（生物医学工程专业论文）桑椹黄酮的制备及其降血糖和降尿酸作用研究.pdf

m a s t e rd e 铲e et h e s i s 2 01 1 i 躞y 19 0 4 0 7 z u n i v e r s 毋c o d e 10 2 6 9 s t u d e n tn u m b e r 5 1 0 8 1 3 0 0 1 7 6 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i 锣 p r e p a r a t i o n o f m u l b e r i 了 f l a v o n o i d sa n di t s h y p o g l y c e m i ca n dh y p o u r i c e m i ca c t i v i 够 d e p a n m e m m a o o r s p e c i a l i z e df i e l d s u p e r v i s o r s c h o o lo fl i f es c i e n c e g r a d u a t es t u d e n t 圣坚i 旦q 翌坚 丛q m a y2 0 1 1 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明 本人呈交的学位论文 桑椹黄酮的制备及其降血糖和降尿酸作用研究 是在华东师范大学攻读硬岁 博士 请勾选 学位期间 在导师的指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含其他个人已经发表 或撰写过的研究成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中作了明确 说明并表示谢意 作者签名 日期 矽f f 年占月7 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 桑椹黄酮的制备及其降血糖和降尿酸作用研究 系本人在华东师范大学攻读学位 期间在导师指导下完成的鳓博士 请勾选 学位论文 本论文的研究成果归华东师 范大学所有 本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文 并向主管部 门和相关机构如国家图书馆 中信所和 知网 送交学位论文的印刷版和电子版 允许 学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅 借阅 同意学校将学位论文加入全 国博士 硕士学位论文共建单位数据库进行检索 将学位论文的标题和摘要汇编出版 采用影印 缩印或者其它方式合理复制学位论文 本学位论文属于 请勾选 1 经华东师范大学相关部门审查核定的 内部 或 涉密 学位论文 于年月日解密 解密后适用上述授权 f 2 不保密 适用上述授权 导师签名嵫后嚏 v 0 本人签名 训每 其1 b 涉密 学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文 需附获批的 华东师范大学研究生申请学位论文 涉密 审批表 方为有效 未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文 此声明栏不填写的 默认为公开学位论文 均适用 上述授权 王篮超硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 周秀佳教授上海中医药大学博导 主席 孙心德教授华东师范大学 博导 许煜泉教授上海交通大学博导 秦路平教授第二军医大学博导 朱瑞良 教授 华东师范大学博导 摘要 摘要 传统中药桑椹子 f m c t l l sm o r ia l b a e 系桑科植物桑的成熟果穗经晾晒干燥而 成 药典中桑椹子多以辅药形式出现 其药用价值有待进一步丰富 本文首先就 桑椹的主要功能成分含量进行了测量 结果表明 烘至恒重的桑椹中黄酮含量为 0 5 6 多酚含量2 2 6 花青素含量0 0 8 6 多糖类含量8 6 2 采用高效液 相色谱法测定了水解后的桑椹甲醇提取液中黄酮类化合物的种类和含量 结果显 示 桑椹中槲皮素含量为 1 5 0 6 士0 0 2 2 m g 山柰素含量 0 2 8 0 士o 0 0 7 m g 论文确定了桑椹中黄酮类物质的提取方法 桑椹烘至恒重 粉碎过6 0 目筛 石油醚脱脂 乙醇提取合并提取液 减压回收乙醇 热水复溶 待冷却后乙酸乙 酯萃取至乙酸乙酯层颜色较浅为止 合并萃取液 减压回收乙酸乙酯 得到桑椹 粗黄酮 e n l y l a c e t a t ee x 仃a c to f m u l b e 叫 e e m e e m 体外生物学活性研究中 通过对d p p h 自由基 羟基自由基和亚硝酸 盐的清除作用以及对亚硝胺合成的阻断作用 评价其抗氧化活性 通过旺 葡萄糖 苷酶体外抑制试验探索了既m 对大鼠小肠旺 葡萄糖苷酶的抑制作用 通过黄嘌 呤氧化酶体外抑制试验探讨了e e m 对大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性影响 结果 表明 e e m 清除d p p h 自由基的能力较弱 但清除羟自由基和亚硝酸盐的能力 较强 并能有效阻断亚硝胺的合成 e e m 具有较好的抑制大鼠小肠0 葡萄糖苷 酶活性作用 半数抑制浓度约1 2 5 0m m l 同时e e m 对大鼠肝脏黄嘌呤氧化 酶活性也有较好的抑制作用 体外活性实验表明 e e m 具有较好的抑制大鼠小肠a 葡萄糖苷酶活性作用 提示e e m 可能具有一定的血糖调节功能 考察了e e m 对s t z 诱导的高血糖模 型大鼠的影响 以l o om g l g 2 0 0m g 瓜g 3 0 0m g l g 体重剂量的e e m 连续灌胃 3w 每周测定血糖 第3w 处死大鼠 测定相关指标 灌胃第1 2d 进行糖耐 量实验 结果表明 e e m 可显著缓解高血糖大鼠体重下降 有效降低大鼠血清 葡萄糖和果糖胺水平 同时o g t t 实验表明3 0 0m 鲋蟾e e m 能够有效改善糖尿 病大鼠口服糖耐量异常 基于前期体外活性实验结果 e e m 具有较好抑制黄嘌呤氧化酶活性 本研究 进一步探讨了e e m 对高尿酸血症模型小鼠影响 结果显示l o om g l 卧2 0 0m g l g 3 0 0m 刚蟾体重剂量三个剂量的e e m 均可显著降低高尿酸血症大鼠的尿酸水平 同时e e m 可以显著降低大鼠血清尿素氮和肌酐的水平 表明e e m 具有较好的 保护肾脏作用 此外 e e m 可显著降低高尿酸大鼠异常升高的血清甘油三酯和 摘要 游离脂肪酸水平 显示出e e m 对高尿酸模型大鼠的血脂水平具有较好的调节作 用 大鼠肾脏的电镜观察结果显示 较之正常组 模型组与a p 组肾脏细胞明显 畸形化 且细胞核不清晰 核孔模糊 线粒体数量减少 而e e m 各个治疗组则 情况显著改善 进一步验证了髓m 对肾脏具有一定的保护作用 而后着重探讨了桑椹黄酮的提取制备工艺 并绘制了桑椹黄酮 m u l b e 叫 f l a v o n o i d m f v 制备设备工艺流程图 初步分析了制备过程中的主要能耗 并对经实验室纯化得出的 v 进行体外活性实验 结果表明 v 和e e m 功能 相似 均具有较好的体外抗氧化活性并能显著抑制a 葡萄糖苷酶与黄嘌呤氧化酶 活性 综上 水解后的桑椹黄酮中主要黄酮苷为槲皮素与山柰素 且e e m 和m v 均具有显著的体外抗氧化活性和对a 葡萄糖苷酶与黄嘌呤氧化酶活性抑制作用 e e m 可以显著降低高血糖大鼠血糖水平 同时e e m 可以降低高尿酸血症大鼠尿 酸水平 并对腺嘌呤诱导的高尿酸血症大鼠肾受伤有积极的防治作用 关键字 桑椹 抗氧化 0 葡萄糖苷酶活性 黄嘌呤氧化酶活性 降血糖作用 高尿酸血症 a b s t 隔c t a b s t i a c t f m c t u sm o r ia l b o n eo fm et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ei sm a d eb ym a n j l f m i t so fm u l b e h y a c c o r d i l l gt ot h ep h 锄a c o p o e 斌f m c t u sm o r ia l b i su s u a l l y u s e d 觞锄刎u v 锄t 觚di t sm e d i c i n a lv a l u en e e d st 0b ef u r n l e re n r i c h e d f i r s tt h e v a r i o u sf h n c t i o n a lc o m p o n e n t so fm u l b e r 拶w e r ea n a l z e d 粕dm er e s u l t ss h o w e d 也a t m ec o n t e l l t so ft o t a ln a v o n o i c t s p o l y p h e n o l s 卸t h o c y 锄i np i g m e n t 狮d p o l y s a c c h a r i d e sa c c o 帅t e df o r0 5 6 d 眄w e i 曲t 2 2 6 d 呵w e i 曲t 0 0 8 6 d 可 w e i 曲t 觚d8 6 2 d d w e i 曲tr e s p e c t i v e l y t h e n 廿l i sp a p e r 锄a 1 z e dt h ec o m p o n e n t s o fn a v o n o i da g l y c o n e si nm u l b e n yb y 肿l c n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o 舭n t so f q u e r c e t i n 柚dk a e m p f e r 0 1w e r e1 2 8 4m g 锄d o 2 4 8m gp 啊g 舳 t h em e t h o do fe x t r a c t i o no fm u l b e r 眄f l a v o n o i d si s 嬲f o l l o w s f i r s tt h em u l b e r r y w 舔 d r i e dt 0c o n s t 觚tw e i g h t 廿l e nc r u s h e d 吐l r o u 曲6 0m e s hp l u g d e f a 他dw i m p e 臼o l e 啪e t l l e r e x t r a c t e dw i m 劬锄o l a r e rr e c o v e r i n gt h ee t h 鲫o l r e m e l t e dm h o t w a t e r 觚de x 仃a c t e dw i 伽劬y l a c e t a t e t h el a s t 曲印w a st 0r e c o v e rt 1 1 ee t l l y l a c e 诅t e t h e nt 1 1 ee t h y l a c e t a t ee 仃a c to fm u l b e n e e m w 硒g a 如e d t h i sp a p e rs t u d i e dt l eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fe e m 拍dm f v 洫v i t r 0 t i l e a n t i o x i d 锄ta c t i v i t i e so fe e mw 硒e v a l u a 伽b yd e t e n n i n i n gt h es c a v e n g i n ga b i l 时o n d p p h 锄d o h t h ec 锄c e rp r e v e n t i o na b i l i 够o fe e mw a se v a l u a t e db ye x p l o r i n g 以s c a v e n g i n gn i 口i t e 锄db l o c k i l l gs t l t h e s i so fn i 仃0 s 锄i n ee 行e c t s t h ei i l h i b i t i o n e 毹c t so fe e mw e r et e s t e do na g l u c o s i d a s e 粕dx 锄t h i n eo x i d a s ei 1 1v i 们 nw 嬲 f o u n dm a t 也es c a v e n g i n ge 虢c to f 也e s et w ok i n d so fp o w d e r so n o hw 嬲m u c h s t r o n g e rt h 卸t h a to nd p p h 砚de e mc o u l dr e m o v en i t r i t e 锄db l o c kn i t r o s 锄i n e s y n t h e s i se 仃e c t i v e l y w h a t sm o r e e e mn o to n l yh a do b v i o u s l yi n h i b i 倒e 仃e c t so n 0 l g l u c o s i d a s e b u ta l s oh a ds i 鲥f i c 觚t l yi n h i b i t e de 行e c t so nx 锄t h i n e0 x i d a s e t h i ss t u d yh a dp 1 1 0 v e dm a te e mh a do b v i o u s l yi n h i b i t e di n t e s t i n a la g l u c o s i d a s e a c t i v 时o f r a t s s om r d l e rs t u d y v 髂f o c u s e do nt h ee 舵c t so f e e m 粕di t se 髓c to n b 1 0 0 dg l u c o 1 1 1 i ss t u d yh a dc h o s e n l ef i e l do ft h ee 仃e c t so fe e mo ng l u c o s e m e t a b o l i s mi ns t z i n d u c e dd i a b e t i cr a t s t h et y p e1d i a b e t i cr a t si n d u c e db ys t z w e r er 髓d o m l yd i v i d e di n t 05g r o u p s g i v e ni 加 a g a s 廿i c a l l yw a t c r g l i b e n c l a m i d ea n d m r i e ed i f r e r e n tl e v e lo fe e mr e s p e c t i v e l yo n c ead a yf o r3w e e l s 锄dm e a s u r e dt h e g l u c o l e v e lp e rw e e k t h er e s u l t s 砌i c a t e d 吐l a te e ms h o w e dn e g a t i v ee 仃e c t s0 n a b s t 阳c t r a i s i n go fb l o o dg l u c o s ea n dg l y c o s y l a t e d 鸵r 啪p r o t e i ni nd i a b e t i cr a t s i na d d i t i o n t h ew e i g h tl o s sw 舔a l l e v i 砷e da n dt h ei m p a i r e dg l u c o s et 0 1 e r 锄c ew a l ss i g n i f i c a n t l y i m p r o v e db yo r a la d m i n i s t r a 矗o no fe e mi nd i a b e t i cr a t s m o r ei m p o r t 锄t l y e e ma t t h ed o s eo f10 0m g k gb o d yw e i g h tc o u l di l l c r e a s es c m mm s u l i n1 e v e l md ia b e t i c 船 t s h i c h s u g g e s t e d 廿1 a te e mc o u l di 叫 r 0 v et 1 1 e a b n o 肌a l g l u c o s em e t a t 0 i i s mi i l s t z 狐d u c e dd i a b e t i cr a t s a r c rt h r e ew e e l s 臼e a t m e n to fh y p 洲c c m i ar a t s m er e s u l t ss h o w e dt h a t t i l r e c d o s e so fe e m10 0m 如 2 0 0m g l g 3 0 0m g 他b o d yw e i 咖c o u l ds i 弘i f i c 觚t l y r e d u c e dt h el e v e lo fu r i ca c i d e e mc o u l da l s oo b v i o u s l yr e d u c et h el e v e l0 fu r e a n i t r o g e n 觚dc ri nr a t s w h i c hi n d i c 锄e dt h a te e mh a dap o s i t i v ee 丘 e c to nk i d n e y s f u r t h e 彻o r e 如em i c r 0 s t m c t u r e s0 fk i d n e yc e l l sw e r eo b s e n e r e dw i n l 姗l s m i s s i o n e l e c n 0 nm i c r 0 s c o p y w h i c hs h o w e dm a te e mc o u i d 洒c r e a l s e d 也eq u 锄t 时o f m i t o c h o n d r i ar e p a i r e d l es h 印l eo fk a r y o n 觚dm i t o c h o n d r i a c o n 口 塔t i n gw i 幽k i d n e y c e l l so fr a t s a p 骶a t e dg r o u ps h o w e d k a r y o ni 丌e g u l 虬n u c l e a rp o r eb l 屿锄d m i t o c h o n ad e c r e e d n i sa l s oi n d i c a t e dt h a te e mh a dp o s i t i ei n f l u e n c eo n k i d n e yo fh y p e m r i c e m i ar a t s t h e nt 1 1 er e s e 钟c hf o c u s e do n 协ee 蝴i o np r o c e s so fm f v 锄dm a d eaf l o w c h 矾o fm f vp r 印觚a t i o np r o c e s s a c c o r d i n gt 0 吐l ec h a 鸡w e 锄a 1 z e dt h ee n e f g c o n s 啪p u t i o n n e x tw ea n a l y s e dt h ea c t i v i t i e so f m f vi r iv i 仃d 粕d l er e s u l t s s h o w e dt h 她 l em f vh a ds i m i l a rf e 砷j r e sw i me e m s h o w e d9 0 0 d 柚t i o x i d a n t a c t i v 时锄d9 0 0 da g l u c o s i d a s ee n z y m ea n dx a n m i n e o x i d a s ei n h i b i t i o n i r is 啪m a r y t h em a i nc 0 m p o n e n t so fn a v o n o i da g l y c o n e si 1 1h y d r 0 1 y s i so fe e m a n dm f vw e r eq u e r c e t i n 锄di m p f e r 0 1 b o mh a v es i g n i f i c 锄t 锄t i o x i d 锄ta c t i v i 吼 锄do b v i o u s l yi n h i b i t i o na b i l i t yo f 仉一舀u c o s i d a s ea i l dx 锄t h i n eo x i d a s e 访v i 仃1 0 1 n a d d i t i o n t h ee e mc o u l ds i g i l i f i c a n t l yr c d u c eg l u c o m e t a b o l i s mi n s t z i n d u c c d d i a b e t i c 豫t s a n dc o u l da l s 0r e d u c et 1 1 el e v e lo fu r i ca c i do f h y p e m r i c e m i ai nr i a t s k e yw o r d s m u l b e h y a n t i o x i d 柚t a g l u c o s i d 嬲e x 锄m i n e0 x i d a s c h y p o g l y c e m i c e 胞c t h y p e r u n c e m i a 目录 目录 前言 1 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 3 1 桑椹成分分析 3 2 桑椹黄酮类化合物印 l c 分析 7 3 桑椹粗黄酮的提取纯化及鉴定 1 1 4 桑椹粗黄酮 e e m 的成分与含量分析 1 2 5 小结与讨论 1 3 第二章e e m 体外生物学活性研究 1 4 1 材料与仪器 1 4 2 方法 1 4 3 结果与分析 1 8 4 小结与讨论 2 2 第三章e e m 对链脲佐菌素致高血糖大鼠的降血糖作用 2 4 l 材料 2 4 2 实验方法 2 4 3 结果与分析 2 5 2 i 讨论 3 1 第四章e e m 对腺嘌呤诱导的高尿酸血症大鼠的治疗作用 3 3 1 材料与方法 3 3 2 结果 3 4 3 小结与讨论 3 8 第五章桑椹黄酮精制工艺及体外活性研究 4 0 1 桑椹黄酮精制工艺研究 4 0 2 桑椹黄酮工业化效率分析 4 3 3m f v 体外活性实验 4 6 4 小结与讨论 5 2 全文小结 5 3 攻读硕士期间所获学术成果 5 4 综述 黄酮测定方法研究进展 s 5 参考文献 6 0 后记 6 5 前言 前言 桑椹系桑科植物桑 胁瑚口f 6 l 的干燥果穗 大多呈红紫色或黑色椭圆 形聚合果 长约1 2 5c m 汁盛甜酸 清香可口 营养丰富 我国桑椹资源丰富 几乎全国各地均有种植 桑椹入药历史悠久 是临床常用中药材 且历代本草对 其药用价值有详细记载 中药大辞典 有载 唐本草 中提到 单食 主消 渴 而 本草纲目 则补充有 捣汁饮 解酒中毒 酿酒服 利水气 消肿 等 药典 记载 功能与主治 补血滋阴 生津润燥 用于眩晕耳鸣 心悸失 眠 须发早白 津伤口渴 内热消渴 血虚便秘 桑椹已被列入卫生部公布的 既是食品又是药品 的药食同源产品之一 现代科学分析表明桑椹中含有丰富的营养成分 桑椹中含有1 9 种游离氨基 酸总含量2 9 3 0 0m g l g 其中7 种为必需氨基酸总含量6 4 0 2m k g 并且含有多 种微量元素 其中硒和维生素c 含量较蒯 近年来桑椹的药用成分及生物学活性越来越引起国内外学者的兴趣 2 桑椹 中含有丰富的活性功能成分 c h o i 等f 3 从桑椹乙醇提取物中分离出1 3 种非花青 素类多酚化合物 此外桑椹中富含白藜芦醇 1 和多糖类物质 6 此外 张莉等同 采用溶剂萃取发 而后经g c m s 分析 检测出多种挥发性化合物 桑椹的药用 价值更是研究的热点 桑椹提取物具有较好的抗肿瘤效果 引 抗氧化能力f 9 同时 桑椹还具有较好的降低血脂的作用 i o l 而其各本草中所记载的 主消渴 即对 血糖的调节功能方面的研究还很单薄 目前开发出有关桑椹降血糖功能的产品如 五子汤 糖宁等都是以桑椹为辅助药材 1 2 1 3 近期研究显示桑椹多糖具有一定的 降低血糖的效果 1 4 1 桑椹中含有丰富的黄酮类物质 而以往的研究表明其他植物 的黄酮提取物多具备较好的调节血糖的功效 1 5 那么桑椹黄酮是否也有此功效 呢 为此本文靶向桑椹黄酮的降血糖效果展开一系列的研究 代谢综合症与高尿 酸血症之间具有强相关性 而桑椹在降尿酸功效方面的研究还甚为单薄 源自其 他种属植物的黄酮 多具有较强的尿酸调节能力 1 6 桑椹黄酮是否同样具有调节 尿酸的能力呢 为进一步丰富传统中药桑椹的药用价值 本研究进一步围绕桑椹 黄酮的降尿酸作用开展研究工作 传统中药桑椹降血糖功效是否因其黄酮物质而作用 通过何种途径而作用 并且桑椹黄酮是否具有调节尿酸能力 这些问题的解决对促进桑椹资源的综合利 前言 用 丰富桑椹资源的开发途径 具有积极意义 本项研究受上海市经济发展基金 资助 本文将从四个方面展开 一 桑椹黄酮成分分析 提取纯化及鉴定 二 e e m 体外生物学活性研究 三 e e m 对s t z 致高血糖大鼠的影响 四 e e m 对腺嘌呤诱导的高尿酸血症大鼠的影响 五 m f v 制备及体外生物学活性研究 注 本研究受上海市经济发展基金资助 项目名称 崇明果蔬废弃物深度加工和综合利用技 术研究 编号 0 7 1 2 0 2 9 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 桑椹的营养成分和功能成分会因地域 品种 采摘时期和炮制方法产生较大 的差异 1 7 1 8 1 9 1 因此本文首先对实验室购得的桑椹营养成分和黄酮 皂苷 多糖 和多酚类等功能成分的含量进行分析 从而选定桑椹中较有价值的功能成分 为 目标成分的鉴定 提取 纯化和干燥等工艺流程做前提 更为其进一步为的生物 学活性的深入研究提供基础 l 桑椹成分分析 1 材料与仪器 1 1 实验材料与处理方法 桑椹购自安徽毫州中药饮片厂 烘至恒重 粉碎过2 0 0 目筛 1 2 实验药品 芦丁 中国医药集团上海化学试剂公司 一水合没食子酸 中国医药集团 上海化学试剂公司 菝葜皂苷元 美国s i 舯a 公司 其它试剂为国产分析纯 1 3 实验仪器 7 2 0 0 型可见分光光度计 上海市第三分析仪器厂 梅特勒 托利多b l 系 列电子天平 梅特勒 托利多仪器有限公司 r e 2 0 0 0 型旋转蒸发器 上海亚荣 生化仪器厂 t 6 新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用有限公司 d k s 2 4 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 x w 8 0 a 涡旋混合器 上海 医科大学仪器厂 等 2 实验方法 2 1 黄酮含量测定 2 1 1 测定原理 黄酮类化合物主要包含黄酮苷和黄酮醇苷两大类 黄酮类化合 物与硝酸铝作用后 生成黄酮的铝盐络离子 该离子呈黄色 并且其颜色的深浅 与黄酮含量相关 进一步回归计算黄酮含量 2 1 2 测定方法 2 0 以芦丁为对照品配制成标准溶液 反应终止后于5 1 0n m 比 色定量测定 制备标准曲线 而后根据样品的吸光度求出黄酮含量 1 精密称取芦丁4 0m g 置于1 0 0m l 容量瓶中8 0 乙醇溶解并定容 2 绘制标准曲线 分别量取0 0m l 0 2m l 0 4m l o 6m l o 8m l 1 om l 3 个重复 按照标准曲线项下的步骤进行测定 2 1 3 总皂苷含量测定 2 3 1 测定原理 皂苷在高氯酸等强氧化性酸的作用下脱氢 氧化后再与香草醛 加成 香草醛 高氯酸能与皂苷反应生成紫红色在特定波长有最大吸收峰 利用 比色法进行定量测定 2 2 1 2 3 2 测定方法 香草醛 冰醋酸 高氯酸显色体系测定 2 3 1 1 标准曲线制作 精密称取菝葜皂苷元对照品2 8m g 致1 0m l 量瓶中 加少 4 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 量甲醇溶解粉末 而后甲醇定容至刻度 摇匀 作为对照品溶液 精密量取对照 品溶液0 1m l 0 2m l 0 3m l o 4m l 0 5m l 0 6m l 分别加入干燥的具 塞试管中 水浴挥干溶剂 各加入新鲜配制的5 香草醛 冰醋酸溶液0 2m l 高 氯酸0 8m l 于6 0 恒温水浴中加热1 5m i n 取出 流水冷却2m i n 加冰醋 酸5m l 摇匀 随行试剂空白 按照分光光度法试验 在5 2 9 m n 处测定吸收度 以吸值度为纵坐标 菝葜皂苷元的浓度为横坐标 绘制回归曲线得出回归方程 最后计算皂苷含量 2 样品测定 桑椹提取物复溶 取2 0 0 0m l 置于具塞平底烧瓶中 加乙醇 5 0m l 再加盐酸7m l 水浴回流5h 冷却后 石油醚振摇提取5 次 4 0m l 2 5m l 2 5m l 2 5m l 2 5m l 合并提取液 挥干 残留物乙腈溶解 并转移 至1 0m l 量瓶中 加乙腈至刻度 摇匀 滤过 即得供试品溶液 精密量取供 试品溶液5m l 按照标准曲线制备项下的方法 测定吸光值 计算含量每个样 品三个重复 2 4 总多糖含量测定 2 4 1 方法 3 5 一二硝基水杨酸法f 2 4 3 5 二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件 下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物 3 氨基 5 硝基水 杨酸 在一定范围内 还原糖的量和反应液的颜色呈正比 2 4 2 葡萄糖标准曲线制作 精密吸取1 0m 咖l 葡萄糖标准液0 o 1 0 2 0 3 0 4 0 5m l 分别置于1 5 m m 1 8 0m m 试管中 并用蒸馏水定容到0 5m l 在上述试管中分别加入d n s 试剂1 0m l 于沸水浴中加热2m i n 进行显色 取出后用流动水迅速冷却 各加 入蒸馏水4 5m l 摇匀 在5 4 0n m 波长处测定光吸收值 以o 5n 儿蒸馏水代替 葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点 以葡萄糖含量 m g 为横坐标 光吸收值为纵坐标 绘制标准曲线 2 4 3 样品中还原糖的提取 准确称取0 5g 桑椹样品 放在1 0 0m l 烧杯中 加入4 0n 儿蒸馏水 混匀 于 8 0 恒温水浴中保温lh 不时搅拌 使还原糖浸出混 过滤 将滤液全部收集 在5 0m l 的容量瓶中 用蒸馏水定容至刻度 即为还原糖提取液 2 4 4 样品总糖的水解及提取 准确称取0 5g 桑椹样品 放在锥形瓶中 加入6m o 儿h c l l om l 蒸馏水1 5m l 在沸水浴中加热0 5h 水解毕 冷却至室温后以6nn a o h 溶液中和至溶液呈中 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 性 过滤取滤液定容到1 0 0m l 混匀 即为稀释1 0 0 倍的总糖水解液 用于总 糖测定 2 4 5 样品中含糖量的测定 精密吸取样品溶液各o 5m l 置于1 5 姗 1 8 0m m 试管中 再分别加入d n s 试剂 o 1m l 加完试剂后 于沸水浴中加热2m i n 进行显色 取出后用流动水迅速冷 却 各加入蒸馏水4 5m l 摇匀 在5 4 0 姗波长处测定光吸收值 测定后 取 样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量 2 4 6 多糖含量计算 多糖含量 总糖 还原糖 2 5 花青素含量测定 2 5 1 原理 视差法 2 5 1 花青素是植物体内广泛分布的色素之一 在植物中多以 糖苷形式存在 属黄酮类化合物 花青素在不同的p h 条件下 呈现不同的颜色 且颜色深浅与花青素含量成正比 利用花色苷和黄酮的结构特性 当p h 为1 o 时 二者在5 1 0n m 波长处均有最大吸收峰 而当p h 为4 5 时 花色苷转变为无 色的查尔酮形式 在5 1 0n m 波长处无吸收 用视差计算溶液中总花色苷含量 2 5 2 方法 移液管吸取2r n l 样品液 分别用p h l 0 0 2m o l 几k c l 0 2m o 儿 h c l 2 5 6 7 v v 和p h 4 5 0 2m o 儿n a a c 3 h 2 0 0 2m o 儿h a c 1 1 v 的 缓冲液稀释至2 0m l 混匀 以2m l 相应的溶剂加1 8m l 的相对缓冲液中作为 空白对照 分别在5 1 0m 和7 0 0n m 处测定吸光值 2 5 3 花色苷含量计算方法 总花色苷含量 以矢车菊素 3 葡萄糖苷 按下式计算 4 l o 一4 册1 o 一 4 5 l o 一4 朋4 5 彳c 孢g g 4 4 9 2 1 0 y 2 6 9 0 0 朋 其中 v 提取液总体积 m l n 卜 取样量 g 2 6 9 0 旺矢车菊素 3 葡糖糖苷的摩尔消光系数 4 4 9 2 一矢车菊素 3 葡糖糖苷的摩尔分子量 2 6 数据处理 数据以i s d 表示 用s p s s 软件进行一维方差分析 o n e w a y a n o v a 组间 进行多重比较 p 0 0 5 为差异显著 p 0 0 1 为差异极显著 3 实验结果与分析 6 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 表1 1 桑椹主要功能成分含量 t a b 卜1t h ec o n t e n t so f 劬c t i o n a lc o m p o n e n t si i lm u l b e n y 注 黄酮含量芦丁干重表示 多酚含量以没食子酸干重表示 多糖含量以葡萄糖干重表 示 n d t e n et o 协1n a v o i d s p o l y p h 饥o l s 锄dp o l y 鼢c c h 撕d e sc o n t e l 俺w e 他p r e s t e dw i 伍 砌nd l yw e i g h t m gg a l h ca c i dd d rw e i g h ta n dg l u c ed 巧w e i g h t 由表1 1 可得 桑椹含有丰富的功能成分 其中 多酚和黄酮类成分在头芽 原汁中含量较高 多糖虽然含量挺高 但大部分为纤维素等不溶性多糖 皂苷类 含量较少 也可能是皂苷苷元和菝葜皂苷不同 故而显色反应不明显 2 桑椹黄酮类化合物h p l c 分析 l 仪器与试剂 高效液相色谱仪 a 鲫e n t1 1 0 0s c n e s 电子天平 s 锄r i u s 公司b p 2 1 l d 索氏抽提器 甲醇为色谱纯 国药集团化学试剂有限公司 盐酸为分析纯 上 海试剂四厂昆山分厂 磷酸为分析纯 上海试剂四厂昆山分厂 水为超纯水 杨梅素对照品 m r i c c t i n s i g m a 公司 槲皮素对照品 上海恒信化学试剂有限 公司 山柰素对照品 s 洫i w e s t 公司 异鼠李素对照品 中国药品生物制品鉴 定所 批号 1 1 0 8 6 0 2 0 0 2 0 5 桑椹 安徽毫州中药饮片厂 2 试验方法 2 1 色谱条件 k r o m 嬲钉c 1 8 2 5 0 4 6m m 5 m 柱 1 妇c h e m i c a l sa b b r e w s t e r n y u s a 流动相甲醇 0 4 磷酸溶液 6 0 4 0 2 6 1 柱温为室温 流速为1 0m l m i n 检测波长为3 6 8 姗 进样量为1 0 儿 2 2 2 标准曲线的制备 2 7 精密称取对照品杨梅素2 9 0 0m g 槲皮素2 6 0 0m g 山奈素1 7 0 0m g 异鼠 李素1 4 0 0m g 定容至2 5m l 稀释成各个浓度后分别上样 以峰面积为横坐标 7 酮苷元的含量 分别计算二者的回收率 3 实验结果 3 1 标准曲线制定 杨梅素 槲皮素 山柰素 异鼠李素分别在1 8 l 5 8 0 0 烬 m l 1 1 6 3 5 2 0 0 嵋 m l 1 1 0 6 3 4 0 0 峙 m l 0 8 8 2 8 o o 烬 m l 1 内峰面积与浓度呈良好的线性 关系 见表1 2 8 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 杨梅素 槲皮素 山柰素 异鼠李素 y 5 1 1 0 6 x 一1 0 3 2 2 y 4 6 1 5 l x 一7 7 2 7 4 y 2 2 9 4 4 x 一2 8 2 3 9 y 5 7 9 3 4 x 一5 6 7 3 1 l 誓 l r 2 1 r 2 1 r 2 1 1 8 1 5 8 0 0 1 6 3 5 2 0 0 1 0 6 3 4 0 0 0 8 8 2 8 o o 3 2 水解时间的选择 水解时间分别设定为 1 5m i n 3 0m i n 6 0m i n 9 0m i n 1 2 0m i n 其总黄 酮含量分别为1 6 2 2m g g 1 6 6 6m g 岔1 1 7 3 8m g g 1 7 3 6m g g 1 7 3 8m g g 可见6 0m i n 水解时间总黄酮苷元含量已经达到最大值 所以本实验水解时间选 择6 0m i n 3 3 对照品及样品的 l c 图谱 按 2 1 色谱条件 将4 个对照品一起进样 与样品的色谱作对照 比较各 个峰的保留时间 找出保留时间相近的峰 再将对照品加入样品中 观察样品的 色谱图的变化 以确定样品中的黄酮苷元的种类 见图1 1 2 3 尺八 i l 图1 1 对照品及样品的肿l c 图谱 a 对照品 b 样品 1 杨梅素 2 槲皮素 3 山柰素 4 异鼠李素 f i g 1 lc h r o m 纳o g 豫m so f n l es t a n d a r ds o l u t i o n 锄dm es 锄p l es o l u t i o n a r l e f e r e n c es 咖d 甜 d b h y d r o l y z e d s 锄p l e 1 哪y r i c e t i n 2 q u e r c e t m 3 k 神m p t e r o l 4 一i s o f h 玎蛆e t i n 9 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 3 4 样品中苷元含量 1g 桑椹水解之后含有的槲皮素 山柰素的量分别为1 2 8 4m g 和0 2 4 8m g 其r s d 分别为1 4 8 和2 7 0 两种苷元的总量是1 5 3 2m g r s d 为0 9 6 见表1 3 表1 3 样品含量测定 1 a b 1 3s 锄p l ed e t e 肌i n a t i o n 萨5 3 5 稳定性实验 连续在1h 2h 4h 8h 2 4h 进样 测定每lg 桑椹总黄酮苷元的含量分 别是1 7 8 4m 昏1 7 7 4m g 1 7 7 9m g 1 8 1 0m 卧1 7 7 0m g 可见在2 4 小时以内 水解液中总黄酮苷元含量基本不变 3 6 精密度试验 取一定浓度的槲皮素和山柰素标准品分别连续进样5 次 分别计录其峰面积 结果其r s d 分别为1 5 8 和1 4 4 3 7 加样回收实验 在己知含量的样品液中分别加入一定量的槲皮素 山柰素对照品溶液 按 2 1 色谱条件分别测定2 个苷元的含量 槲皮素和山奈素的回收率分别为 9 8 1 0 和1 0 2 2 3 r s d 分别为1 o o 和1 2 6 见表l 4 表1 4 加样回收率 1 a b 1 4i 沁s u l t so f 他c 0 v e r ye x p e r i m e n t 萨5 4 讨论 黄酮类化合物在紫外3 6 8i l i l l 2 6 0n m 处 均具有较好吸收 2 9 而在2 6 0i l n l 下 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 极易受到影响 杂峰较多 使样品中黄酮的峰分辨率下降 本文试验选择3 6 8 姗 作为测定波长 所测黄酮吸收峰明显 分辨率高 并且基线平稳 在选择流动相 时 作者曾摸索甲醇 水的几种不同比例 结果提示 甲醇 水做为流动相时 虽然各个对照品分离效果很好 但洗脱时间过长 另外 作者还分析了甲醇 0 4 磷酸溶液比例条件 7 0 3 0 6 0 4 0 5 0 5 0 结果表明在比例为6 0 4 0 时 对照品各峰分离较完全 时间相对较短 实验结果显示 在图1b 中样品色谱图中a b 两峰 随着水解时间的延长 a 峰高度下降而b 峰高度显著增加 提示b 峰处物质可能是a 峰处物质的水解产 物 由于桑椹中含有丰富的花色素类物质 极性较强 保留时间较短 并且紫外 吸收峰也落在3 6 8 啪范围内 因此该类物质极可能是花色素类 l 吖等曾用 核磁共振法和快速原子轰击质谱测定法测定桑椹红色素种类及含量p o 结果显 玉示 桑椹红色素由矢车菊素 3 o a d 葡萄糖苷和矢车菊素 3 o a d 芸香糖苷组 成 则a 可能是以上两种单体组成的混合峰 而b 则可能是矢车菊素的母核峰 具体有待进一步研究 3 桑椹粗黄酮的提取纯化及鉴定 1 材料 试剂与仪器 桑椹 来源同前 芦丁标准品 上海试剂二厂 其它试剂均为国产分析纯 7 2 0 0 型可见分光光度计 上海市第三分析仪器厂 梅特勒 托利多b l 系列 电子天平 梅特勒 托利多仪器有限公司 i 迮 2 0 0 0 型旋转蒸发器 上海亚荣生 化仪器厂 t 6 新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用有限公司 d k s 2 4 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 x w 8 0 a 涡旋混合器 上海 医科大学仪器厂 等 2 试验方法 2 1 乙醇提取工艺确定 依次选取乙醇浓度 提取温度 提取次数和提取时间四种主要的黄酮提取影 响因素进行单因素实验 而后根据单因素实验结果选取较佳提取工艺 2 2 桑椹粗黄酮得率实验 分别取1 0 0g 桑椹粉末 经石油醚充分除脂 按照以上试验确定的提取纯化 方法进行试验 得到桑椹粗黄酮 e e m 重复三次 冷冻干燥 称重 1 1 第一章桑椹成分分析和桑椹粗黄酮提取 纯化及鉴定 3结果 3 1 桑椹粗黄酮 e e m 的制备 选取一定量的干燥桑椹粉碎过6 0 目筛