甘露糖醛酸 p d m a n n u r o n i ca c i d 简称m 和a l 1 4 古罗糖醛酸 a l g u l u r o n i ca c i d 简称g 两种单体组成的嵌段式线性聚合物 其分子中存在三种嵌段 均聚甘露糖醛酸 m n 均聚古罗糖醛酸 g n 和 m g 两种单体交替 m g n 的嵌段 i j 尽管某种褐藻胶可能以某种类型的组 成为主 但在一种褐藻胶内可能同时存在以上三种类型 其结构式如图1 1 所示 2 不同藻体中m 和g 比例差异较大 如我国以海带生产的褐藻酸m g 比值在 2 2 6 左右 而马尾藻褐藻酸中m g 比值在0 8 1 5 海藻的不同部位m g 比值 也有差异 如海带 m g 大d j i l 页序为基部 中部 尖部 m g 比值决定了褐藻 酸的结构 同时也决定了其物理化学性质1 3 j 1 1 2 溶解性和黏度 海藻酸盐在水溶液中的溶解性随p h 的增大而增加 在p h 5 8 7 5 时盐溶液 呈均匀透明溶液 海藻酸含有游离羧基 性质活泼 能和n a i r n h 4 成盐 呈黏稠状胶液 而酸的c a z a i 计 b a 2 盐不溶于水 海藻酸在纯水中几乎不溶 为无色非晶体物 也不溶于乙醇 四氯化碳等有机溶剂 海藻酸能与蛋白质 蔗糖 甘油 淀粉 磷酸盐类共溶 黏度随p h 的变化成一倒钟形曲线 在p h 7 时其黏度最大 第一章文献综述 1 1 3 凝胶特性与稳定性 海藻酸在p h 5 8 以上易溶于水 在p h 5 8 以下其水溶性下降 逐渐形成凝胶 p h 降到3 以下时 海藻酸脱水析出 海藻酸也可与多价阳离子产生凝胶 海藻 酸盐无论是在水溶液中或是干品 都会发生不同程度的降解 其黏度不断下降 在中性条件下 降解速率较低 p h 小于5 或大于1 0 时 其降解速率明显加快 一般而言 在6 0 c 以下比较稳定 4 1 串斗秽 4 冀 图1 1a b d 甘露糖醛酸 b q l 一古罗糖醛酸 c 褐藻酸的结构 1 2 1 褐藻酸裂解酶来源 第二节褐藻酸裂解酶 1 9 3 1 年 大岛等从鲍鱼 h a l i o t u s g i g a n t e u s 的内脏中首次发现了可以分解 褐藻酸的酶 命名为a l g i n a s e 褐藻胶裂解酶主要有三个来源 第一类是动物源 的褐藻胶裂解酶 包括海洋软体动物和棘皮动物等 1 9 8 4 年 国内的朱仁华等 5 2 第一章文献综述 从朝鲜花冠小月螺 单齿螺和褐疣荔枝螺3 种海螺中分离得到褐藻胶裂解酶的 粗酶提取液 用粘度法测定了酶活力 尤以朝鲜花冠小月螺的分解活性最高 1 9 8 7 年 k l o a r e g 等 6 从海兔内脏中制备出褐藻酸酶 用于墨角藻合子的去壁 制备出了原生质体 1 9 8 9 年 y a m a g u c h i 等 6 从海螺 鲍的内脏中制备出褐藻解 壁酶 用于某些褐藻的细胞解离 第二类是植物源的褐藻胶裂解酶 包括巨藻 泡叶藻 掌状海带 克氏海带等海藻 1 9 6 6 年 l i nyt 掣 从海洋褐藻f u c u s g a r d n e r is i l v a 中分离提纯出褐藻酸酶 第三类是微生物源的褐藻胶裂解酶 包括 海洋细菌 土壤细菌和真菌等 m a n a b uk i t a m i k a d o 等 8 从海水中通过厌氧培养 的方法 分离出2 6 株菌 这些菌在淡水中都不生长 比较这些菌的活力 得到 a 1 9 和a 1 1 2 8 两株高产酶菌株 1 9 8 4 年 j e f f r e y 等 9 l 以褐藻酸钠为惟一碳源 从土壤和海水中分离出产生褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌 胞外酶表现出明显的内 切甘露糖醛酸裂解酶性质 酶的分子量约为4 0k d 2 0 0 1 年 1 w a m o t o 1 0 等人研 究发现埃氏别单胞菌 a l t e r o m o n a ss p 可以产生一种褐藻酸胞内裂解酶 分子 量为3 3 9 k d p i 为3 8 在p h 7 5 8 0 时 具有最高活性 通过酶动力学分析 发现该酶优先降解p o l y g 微生物褐藻酸酶主要来源于海洋细菌 土壤细菌和真菌等 如弧菌 黄杆 菌 固氮菌 克里伯氏菌 肠杆菌 别单胞菌和芽抱杆菌 1 来源于海洋细菌的褐藻酸酶 大多数的产褐藻酸酶的菌株是来自于或是非常接近海藻和海洋软体动物 此类细菌以褐藻酸为碳源 有的甚至以褐藻酸为唯一碳源 其中大多数细菌首 次分离就是采用褐藻胶为唯一碳源的培养基 在一些细菌中当有褐藻胶存在时 会诱导褐藻胶裂解酶的产生 例如菌株彳 a q u a t i l i s 1 1 以及海洋细菌a 3 与w 3 t 1 2 或者与马尾藻有关的细菌 1 3 1 4 而另一些细菌 则是稳定的产生这种酶 例如 p a l g i n o v o r a t 这些酶的最适p h 值通常在7 5 8 5 之间 而最适温度从2 5 5 0 不等 海洋细菌产生的褐藻酸酶在分子量 底物专一性以及所需的阳离子上表现 出极大的差异 使得我们无法归纳出褐藻酸酶的典型特征 褐藻酸酶大多数是 典型的胞外酶或周质空间产生的酶 p e r i p l a s m i c 虽然大多数是内切酶 但是 也发现有外切酶的存在 如从海洋细菌a 3 中发现的酶就是外切酶 1 6 1 尽管大多数的菌株产生一种裂解酶 但是少数菌株产生不止一种裂解酶 例如p a l g i n o v o r as t r a i n x 0 1 7 同时产生一种p o l y m 与一种p o l y g 裂解酶 1 7 1 5 j 3 第一章文献综述 a l t e r o m o n a ss p s t r a i nh 4 是一种 特别 的细菌 它以褐藻胶为唯一碳源 产生 至少5 种褐藻胶裂解酶 1 8 2 0 1 a l t e r o m o n a ss p s t r a i n 厚4 能够产生4 种细胞内 褐藻胶裂解酶 其底物特异性分别为p o l y m p o l y m 一p o l y m g 和p o l y g 这种胞内酶的粗提物同时具有对褐藻胶底物的水解酶活性 a l t e r o m o n a s s p s t r a i n 皿4 的胞内酶与胞外酶稳定表达 当加入褐藻胶时 可以促进胞外酶的 表达 但是对胞内酶的表达没有显著影响 这种产生多种褐藻胶裂解酶的菌株 与一些以马尾藻为食物来源的细菌相似 那些细菌产生几种不同类型的褐藻胶 裂解酶以促进褐藻胶的新陈代谢效率 2 1 1 来自于海洋细菌的褐藻胶裂解酶 其中大多数的p i 很低 大约在4 3 到6 7 之间 高的n a c l 浓度无论对于裂解酶的活性或者是促进裂解酶的活性都是必须 的 例如a l g g a l g a 以及h b r i oh a r v e y i 高浓度的n a c i 可明显提高褐藻酸 酶的酶活 可能是因为高浓度的n a c i 可去除褐藻酸分子表面的水或是能够改变 酶与底物结合时的电荷 从而使酶与底物更好的结合 形成更稳定的酶与底物 复合物 2 2 1 对于许多褐藻酸酶 二价阳离子的存在 有助于得到更好的酶活 然而 从海洋中分离到的各种各样的褐藻胶裂解酶 其分子大小 2 4 1 1 0 k d 底物特异性 阳离子的必须与否 都大不相同 很难对它们进行一般性总结 2 来源于土壤细菌的褐藻胶裂解酶 来源于土壤的产酶菌一般分为革兰氏阴性 g 和革兰氏阳性 g 两种 细菌 从目前报道看 土壤中产生褐藻胶裂解酶的g 细菌的数量要多 这些产 酶菌从种属上讲 许多属于假单孢杆菌 如铜绿假单孢菌 丁香假单孢茵 此 外还有别杆菌 枯草杆菌等 非常广泛 从产酶位点来说 既有胞外酶 a c h r o o c o c c u m 又有胞内酶 p a e r u g i n o s a 还有酶产生于细胞质 s p h i n g o m o n a ss p 周缘质团 s p h i n g o m o n a ss p 有的茵只一个位点产酶 有的则既产生胞内酶 又产生胞外酶或其他酶 这些酶底物特异性性也非常复 杂 但基本都是内切酶 酶活需要一价或二价阳离子存在或激发 因产酶菌来 源不同 酶最适温度在2 0 7 0 范围内 最适p h 一般在7 5 8 5 之间 相对而言 来源于土壤的产生褐藻胶裂解酶的g 细菌被报道的很少 目前 不超过1 0 种 这些菌株产生的都是胞外酶 除了b a c i l l u s 彳b 正 d j 5 产生的酶具 有p o l y g 和p o l y m 活性 c o r y n e b a c t e r i u ms p a l y 1 产生的酶具有p o l y g 活性外 其他菌株产生的酶具有p o l y m 活性 所报道的酶都是内切酶 最适温度在3 7 5 5 之间 最适p h 在5 8 8 2 之间 分子量在2 8 6 5 8 k d a 之间 这些酶大多 4 第一章文献综述 需要c a 2 m g c 0 2 等二价金属离子的作用 来维持或激活酶活 3 其他来源的褐藻胶裂解酶 这些来源主要包括少数海洋真菌 噬菌体和病毒 从腐烂的海藻中分离得 到一些产酶真菌 这些菌株主要产胞外酶 具有内切p o l y m 活性 最适p h 在5 6 之间 4 5 有最大酶活 需要l 3 的n a c l 刺激酶活 一些固氮菌 和假单孢杆菌的噬菌体通过产裂解酶穿透细菌的乙酞化的高p o l y m 的胞外多 糖 这些噬菌体产生的酶对各自寄主的胞外多糖具有内切活性 分子量在3 0 一 4 2 k d a 之间 最p h 在7 5 8 5 之间 从c h l o r e l l a 病毒克隆到的裂解酶基因 该 酶分子量为3 7 k d a 最适p h 为1 0 5 酶活需要c a 2 存在 1 2 2 褐藻胶裂解酶的分离纯化 硫酸铵分离法经常作为从复杂的蛋白质混合液中分离褐藻胶裂解酶的初始 步骤 2 3 2 4 3 2 接着 可以使用阳离子交换层析技术从粗酶液中分离碱性等电点的 褐藻胶裂解酶 2 9 3 i 3 3 3 5 使用阴离子交换层析技术用来分离等电点较低的褐藻胶 裂解酶 1 8 2 4 2 7 3 0 3 4 3 6 或者使用以上层析技术从部分纯化的褐藻胶裂解酶中去除 污染物 3 7 1 而凝胶过滤层析技术作为常规手段一直使用 1 3 2 3 3 0 31 3 4 3 8 羟磷灰石 疏水层析技术以及亲和层析技术都应用于分离褐藻胶裂解酶 3 9 1 7 2 7 3 6 4 0 2 4 1 m j 羟基磷灰石成功的应用于海洋细菌a t c c4 3 3 3 6 9 中褐藻酸酶的纯化 4 0 1 疏 水作用层析 h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y h i c 用于野生型细菌k n 阳甜聊d z f c 陀 3 7 j 从细菌a v i n e l a 玎旃f 的工程菌 2 以及绿脓杆菌 p a e r u g i n o s a 中 褐藻酸酶的部分纯化 羟基磷灰石和疏水层析曾用于纯化a z o t o b a c t e r c h r o o c o c c u m 中重组褐藻酸酶a l g l l 4 亲和层析中最常用的组氨酸标记的蛋白用于n i 2 胆酸盐树脂 可一步法纯 化蛋白 1 7 3 9 1 a l g i n a t e s e p h a r o s e 亲和层析树脂也可用于褐藻酸酶的部分纯化盼 2 7 1 a l g i n a t e e p o x y 环氧 亲和树脂和蛋白快速分析系统 f a s tp r o t e i nf l o w c h r o m a t o g r a p y 也可用于褐藻酸酶的部分纯化 迄今为止 大部分从野生型细菌中分离到的褐藻酸酶只得到了部分纯化 且只得到了相对产率较低的纯酶或部分纯化的酶用于酶学性质研究 只有少数 褐藻酸酶可纯化得到产率高 纯度高的酶 2 9 1 8 4 5 4 6 1 有文献报道几种克隆的褐藻 酸酶纯化后在大肠杆菌和枯草芽抱杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 不同系统中得到了高 5 第一章文献综述 表达 2 3 1 7 3 8 4 0 4 1 3 5 从大肠杆菌的不同表达中也得到了 些部分纯化的不同基因 序列的酶 4 7 3 8 2 8 4 4 而且 目前有三种高产的褐藻酸酶晶体生长后用于x 射线衍 射研究 2 3 3 5 4 8 5 们 褐藻胶裂解酶分离纯化困难 从而导致高纯度褐藻胶裂解酶迄 今不能产业化大量生产 这给我们的研究工作带来了机遇和挑战 1 2 3 酶学分类 海藻酸裂解酶按其降解褐藻胶嵌段 底物专一性 的不同可分为三类 专 一性裂解1 4 1 3 d 甘露糖醛酸片段的裂解酶 a l y e c4 2 2 3 专一性裂解l 4 a l 古罗糖醛酸片段的裂解酶 a l y e c4 2 2 1 1 以及两种片段都可裂解的 双功能裂解酣5 1 鲍属软体动物 鞘氨醇单胞发光细菌和铜绿假单胞菌是典型 的p o l y m 裂解酶生产源 克里伯氏产气菌是典型的p o l y g 裂解酶生产源 别单 胞菌和芽孢杆菌中发现能同时降解p o l y g 和p o l y m 的双功能裂解酶 按其分子量大小不同也可分为三判5 1 第一类分子量在2 0 k d 3 5 k d 之间 m r 3 0 0 0 0 类 例如趾 1 g e n b a n k a b 0 3 0 4 8 1 a 1 i g e n b a n k a b 0 3 3 1 2 a l y a g e n b a n kl 1 9 6 5 7 第二类分子量约为4 0k d m r 4 0 0 0 0 类 例如a c a i g l g e n b a n k a j 2 2 3 6 0 5 a v a l g l a f 0 2 7 4 9 9 第三类分子量约6 0k d m r 6 0 0 0 0 类 第二类酶专一性裂解m 嵌段 而第一类酶有多种底物专一性 l 1 2 4 酶的作用方式 褐藻胶裂解酶是通过在底物的非还原末端的b 消去机制降解褐藻胶 其作 用位点是1 4 糖苷键 褐藻胶分子中的羧基与酶分子中的阳离子性氨基酸残基结 合 c 5 位的c h 电子对被6 位的羧基吸引 5 位的c h 结合变弱 然后酶分子 中的一个亲核性氨基酸残基与c 5 位的质子结合 电子向着生成稳定的中间体的 方向运动 在水解的六元糖环的c 4 和c 5 位置间形成双键 所以褐藻胶酶解的 寡糖均在非还原末端产生c 4 c 5 不饱和双键 在2 3 0 2 4 0 n m 有强吸收 5 2 褐藻胶裂解酶的专一性可能与产酶微生物所处的环境或生物种类有关 如 h b r i os p 5 1 0 产生的褐藻胶裂合酶由3 个酶组分 具有不同的底物专一性和 空间二级结构 5 副 h b r i os p q y l 0 2 产生的褐藻胶裂解酶对聚甘露糖醛酸 p m 的活性高于对聚古罗糖醛酸 p g 的活性 从海带中分离出来的 种 a l t e r o m o n a ss p 肛4 细菌 其产的褐藻胶裂解酶具有p m 和p g 两种活性 其中 6 第一章文献综述 褐藻胶裂解酶具对p m 的活性是对p g 的二十倍 l 引 然而 多数褐藻胶裂解以m 嵌段为底物 也有一些g 专一性的裂解酶 目前研究的褐藻胶裂解酶大多数具 有内切酶活性 在长链内将单体的复合嵌段随机降解 但也有一些具有外切活 性的裂解酶 从多糖末端以单糖或二糖为单位依次切除 5 4 1 也有一些原酶抽提 物具有多底物专一性 这可能是因为这种微生物能产生多酶复合体系 也或者 它具有多种底物专一性 总之 从某些细菌或海洋动物中分离的褐藻酸酶 有的只降解甘露糖醛酸 嵌段 有的只降解古罗糖醛酸嵌段 有的二者皆可 这些酶对褐藻酸的降解只 有2 种方式 一是糖苷键的水解 二是从降解链的非还原末端脱水生成双键 1 2 5 酶的结构特点 根据酶的结构特点 可把褐藻胶裂解酶分为四种 多糖裂解酶 5 p l 5 多糖裂解酶 7 p l 7 多糖裂解酶 1 4 p l 1 4 多糖裂解酶 1 5 p l 1 5 其 中 p l 5 和p l 7 具有内切酶活性 但它们的底物专一性不同 5 4 1 到目前为止 对褐藻胶裂解酶的结构分析主要集中在细菌和真菌所产的酶上 并且约有2 0 种 酶的基因已得到克型 j 研究表明 不同的褐藻胶裂解酶的一级结构和高级结构相差较大 但在酶 的催化中心的结构和必须氨基酸残基的种类上 不同的褐藻胶裂解酶有一定程 度的相似性 对p l 5 和p l 7 族的褐藻胶裂解酶的结构已研究得比较深入 如 p l 5 族中的s p h i n g o m o n a ss p a 1 褐藻胶裂解酶 a 1 i i i 该酶具有a a 套筒结构 酶的活性部位有一个可伸缩的盖环结构 其上h i s l 9 2 和t y r 2 4 6 起着接触底物的 作用 活性中心的精氨酸残基可以和甘露糖醛酸的羧基连接 已知的p l 7 族褐 藻胶裂解酶 p a e r u g i n o s a 褐藻胶裂解酶p a l1 6 7 和c o r y n e b a c t e r i u m s p 古罗糖醛 酸裂解酶a l y p g 具有p 折叠的夹板状结构 该酶的活性中心有一段很重要的 氨基酸保守序列结构 以及硫酸盐基团 然而 它们在催化反应中的作用机理 尚不十分清楚 在拓扑结构上 p l 1 褐藻酸裂解酶为p 螺旋 p l 1 0 褐藻酸裂 解为a a 套筒结构 但它们的活性中心的氨基酸残基的排布却极为相似 5 4 1 研究表明 酶的底物专一性是由裂隙双链上的带电荷的精氨酸 赖氨酸以 及带有芳香环的氨基酸所决定的 酶活性中心的保守序列 套环结构以及硫酸 基团等 在底物识别和结合上起着巨大的作用 通过对裂合酶的化学修饰 蛋 7 第一章文献综述 白序列的比较 结合位点的突变以及晶体结构的研究 结果表明 色氨酸 赖 氨酸 组氨酸以及半光氨酸是酶的活性中心的必须氨基酸残基 其中色氨酸参 与了底物的结合 赖氨酸和组氨酸直接参与了酶的催化 5 1 1 1 2 6 褐藻酸酶基因工程研究进展 迄今为止 只有少数几种褐藻酸酶的基因得到克隆和测序 1 9 9 1 年 b r o w n 5 6 等报道了用基因工程方法从褐藻附生生物分离的细菌 s a r g a s s u mf l u t i t a n s 的 d 一甘露糖醛酸酶基因克隆到大肠杆菌中表达 生产d 甘露糖醛酸酶 另外 p s e u d o m o n a ss p o s a l g 9 t 5 7 1 p s e u d o m o n a sa l g i n o v o 1 7 1 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 5 8 j 和p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 的褐藻酸酶基因也己被测序 并克隆到大肠杆菌 e c o l i 中用于生产褐藻酸酶 甘露糖醛酸酶和古罗糖醛酸酶 1 9 9 3 年 m a l i s s a r d 等把海洋细菌a t c c 4 3 3 3 6 7 的褐藻酸酶基因克隆到ec o l i 生产甘露糖醛酸酶 发酵液产酶5 0 9 l 有关微生物褐藻酸酶的基因克隆及结构研究代表了这一领域 最新 最重要的进展 通过将褐藻酸酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细 胞 可使褐藻酸酶的发酵产酶发生量的飞跃 此外 对褐藻酸酶结构的详细了 解使得设计适于工业化应用的菌种成为可能 毫无疑问 微生物褐藻酸酶的基 因克隆与结构鉴定方面的突破将对酶的工业化生产产生深刻的影响 1 2 7 褐藻胶裂解酶的生物功能 1 不产褐藻胶的生物褐藻胶裂解酶的功能 褐藻的细胞壁是一种含有连续的三维褐藻胶网络的纤维素框架 褐藻胶网 状结构由c a 2 搭桥的p o l y g 以及缠绕其上的p o l y m 链构成唧1 海洋一些 动物以海藻为食 因而通常在其消化道内产生一些碳水化合物降解酶的混合物 其中包括琼胶酶 昆布多糖酶 纤维素酶以及褐藻胶酶 这些酶混合物 使得 这些海洋动物能够有效利用这些资源获得能量 一些海洋产酶细菌和土壤g 还 包括一些g 菌 能利用褐藻胶作为唯一或者第二碳源 一般 种产酶生物只产 生一种酶 但有时也产生多种酶或者产生多底物特异性的以适应环境 尽量从 环境获得能量物质 只产生褐藻胶裂解酶但不利用褐藻胶的情况非常少见 2 产褐藻胶的生物褐藻胶裂解酶的功能 相对较少的一些细菌 在合成多糖的同时也产生特定的酶降解这些多糖 8 第一章文献综述 但是 在一些不同的假单孢杆菌和固氮菌的质团周缘的褐藻胶裂解酶 能够合 成褐藻胶 但是这些菌株不能利用褐藻胶作为碳源或能源 因为 这些菌株产 生的胞外高p o l y m 褐藻胶 在m 残基的c 2 或c 3 上不同程度的乙酞化 因 而能够抵抗其产生的内切裂解酶的降解 2 7 6 1 1 m a y 6 2 等认为 这些菌株产生的 褐藻胶裂合酶的功能 是作为编辑蛋白质控制褐藻胶的聚合物的长度 或者提 供短的褐藻胶片断引发褐藻胶的聚合反应 对于铜绿假单孢杆菌而言 褐藻胶 的作用是当褐藻胶裂解酶基因过分表达时 产生的酶使褐藻胶聚合物的长度降 低 菌体脱离黏性菌落的表面的能力增加 这样便于菌落移植到新的地点 而 对于固氮菌而言 褐藻胶裂解酶的作用与褐藻胶的生物合成密切相关 最可能 的功能可能是在差向异构化酶的协同作用下 于固氮菌分化过程中 形成抗干 燥的囊泡 1 2 8 海藻酸裂解酶的应用 1 医药 在医药领域中 海藻酸裂解酶可用作药物酶治疗由铜绿假单胞菌感染造成 的肺囊性纤维化症 c y s t i cf i b r o s i s c f 在治疗中该酶降低菌体产生的聚甘露 糖醛酸的粘度 减弱细菌在病人体内的附着能力 提高了治疗效果1 6 引 此外 利用海藻酸裂解酶生产的海藻寡糖 为新药 新功能食品的开发提供了新手段 随着对海藻酸裂解酶的性质和用途 海藻酸寡糖产物结构和功能研究的深入 这些活性物质可能会为人类健康作出更多的贡献 近年来研究发现 褐藻胶降 解产物具有多种生物学活性 如降血脂 降血压等保健作用岬 寡聚甘露糖醛 酸还可用做抗肿瘤的辅助药物 在放疗和化疗中保护可能被损伤的正常造血细 胞 利用环磷酰胺抑制造血细胞的小鼠模型 给予寡聚甘露糖醛酸铁后 适量 寡聚甘露糖醛酸铁能明显升高骨髓有核细胞 外周血红细胞和白细胞数量 6 5 2 生产海藻饲料 海藻饲料是一种极有研究价值 经济价值和开发利用潜力的野生饲料资源 大型海藻营养丰富 具有多种生物学活性 据测定 每百克干品中含粗蛋白8 2 9 脂肪0 1 9 粗纤维9 8 9 甘露醇1 7 9 褐藻酸2 4 9 钾4 3 6 9 铁o 1 5 9 碘0 3 4 9 铜0 2 5 m g 锌2 1 0 m g 还含有维生素a b c 及微量硒 钻 铬等营养成分 可加工生产成功能性饲料 是畜禽水产动物养殖优质的饲料来源 但是 由于 9 第一章文献综述 海藻细胞壁中富含大量的粘性海藻酸盐 据报道马尾藻中海藻酸盐含量可达 3 0 3 5 t 6 6 1 海带干物质中海藻酸盐含量为2 4 因此 使得海藻的营养难以 被充分利用 利用高效的生物催化剂 海藻酸裂解酶 能高效催化海藻细胞 壁中的大量的粘性海藻多糖降解 粘度降低 使得胞内的营养物质释放出来 经过处理后的海藻饲料产生的营养物质易于被动物消化吸收 提高了饲料的利 用率 3 藻类科学研究 海藻遗传工程研究起步较晚 发展也较缓慢 海藻有活性的单细胞和原生 质体不易获得是阻碍海藻遗传工程研究的一个重要原因 而用于高等植物的细 胞解壁酶对于海藻细胞分离往往难以奏效 因此要进一步发展海藻遗传工程 迫切需要解决海藻解壁酶问题 自2 0 世纪7 0 年代以来 褐藻酸酶主要应用于海藻多糖结构分析研究 3 5 6 7 1 后来法国国家科学研究中心的k l o a r e g 首先提出了应用褐藻酸酶建立大规模制备 褐藻和红藻原生质体的生产技术 6 8 由此褐藻酸酶开始应用于分子生物学领域 作为高效 可靠的海藻解壁酶主要用于d n a 单细胞 原生质体和胞内活性物 质的制各 海藻多糖的黏度很大 使得提取d n a 非常困难 添加海藻酸盐裂解酶以后 海藻多糖很快降解 黏度下降 大大方便了d n a 的提取 韩宝芹等 6 9 发现 海 藻酸降解菌埃氏交替单胞菌 a l t e r o m o n a s e s p e j i a n a 菌株a 1 0 2 经发酵产生的裂 解酶能使海带和裙带菜藻体明显软化 胞间质松弛 对酶解产物轻轻摇动即可 形成大量单细胞和原生质体 此外 褐藻酸酶在细菌的海藻酸代谢研究等方面 也具有一定意义 根据收集到的褐藻胶以及褐藻胶裂解酶的信息 我们认为褐藻胶裂解酶是 一种具有广泛应用前景的工具酶 尽管褐藻胶裂解酶面临不易分离纯化 收率 低的技术难题 但是褐藻胶裂解酶在揭示褐藻胶裂解酶的分子作用机制 制备 创新性的海洋活性寡糖 研究耐药菌的生物膜及治疗临床上生物膜造成的慢性 感染方面具有巨大的潜力 越来越引起研究者的重视 因此 寻找与分离具有 高活力 特殊 底物特异性的褐藻胶裂解酶就成为目前研究的热点 1 2 9 我国褐藻酸裂解酶研究现状及前景展望 我国对海藻酸裂解酶的研究起步较晚 但是在科研工作者的不懈努力下 在 l o 第一章文献综述 该领域的研究有了很大的进步 尤其是在特异性海藻酸降解菌的发现 产酶的 条件优化以及所产酶的酶学性质研究等方面都取得了重大进展 刘涛等f 7 0 从海带 l a m i n a r i aj a p o n i c a 得到l 株具有较高海藻酸酶活力的 菌 对其发酵培养 测定发酵液的酶活力 得出最佳产酶条件为 p h 7 5 左右 2 5 褐藻酸钠添加量为0 5 蛋白胨作为主要氮源时 连续培养1 4 4h 庞 敏等 7 1 从病烂海带上筛选出降解能力较高的菌株s 4 优化了其产酶条件 制取 粗酶 并对酶的性质进行初步研究 得到s 4 菌株最佳产酶条件是海藻酸钠1 2 n h 4 c 10 9 n a c l l 5 p h 值7 5 温度在2 5 王艳玲等 7 2 j 采用安藤芳明 选择性培养基从自然发病明显的海带幼苗上分离出8 株褐藻酸降解菌 研究表 明 8 株菌能够不同程度地降解褐藻酸钠 菌株a l 和a 2 表现出较强的降解能 力 接种1 d 后液体培养基即变清 温度是该菌大量繁殖的决定性因子 其生长 的最适温度为2 0 最适p h 为7 5 褐藻酸钠质量分数为0 5 0 6 不同氮 源对菌体生长的影响不同 其中有机氮和铵态氮有利于菌体生长 尿素和硝酸 钠抑制菌体生长 只有在培养基中含有褐藻酸钠时 菌体才能正常生长 袁兆 慧等 7 3 通过培养褐藻酸降解菌交替单胞菌 a l t e r o m o n a ss p 菌株h 1 使其产酶 研究了该酶的性质 结果表明 该菌在2 5 培养7 2 h 产酶量最高 褐藻酸酶作 用的最适底物质量分数为1 2 最适p h 值为7 5 最适反应温度为4 0 温度升高酶活力急剧下降 张颖利等 7 4 由腐烂海带中分离出菌a g n l 2 能够降解 褐藻酸 具有褐藻酸裂解酶活性 褐藻酸裂解酶降解褐藻酸的最适反应条件是 温度3 0 p h7 0 底物浓度8 9 m 该褐藻酸裂解酶稳定性对温度高度敏感 5 0 保温l h 酶活力基本消失 m n 2 m 9 2 浓度高低对该酶均有激活作用 k 在5 m m o l l 浓度下对该酶有激活作用 而c u 2 f e 3 对该酶具有抑制作用 孙 丽萍 7 5 1 宋引7 6 1 康平等 7 刀都也对分离到的产褐藻酸裂解酶菌株进行了研究 近年来 许多新技术得以应用于酶的发现与改造 拓展了酶的来源及特性 的概念 克隆酶 杂交酶 修饰酶等将使生物酶发展到一个新阶段 随着功能 酶学 功能基因组或蛋白质组的迅速发展 这必将为新酶的研究和酶工程的发 展提供更广阔的空间 海洋生物酶的开发和利用是海洋资源高值化的关键技术 之一 在对海洋特殊环境的适应中 海洋微生物能够产生出具有独特生理活性 的酶系 成为海洋生物资源由简单利用向高值化开发的重要手段 褐藻酸酶作 为一个重要的海洋生物酶 有着广泛的生物学功能和应用前景 在细胞和自然 环境中的褐藻酸的产生和有效利用之间 褐藻酸酶起维持平衡的重要作用 褐 第一章文献综述 藻酸酶降解褐藻酸具有高度特异性 使它在海藻多糖高值化利用方面具有巨大 的潜力 所以其必将成为一种重要的海洋工具酶