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聂燕芳中山大学硕士拳位论文：t 4 2 m 突爱型e p s p 台成酶基崮醇矗隆和醋究 t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶基因的克隆和研究 遗传学 硕士生；聂燕芳 指导教师：徐培林 摘要 鼙甘麟( g l y p h o s a t e ) 是一种广谱性有机磷类除草剂。因具有高效、对入畜 低毒、低残留、不破坏生态环境等优点，已成为全球广泛使用并最受信赖的除草 刺。它通过竞争性抑制植物和细菌莽草酸途径中的关键酶一5 前醇式丙酮酰莽草 酸3 磷酸合成酶( e p s p 合成酶) 而起杀伤作用。草甘膦作用于杂草的同时也非 选择性伤害农作物，因此培育抗草甘瞵作物已成为全球研究的热点。通过遗传工 程的方法克隆相关抗性基因，并将之旨八植物中使其获得抗草甘膦性状是目前培 育抗草甘麟作物最霄效的途径。 本实验室以大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) 和鼠伤门氏杆菌( s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ) 的a r o a 基因为横扳，通过基圆优纯技术获得了四个高草甘瞵抗性的 重组或突变e p s p 合成酶，其中两个突变酶都发生了t 4 2 m 突变。在此基础上， 率论文通过定点突变方法对走脑杆菌野生型a r o a 基因及以基因优化技术获得的 a r o a m l 基因作进一步改造，使其编码的e p s p 合成酶的第4 2 位氯基酸残基由苏 氨酸置换为甲硫氨酸。对获衙的两个t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶的酶动力学性旗 研究表明，与相应对照相比，t 4 2 m 突变酶的酶活力提简o 1 3 7 倍，j f p e p i 值 降低7 8 5 结，k t ig l 蛐。l 值增大了o 0 6 - - 3 0 7 倍，从而使草甘膦抗性得到币同 程度的提琏。t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶的研究将为探索酶结构和功能的关系以 及革甘磷与酶作用的模式提供理论依摆。 选用c a m v 3 5 s 启动予n o sp o l y a 终止予系统，将t 4 2 m 突变型e p s p 台成 獬基匿与烟草引导欣t s p 序列融合后，构建到双元表达载体p c a m b i a l 3 0 0 中t 聂燕芳中山丈学砸士学位诒芷t 4 2 m 突变型e p s p 台成酶蒜越的克隆和科究 以农杆菌为介导转化烟草。抗性榆捌结果显示转入t 4 2 m 突变型e p s p 台戒酶的 烟草能表现出相应的草甘瞵抗性，并且能够耐受商业推荐剂量草甘膦的处理，这 为越后培育抗革甘膦农作物提供了可选择的抗性基斟。 关键词：草甘膦e p s p 合成酶，t 4 2 m 突变。转基因烟草 聂燕芳中山大学硕士学位论史；t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶基因的克强和研究 c l o n i n ga n dr e s e a r c ho f a t 4 2 ms u b s t i t u t i o n i ne p s ps y n t h a s e g e n e t i c s n a m e ：y a n f a n gn i e s u p e r v i s o r ：p e i l i nx u a b s t r a c t g l y p h o s a t ei san o n - s e l e c t i v eb r o a d - s p e c t r u mh e r b i c i d et h a ti n h i b i t s5 - e n o l - p y r u v y l - s h i k i m a t e 一3 一p h o s p h a t es y n t h a s e ( e p s ps y n t h a s 曲，ak e ye n z y m ei n t h e a r o m a t i ca m i n oa c i db i o s y n t h e t i cp a t h w a yi nm i c r o o r g a n i s m sa n dn a n t s m u t a n t so f c l a s s ie p s ps y n t h a s ew i t hr e s i s t a n c et og l y p h o s a t ew e r ep r o d u c e di nap r e v i o u s s t u d yu s i n gt h es t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s sw i t ha r o ag e n ef r o ms ：t r p h i m u r i u ma n d c o l i t w oo ft h e s em u t a n t ss h a r e dac o l r t n l o na m i n oa c i ds u b s t i t u t i o n t 4 2 m n e a r t h eh i n g er e g i o nb e t w e e nt h el a r g eg l o b u l a rd o m a i n so f e p s ps y n t h a s e 。 u s i n gs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，w ep r o d u c e dt h et 4 2 mm u t a n t sw i t h o u t h e o t h e ra m i n oa c i dc h a n g e do f t h eo r i g i n a lm u t a n t s t h et 4 2 ms u b s t i t u t i o na l o n e p r e d u e e de n z y m e sw i t ha7 0 一t o8 5 - f o l dd e c r e a s e dk m p e p ia n da0 0 6 t o3 0 7 - f o l d i n c r e a s e d 飘目，忡m 1c o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 t h e s er e s u l t sp m v i d em o r et e s t i m o n y f o rt h ep o w e r f u la p p r o a c hf b ft h ep r o t e i ne n g i n e e r i n gb yt h ec o m b i n a t i o no f d i r e c t e d e v o l u t i o na n dr a t i o n a ld e s i g n t h em u t a n t sw e r ef u r t h e re n g i n e e r e dw i t hat o b a c c oc h l o r o p l a s tl e a d e ds e q u e n c e ， a n dt h e np l a c e di nt h eb i n a r yv e c t o rp c a m b i a l 3 0 0f o ra g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d g e n et r a m f c rt ot o b a c c o ( n i c o t i a n at a b a c u me v , x a n t h o t r a n s g e n i cp l a n t sw e r e 瑚 聂燕芳中山大学颂士学位论文：t 4 2 m 突变型e p s p 台成酶基甩的克睡和研究 r e g e n e r a t e dw i t hg l y p h o s a t er e s i s t a n c e i np r o p o r t i o nt ot h ee n z y m e s s p e c i f i c a c t i v i t i e sd e t e r m i n e df r o mb a c t e r i a le x p r e s s i o n ，s u c hm u t a n t sw i l lb ei n s t r u m e n t a lf o r t h eg e n e r a t i o no f t m n s g e m cc r o p sr e s i s t a n tt ot h eh e r b i c i d e k e y w o r d ：g l y p h o s a t e ，e p s ps y n t h a s e ，t 4 2 ms u b s t i t u t i o n ，t r a n s g e n l cp l a n t s 聂燕芳中n j 大学硕士学位论克：t 4 2 m 完变型e p s p 合成酶基西曲党隆和研究 第1 章前言 1 1 除草剡草甘腾的特点 田闻杂草的竞争效应不仅降低了农作物的产量和品质，褥且易引起种予混 杂，给大型的机械耕作带来困难【1 】。人t 除草作为最原始的除草方法，耗费劳力， 效率低下1 2 1 ，远不能适应现代农业发展的需求。上世纪四十年代以来，备种类型 的化学除草剂相继被开发研制成功，并广泛地应用于草害的防治。 草甘磷( n - p h o s p h o n o m e m y l g l y c i n e ，g l y p h o s a t e ) 是一种广谱性有机磷类除 草剂，其商业名称为r o u n d u l 归，1 9 7 1 年由荧国孟山都公司( m o n s a n t o ) 开发 研制成功。因其具有高效、对人畜低毒、低残留、不破坏生态环境等优点，已成 为全球广泛使用并最受信赖的除草剂 3 , 4 1 。 草甘膦的广谱和高效，主要基丁二它具有极好的内吸传导性能【”。喷灌于植物 攀叶上的草甘膦，被植物体吸收并迅速输导至根部，杀灭一些其它除草剂难以防 豫的靠根系繁殖的多年生杂草及小灌木。一般而言，一年生杂革在喷洒革甘磷后 2 - 4d ，多年生杂草在喷洒后7 1 0d 即表现出明妊受害症状：失绿、发黄、枯萎 以至死亡。 草甘瞵对人畜毒性极小，毒理学研究表明大白鼠急性n n 的l d 5 0 = 4 3 2 0 m e , 堍，兔的m l d 7 9 4 0m e , k g ，鱼的e c s om o op p m ；并且，草甘膦不会在动物组 织或农作物上产生积累效应。目口还没有证据表明草甘膦会对人体产生毒性，因 此e p a 将它归于第五类除草剂，即对入娄无致癌致畸致突变等作用的一类环保型 除草剂1 6 。 草甘麟落入士壤后，被土壤颗粒牢牢吸附，而且容易被土壤微生物降解为氨、 无机磷和二氧化碳 3 l ，降解产物可以被细菌等重新利用，不会造成环境污染问题。 正是由于草甘瞵这种卓越的滁草性能和趣好的环境相容性，使其自乇十年代 中期商品化以来，产量迅速增长，销最逐年攀升，应用范围不断扩大，成为真正 的全球性除草剂。 聂燕芳中山大学硬十学位论文t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶基因的克隆和研究 1 2 草甘膦的作用机理 1 2 1 草甘膦作用的靶酶是e p s p 合成酶 j a w o r s k i 在研究根瘤菌( r h i z o b i u mj a p o n i e u m ) 和浮萍( l e m n ag i b b a ) 时 发现，添加芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，可扭转草甘膦的抑制作用，因此提 出草甘膦可抑制芳香族氨基酸的台成n a m r h e i n 在研究产气杆菌( a e r o b a c l e ra e r o g e n e s ) 和植物紫堇属( c o r y d a l i s s e m p e r r i r e n ，) 的悬浮培养物时发现，在培养基中添加1 0m m o l l 草甘膦后，光 论细菌或植物都可以积累高水平的莽草酸，而5 烯醇式丙酮酰莽草酸3 磷酸合 成酶( 5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，e p s ps y n t h a s e ) ( e c 2 51 1 9 ) 的酶活则增加了1 0 3 0 倍，从而证实了草甘膦作用的靶酶是莽草酸代谢途径中的 e p s p 合成酶1 8j 。 r o g e r s 和c o m a i 则在基因水平上证实了草甘膦作用与e p s p 合成酶的相关 性。r o g e r s 等从大肠杆菌( t c o l i ) 中克隆到e p s p 合成酶酶基因，并将其连接 到表达质粒中，转化大肠杆菌( e , c o l i ) ，结果使转化菌产生的e p s p 合成酶量 增加1 7 倍抗草甘膦能力也随之增强8 倍【9 】；c o m a i 等用乙基甲磺酸诱导鼠伤 寒沙门氏杆菌阻t y p h i m u r i u m ) ，获得抗草甘膦的突变株，并从中克隆到e p s p 合 成酶基因，再将该突变基因转入大肠杆菌( k c o l i ) 中，也使转化菌获得较强的草甘 膦抗性“1 。以上研究表明，细菌的草甘膦抗性与e p s p 合成酶的量有关，而 e p s p 合成酶基因的突变也能提高草甘膦抗性。 以上的生化、生理和遗传实验证明草甘膦是通过抑制5 - 烯醇式丙酮酰莽草酸 - 3 - 磷酸合酶( e p s p 合成酶) ，从而抑制芳香族氨基酸的生物合成而起作用的。 1 2 2e p s p 合成酶在莽草酸途径中的催化作用 莽草酸途径存在于植物和微生物中，生成的分支酸参与一系列重要芳香型植 物代谢物的生物合成，包括必需氨基酸( 苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸) 、四氢 叶酸、泛醌( 辅酶o ) 和维生素k 等一弼估计，占植物干重3 5 甚至更多的物 质是通过莽草酸途径合成的。并且该途径只存在于植物和微生物中，其它生物必 须通过进食来获得生长必需的芳香旗化合物f 6 i 。 聂燕芳中山大学硕圭学位艳立：t 4 2 m 突变型e p s p 台成酶基嗣的克隆和研究 e p s p 合成酶是莽草酸逮径中的一个关键酶”目，其催化磷酸烯醇式丙酮酸 ( p h o s p h o e n o i p y r u v a t e ，p e p ) 和莽革酸一3 一磷酸( s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t e ，s 3 p ) 反应生成5 一烯醇式丙酮酰葬草酸一3 一磷酸( 5 * e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e 一3 一两o s p h a t e ， e p s p ) + 并释放无机磷( 图1 - 1 ) 。 4 鲁州。 a 。￥彬q 丫 氛酥b帅 豳1 - ie p s p 合成酶催化底物s 3 p 和p e p 生成e p s p 的厦应 1 弼 1 2 。3 草甘膦对e p s p 合成酶酶竞争性麴制作用 勺“一一盘 。奉定。一畦 ，p m v d m m h p w - m m d - ” 图1 - 2 草甘麟对e p s p 台成酶的竞争性抑制作用”钏 草甘膦分子结构比较简单。化学名为n 甲基磷酸h 鲺酸，是p e p 过渡态的 结构类似物，如强1 2 所示。在e p s p 合成酶催化底物s 3 p 与p e p 厦应时，草 犬 文氛 聂燕芳中i h 大学硕士学位论文：t 4 2 m 突变登e p s p 合或群基因豹克隆和碍f 究 甘膦竞争性地占据p e p 的结合位点，井弓e p s p 合成酶和s 3 p 形成酶s 3 p 草甘 瞵三元复合物，从而抑制e p s p 合成酶的催化活性 1 6 , 1 7 。 1 3 草甘麟与e p s p 含成酶的作用模式 1 3 1e p s p 合成酶的结构特点 s t a l l i n g s 等通过x 射线晶体衍射技术，研究了大肠杆菌e p s p 合成酶豹三级 结构【1 ”。研究表明，酶蛋白由两个大小相似的球形结构域组成，第一个结构域包 括2 0 - 2 4 0 位氨基酸残基，第二= 个结构域包括l 9 和2 4 1 4 2 7 位氨基酸残基，蛋 白的n 端和c 端都位于同一个结构域中( 图1 3 a ) 。两个球形结构域各由三个 结构相似的亚单位构成，亚单位为六折叠结构，包括两个a 螺旋和酬个8 折叠( 图 1 - 3 b ) ；n 螺旋平行排列，在两个结构域间形成正电荷区，吸引阴离子配基。这 两个结构域由两段多膝形成的弹性双绞链区相连，可以旋转靠近，形成酶的活性 中心。 b a 图1 3 大肠杆菌( e c o l i ) 的e p s p 台成酶结构示意图1 8 1 a 为e p s p 合成酶的三级结构示意阐；b 为e p s p 台成酶的亚单位二级结梅示意翻 f i g 1 - 3s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h ec h a i nt r a c i n go f k c o l ie p s ps y n t h a s e ( a ) a n dt h et o p o l o g yo f t h ep r i n c i p a le l e m e n t so f s e c o n d a r ys m a c t u r c ( b ) 4 聂燕芳中谴i 大学碗士学位谁立t 4 2 m 突变照e p s p 合成酶基因的克隆年玎研究 采用化学修饰或定点突变技术研究e p s p 合成酶9 f f - 1 0 2 位高度保守的氨基 酸残基【”l ，结果显示底物与酶的结台位点分布丁两球型结构域相近的表面，氨基 酸残基k 2 2 、r 2 7 、r 1 0 0 与p 1 0 1 是酶与底物s 3 p 的结含位点；而g 9 6 、r 1 2 4 、 h 3 8 5 、 c 4 0 8 和k 4 1 1 剩可能与酶和底物p e p 的结合有关”“1 。另外，通过核 磁茫振技术( n m r ) 对蛋自n 端的化学位移分析发现，氨基酸残萋s 2 3 、s 1 9 7 及y 2 0 0 也与酶和s 3 p 的结合有关口j 。 1 3 2 革甘膦与e p s p 合成酶的作用模式 研究表明，大胎杆菌e p s p 台成酶的三级结构与u d p - n 己酰葡糖胺烯醇式 葡酮酰转移酶( u d p - n - a c e t y l g l u c o s a m i n ee n o l p y r u v y lt r a n s f e r a s e ，m u r a ) ( e c 2 5 1 ，7 ) 极为相似。m u r a 是唯一已知的另一以p e p 为底物并与e p s p 台成酶具 有相似催化$ l 理的酶，它在生物体内参与纲藩融聚糖的合成。对m u r a 的x 射 线晶体街射研究显示每m u r a 与底物u d p - n - z - 酰翱槠胺或其抑制剂磷霉素结 合时，构象发生匿犬变化，两个球型结构城相置靠近，从“张弛”( o p e n ) 状态 变为“闭和”( d o s e ) 状态口”。 早期对e p s p 合成酶前体蛋白在转运肽引导下进入叶绿体的研究中发现前 体e p s p 台成酶与s 3 p 和草甘膦形成酶- s 3 p - 革甘瞵复台物屠，不能通过时绿体的 质膜，暗示了这一三元复合物结构发生r 改变。列e p s p 合成酶进行蛩白酶降 解研究，结果发现e p s p 合成酶上j 配体形成合成酶s 3 p 草甘麟三元复合物詹，胰 蛋白酶对其的水解作用受到明显抑制：另外，和游离合成酶相比，三元复台物与 椅象敏感型单克隆抗体的亲和力下降2 0 倍旧。以上研究表明酶与配体缩合以厢 构象发生巨大变化。 鉴于e p s p 台成酶与m u r a 具有相似的三缓结构和催化作用，人们猜想e p s p 合成酶与底物或抻制剂草甘膦作用时，构象也同样发尘从“张弛”状态到“闭 和”状态的变化。s c h 6 n b r u r m 等对结合配体岳的e p s p 合成酶的x 射线晶体衍 射分析发现，e p s p 成酶与配体结合后，两个球犁结构域旋转运动，相互靠近， 在两结构域的夹缝形成酶的活性中心口”( 图l _ 4 ) 。 聂燕芳中山大学硕士学位论文，1 4 2 m 突变型e p s p 合藏酶基圜的克隆和研究 图l _ 48 p s p 合成酶的张驰和闭台构象示意豳瞄j 上端结构域包古2 0 - 2 4 0 位氨基酸残基下端结构域包含l 1 9 及2 4 1 , - 4 2 7 位氨基 酸贱基。a 为游离的酶( 张弛构象) = b 为结合s 3 p 和草譬麟的酶( 闭台掏象) ，其中 s 3 p 和草甘磷分子珏绿色和紫色的球棍骨架模型表示。 f i g 1 4c a r l o o no f e p s ps y n t h a s ei nt h eo p e na n dc l o s e dc o n f o r m a t i o nt o pd o m a i n ，r e s i d u e s 2 0 2 4 0 ；b o s o md o m a i n ，r e s i d u e s1 1 9p l u s2 4 1 , - 4 2 7 阻上研究可以证实，e p s p 台成酶与s 3 p 和草甘膦结合后，构象从“张弛” 状态变成“闭和”状态，但对于s 3 p 是否能单独引起该构象盼变化至今仍颇具争 议。s c h o n b r u n n 等对e p s p 合成酶s 3 p 二元复合物及酶- s 3 p 草甘膦三元复合物的 x - 射线衍射分析发现，两者的构象无明箍差异，因此认为s 3 p 与酶结合后，引 发酶构象由“张弛”变成“闭合”状态，并在夹缝区聚集正电荷。以吸引p e p 或草甘膦的负电荷基团嘲。但荧光光谱分析口。及n m r 研究吲则表明s 3 p 或草 甘膦都不能单独引起e p s p 合成酶构象的变化，二者同时与酶相互作用才引发构 象变化。 对e p s p 合成酶的荧光滴定研究显示，草甘膦不能与游离的e p s p 合成酶结 合，酶与底物结合时，首先形成e p s p 合成酶r s 3 p 二元复合物，然后才与孽甘膦 结合。因此，提高s 3 p 浓度反而加强了革甘膦对e p s p 合成酶的抑制作用”。但 对酶健反应的稳态动力学研究却认为革甘膦鞠s 3 p 与e p s p 合成酶的结合是随机 的，不存在先后顺序口t2 ”。 聂燕芳中山太学硕p 学位皓文：t 4 2 m 突爱型e p s p 台成酶基因的竟隆和研究 另外，对e p s p 合成酶酶健反斑的动力学研究还表明，革甘膦能与酶及反虚 产物e p s p 形成酶，e p s p 草甘膦三元复合物，是逆向反应中e p s p 的 # 竞争性抑 制物。这些结果暗示草甘媵与p e p 在e p s p 台成酶上的结合佼点有部分交叉，但 并不完全噩叠1 2 ”。 综上所述，e p s p 合成酶与配体作用时构象将从“张魏”状态变成“闭和” 状态，丽对于草甘膦是否参与引发e p s p 合成酶构象的变佬及其与酶的结合顺序 方面留有争议，还需要更多的研究和证据来证明。 1 4 草甘膦的代谢 1 4 1 草甘膦在微生物中的降解代谢 革甘瞵落入土壤后能迅速被土壤微生物降解，出于不同土壤中分布的微生物 群落不同，草甘膦降解的半衰期也有明露差异郾1 。根据降解中间产物的不同，土 壤微生物降解草甘膦的途径分为两条i 肌氨酸途经和氨甲基磷酸( a m i n o m e t h y l p h o s 曲o n a t c ，a m p a ) 途径，3 ”。 在肌氨酸途径中，草甘膦的c - p 键断裂，生成肌氨酸( n - 甲基甘氨酸) ，进 一步氧化脱氢后转化为甘氨酸。以这种方式降解草甘麟的细菌，包括假单胞菌 p s e u d o m o n a s s p p g 2 9 8 2 1 3 3 j 和节杼菌( a r t h r o b a c r e rs p g l p - i ) f 3 0 等。 在氨甲基磷酸途径中，革甘磷的c - n 键断裂，生成a m p a 后进入代谢循环。 已知黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms i s g d i ) 睁、产碱杆菌( a l c a l i g e n e ss pg l ) 口5 1 等 微生物以这种途径降解草甘麟。 另外，j a c o b 等研究瑕单胞秆菌p s e u d o m o n a ss nl b r 降解草甘麟能力时，在 代谢物中同时检测到a m p a 和甘氨酸成分，说明在同* 种菌中也可能同时存在 两种草h 膦簿解途径d “。 1 4 2 草甘膦在植物中的降解代谢 研究表明在大豆、小麦、烟草和蕞米中存在不同稳度的草甘瞵代谢，a m p a 是唯一能检测到的代谢产物0 1 。用草讨膦处理小麦、玉米和豌豆，可以导致谷胱 聂燕芳中山大学硕士学位论文：t 4 2 m 突变墼e p s p 合城酶基强的克隆祁研究 甘肽- s 一转移酶活性的增加。由于谷胱甘肽及谷胱甘肢s 砖 移酶在除草剂代谢中 起重要作用，因此这代谢系统可能也参与了草甘膦的降解1 3 8 。值得注意的是， 植物对草甘麟的代谢并不能使其获得革鹭膦抗性；相反，植物对磺酰脲类f 、三 嗪类h 0 1 和二吡啶类”。慷草剂的代谢可使其获得相应的除草剂抗性。 1 5 抗草甘膦植物的培育 1 5 1 直接筛选法获得抗革甘膦植物 草甘麟在杀灭杂革的同时，也非选择性伤害作物，因此不能直接用于大规模 田间除草，使用时间受到限制。通过生物技术研究发展抗除草剂作物，可方便地 控制杂草，降低除革剂的使用成本m l 。早期人们试图通过直接筛选法获得抗草甘 膦植物但收效甚微。 目前，适用于整体檀株水平上筛选革甘磷抗性的植物只有酉脉根h ”、多年生 黑麦草 4 4 1 及野生型多年生大豆h “。通过燕体植株筛选法获得抗革甘膦多年生黑 麦革是仅寄的凡个成功用于商渡生产的例子之一：挑选对草甘瞵是有较高自然耐 受性的植株，通过连续的选择压力筛选，十一代后才获得抗草甘膦黑麦革。在每 一代选择中均使用高浓度草甘膦处理，使9 5 巾体死亡存活豹植株种子进入下 一代筛选。但用这种方法获得抗草甘膦植株+ 需要使用离浓度除草剂处理并经过 长时闰选择弹】。 除了对整体植株的直接筛选外，人们也尝试对植物细胞或组织进行直接草甘 麟筛选。通过在细胞悬浮培养中，逐渐增大草甘膦浓度来获得抗草甘磷植株。目 前已经筛选分离出胡萝l - h e 、番茄 4 7 、矮牵牛【4 8 】、烟草【4 9 1 和菊苞口1 等草甘膦抗 性细胞系。研究发现草甘膦抗性的获得与细胞内e p s p 合成酶的过量表达有关。 在矮牵牛、烟草和胡萝h 的突变细胞系中，酶的过量表达是e p s p 台成酶基因扩 增的结果h 8 - 乱，5 2 l ；而在cs e m p e ，v i r e h s 细胞系中酶的过量表达刚由基因的高 水平转录所引起的。 但是，直接筛选获得的抗性细胞系在无草甘瞵选择压韵培养基上继代培养 后，会导致e p s p 台成酶基因拷贝数的丢失或草甘瞵抗性的降低 ”l 。而且，抗性 细胞系通常难以分化再生植株 4 7 ，”i 。 聂燕芳中山大学预士学托论文：t 4 2 m 突变型e p s p 台成酶基因的克隆和研究 1 5 2 遗传工程方法获得抗草甘膦植物 直接对整体檀株或植物绷胞进行多轮革甘瞵筛选来获得抗性撼株收效甚微， 现在主要是通过遗传工程的方法克隆抗性基因，并将之导入植物中使其获得抗草 甘媵性状。在研究草甘膦抗性植物时，通常稠耀三个遗传转化机理：1 过壁表 达e p s p 合成酶，即靶髓点扩增机制；2 导入对革甘麟具有低亲和性的e p s p 合 成酶基因，即靶位点修饰机制；3 导入革甘滕降解基因，即代谢失活机制”1 。 l 。5 2 1 过量表达e p s p 台成酶 s h a h 等从过量表达e l ，s p 合成酶的矮牵牛抗草甘膦细胞系中分离了e p s p 合成酶的e d n a 克隆，并与c a m v 3 5 s 启动子连接成嵌合基因岳转化矮牵牛， 在含0 5 m m o l ，l 草甘膦的培养基中，转基凶植物的e p s p 合成酶酶活增加4 0 倍， 具有一定草甘瞵抗性q 。d a n i e l l 等i 三l 烟草载体或通用载体将矮牵牛e p s p 台成酶 基因转入烟草叶绿体基因组中( 每个细胞5 0 0 0 1 0 0 0 0 拷贝) 。e p s p 台成酶在叶 绿体中的过最表达使转基因植株获得高草h 瞵抗性，而牲这种质体转化的外源基 因不经花粉传播，减少了耐草甘磷基因经灭然授粉流入近缘杂草群体的风险”。 1 5 2 2 导入对革甘膦具有低亲和性的e p s p 合成酶基因 通过在植物中过量表达e p s p 合成酶方法获得的草甘膦抗性植物，其抗葶甘 膦水平通常不足以酣受商业推荐剂量纳草甘媵处理1 5 6 1 。而经过特定修馋或突变的 e p s p 合成酶对草甘膦具有较抵亲和性，受草甘膦的抑制程度降低，将其导入植 物中可获得抗草首膦植株。 抗草i = 膦转基因作物的第一个例子是将鼠伤寒沙门氏茁( s t y p h i m u r i u m ) p 1 0 1 s 突变的e p s p 台成酶基因( a r o a 基因) 转入烟草中，获 得了抗萃甘膦的转基因烟草，随后又获得了抗草甘膦的番茄i l k5 ”。在植物中， e p s p 合成酶主要定位在叶绿体中，但细菌的a r o a 基因缺少叶绿体转运肽序列， 为使该突变酶在转基因植物时绿体上出现，还需在突变基因上融入时绿体转运救 序列。将矮牵牛的e p s p 基因转运肽序列和突变酶蛋白基因的前2 7 个密码子融 入突变的e c o l i 的a r o a 基因中，并将其转入矮牵牛、油菜、玉米和大豆中，在 9 聂燕芳 中山太学碗士学位论立：t 4 2 m 突变型e p s p 台成酶基因的竞隆和研究 再生榱抹中表达成功，对草甘膦的抗性最著增强渺l 。 在商品化生产的抗革汁膦犬豆中使用的抗性基因来源子根癌农杼莆的c p 4 基因。实验证实c p 4e p s p 台成酶具有非常低的革甘膦亲和性，且具有较高的结 合p e p 的能力( 翰嘲q 为1 2p m o l l ，k i t v 埽h 端毗l 为2 7b m o v l ) 6 0 1 c p 4e p s p 合成酶基因是珏前所知最好的蕈挂膦抗性基嚣，除抗革甘膦大豆外，转入该基因 的稿花、甜菜、玉米和油蕹等都已商晶化生产产生巨大的经济和环境效益口 。 1 5 2 3 导入革甘麟降解基因 草首膦能迅速被土壤微生物降解黼失活，从这些细菌的降解体系中已克隆到 一些降解酶基因。将降解基因导入植物，莅革膦迅速代谢失活也成为获得草甘 膦抗性作物的另一条有效途径斟j 。抗草甘膦甜菜除转入c p 4 豹e p s p 台成酶基因 外，同对还携带g o x 基因。它从无色杆麓( a c h r o m o b a c t e r 印l b a a ) 中分离 出来，其有蕈甘耩氧化还艨酶活性，可催化革 膦转化为a m p a 和乙醚酸。这 个基蹰还被转入棉花、小麦等植物，使植物产生不同程度的草甘膦抗性h 蠲。 1 6 草甘麟抗性基因的优化 通过遥传修怖黝方法改良e p s p 合成酶，据薅其对革甘辚的抗性，不仅可以 为植物转化提供理想的目的基嗣，还可为草甘瓣与e p s p 合成酶作用模式的矾究 提供理论诫摄。 鼠伤寒沙门氏千千茁( st y p h i m u r i u m ) e p s p 合成酶韵1 0 1 位氨基酸残基从脯 氨酸突变为丝氨酸( p 1 0 1 s ) ，其与草甘膦的亲和力降低9 倍1 1 l ；p a d g e t t e 等分析 大肠杆菌高草甘膦抗性突变株最c o l f b 序列时发现。其e p s p 台成酶的9 6 位氨 基酸残基由_ h 氨酸置换为丙氨酸( g 9 6 a ) ，这一* 馒点在植物和细菌中是离度保守 的；将c 0 6 a 突变引入矮牵牛、大豆、玉米和番茄e p s p 台成酶的相应位点中( 铡 如矮牵牛、大厦和玉米为g i o i a ，番茄为g 1 0 4 a ) ，也搜突变酶对革甘瞵抗性水 平得到不同程度的提高旧，。 对上述突变的e p s p 合成酶的酶动力学研究发现，与野生型e p s p 台成酶相 比，突变酶的草甘膦的抑制常数脑f “帅。m l 增加，即其与草甘膦的亲和力降低 聂燕芳中山大学硕士学位论史：t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶基因的克随和研究 但酶的p e p 米氏常数k 。 r , e p l 篮也随之增加，意味着酶弓底物p e p 的亲和力也降 低，从而使酶的催化效率降低。例如矮牵牛e p s p 台成酶发生g i o i a 嚣换君， g 1 0 1 a 突变型e p s p 合成酶的搦培y p 删为2 0m m o l l ，是野生型e p s p 合成酶 的5 0 0 0 倍，而赫肿e n 为2 1 0 “m o f l ，比野生型酶提高了4 0 倍，酶比活力下降7 1 2 5 i l w 。在s c h s n b r u n n 的大肠杆菌e p s p 合成酶的结构模型中，9 6 位甘氨酸残 基与草目膦的磷酸基团结台；发生g 9 6 a 突变唇，丙氨酸残基甲基基团的位阻效 应影响了其与配体磷酸摹团豹结合，导致酶每草甘膦或p e p 的亲和力降低，且 这种影响又因革甘膦与p e p 分子结构的细微差异有所差别口”。 由于草甘瞵与p e p 在e p s p 合成酶上的结合位点具有交叉但并不完全黧叠的 特点d g ，凶此可以通过遗传修饰，分别改变酶与革甘瞵和p e p 的结合能力，获 得对草甘瞵具有低亲和力且其有高催化活性的e p s p 合成酶。h e 等以丈肠捂菌 ( e c o l i ) 和鼠伤门氏杆菌憾t y p h i m u r i u m ) 的a r o a 基因为模板，通过交错延伸的 基因优纯技术i 叫，获得了系列产生重组或突变的a r o a 基因，并以草甘膦为筛选 荆，从中筛选到四个正向突交子。酶动力学研究表明，这些突变型e p s p 合成酶 与野生型e p s p 合成酶相比，酶比活力增大2 1 0 倍，f e t e ) 降低2 5 一。1 9 倍， 瓶& 目y p m l 提高了o 砖一o 8 倍，即酶的催化效率大大提高同时又降低了酶与抑 制期革目麟的亲年日力m 。 1 7 草甘膦及其抗性作物的应用现状及前景 目前，化学除草仍是最有效的防治杂草的方法，其中除草剂用量占农药总用 量的6 0 左右。但除草剂的频繁使用有可能使杂草逐渐对除草嗣产。牛抗性，丽抗 性作物与杂革远缘杂交也有产生超级杂草韵可能侄。至今为止，已经证实有t 0 0 多例杂草对1 5 种除草荆产生单一或多种豹抗性。在近十至二十年里，抗化学除 草剂的杂革相继被报道。：秘妻包括抗三嗪、抗芳环苯氧熬丙酸、抗环己烯二酮、 抗- - p t t 啶、抗眯唑酮、抗二硝基苯胺、抗氰、抗三唑、抗取代腮和抗苯氧化物的 杂革m j 。杂草对这些除草荆产生抗性的缺点，也限制了其进一”步的应用和推广。 草甘膦具有的高效、对人畜低毒、低残鼯、不破坏生态环境等优点，已使其 成为全球销售量最大的农药 。更重要的是草甘膦已在全球r 泛使用2 0 多年， 聂燕菏中山大学硕士学位论文：t 4 2 m 突变璁e p s p 合成酶蓑园豹克隆转研究 至今还没在嬲闻发现有对它产生抗性的例子即l 。在草甘膦作用模式不变、作用范 围和频率又是雷隈的的情况下，有理由认为革甘膦抗性杂孳产生的可能性不会显 著增加。这也是草h 膦比其它除草女更有优势的特点p “。 但草甘膦在杀灭杂草的同时，也非选择性伤害作物。因此利用基因工程手段 来培育抗草甘膦作物已成为日益紧迫的问题。国外应用基因工程手段已培育出多 种草甘磷抗佳作物，其中以美圜盂山都公剞最为成功。1 9 9 4 年，该公司采用来 源予农杆蓖c p 4 e p s p 合成酶攀困培育的抗草甘膦大豆歌f d a 批准商品化生产。 接着抗草曹麟棉花、油菜、玉米和舌隹朵也相继获准上市【醯j 。至2 0 0 0 年，美国大 豆种植面积的5 4 是抗草甘膦品种。2 0 0 1 年先锋公司在j b 美种植了近1 1 5 个大 蕊品种，其中有5 5 个是抗草甘膦的r o u n d u p 自r e a d y 转基网大豆；而投放市场的 油菜中有3 个是抗草甘膦的r o u n d u p * r e a d y 油菜【。 草甘膦抗性作物的开发和应用给生产者带来裙当大的好处：除草荆使用时间 上更灵活机动，简化了生产程序，降低了生产投入及管理成本，而使产值相对增 加。据美国农业部资耩，年i | 植抗除草荆豹r o u r t d u l # r e a d y 转基因大豆，每年节 省除草剂费用选21 6 亿美元唧】。 随着2 0 0 0 年需山都公司草甘膦相关专利的到期，极大地刺激着草甘膦市场 及抗革甘瞵作物品种市场舶进一步扩火。许多国家和公司均争先生产革甘膦并廉 价出售，这势必引来草甘麟使用量的巨大增长。培育抗草甘磷农作物品种的任务 也显得尤为重要。为占领中国抗除草剂作物市场，美国的盂由都公司、英翻的曾 尼蕾公司、法国的罗纳普朗克公司等先后在中翻申请了抗革甘膦农作物晶种等相 应专剥，正积极在我国推广有关品种。专利像护，不但馒巨大的经游效益落入了 外国公司手中，更为严重的是将严重制约了我国现代农业的发展。 克隆、应用具有我国自主知 = 产权韵草甘瞵抗性基囡，是当务之急。我国在 抗除草剂植物基因工程方面已经进行了相当的研究。然而我国科学家自己开发的 抗草甘磷基因鲜见报导，大都是利用国外发表或专利的慕园。尤其在我国加入世 贸组织的新形势下，更面临著国外基因专利垄断和转基因植物大量涌入的骶力。 习前，抗革甘膦农作物的专利权，还依然掌握在几个跨国大公司的手中。培植抗 革甘膦农作物，尽快井发具有皂主知识产权的抗草甘膦技术，是发展我国现代化 农业的迫切需求。 聂燕芳中山大学碗士学位论文：1 4 2 m 突变型e p s p 台成酶基因的壳随和研究 1 8 本论文研究的内容与意义 1 8 。1 研究内容 本论文通过定点突变法对大晒杆菌野牛型a r o a 基因及以基因优化技术获得 的a r o a m i 基冈( 束发生t 4 2 m 置换) 作进一步改造，使其编码的e p s p 合成酶 的第4 2 位氯基酸残基出苏氨酸髓换为甲硫氨酸( t 4 2 m ) 。并将其构建到质粒表 选载体中，转他大肠杆荫b l 2 1 ( d e 3 ) ，获得相应转化予；刘转化子的咩甘膦 抗性和蛋白表达情况进行研究，测定t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶的酶动力学性质； 最后将该突变基因构建到植物表达载体p c a m b i a l 3 0 0 中，以农杆菌为介导转化 烟草，检测转基因烟草的草甘腾抗性水平。 1 8 2 研究意义 本论文是在以基因优化技术获得突变基因的基础上，结合对酶三级结构及活 性位点氨基酸残基研究的分析。采用基因定点突变法对基因进行改造，克服了咀 往单纯使用定点突变法研究基因功能的随机性。第4 2 位氨基酸残基不包含在以 往报道过的与酶和底物结合相关的氨基酸残基中，因此该研究对于探索酶蛋白结 构与功能的关系将有重要意义；而其转基因烟草豹研究将为e p s p 台成酶突变基 因转入植物+ 获得抗草甘膦的转基因植物豁_ f 良好的基础，具有r4 泛的应用前景。 硅燕芳中山太学硕上学位论文：t 4 2 m 突变型e p s p 合成酶基因的克隆和研究 2 。t 材料 2 。i i 葡种 第2 章材料和方法 大肠杆菌( e s c h e r i c b i a “) 菌株x l l b l u e 及b l 2 l ( d e 3 ) ，由本实验室 保存； 克雷伯氏肺炎球菌( k l e b s i d l a p n e u m o n i a e ) a t c c 2 5 5 9 7 ，购自美国a t c c 菌 种中心： 根癌农杆蔬( a g r o b a c t e r i u mf 口盔e 地m ) l b a 4 4 0 4 ( p l b a 4 4 0 4 ) ，由本实 验宣保存。 2 1 2 质粒 质粒p e t - i l d ：5 9k b 。购自n o v a g e n 公司； 质粒p c r 2 ，1 ：3 9 k b ，购自l m r o g e n e 公司； 质粒p c a m b i a1 3 0 0 ：9k b ，c a m b i a ，c a a b e r r a ，a u s t r a l i a 。 2 1 3 植物材料 烟草( n i c o t i a n a t a b a c c u m “x a n t h i ) 种子由本实验室保存。 2 1 4 生化试剂及试剂盒 t a q d n a 聚合酶，t 4d n a 连接酶和各种限制性内切酶均购自m b if e r m e n t a s 公司： 抗生素：卡那霉素( k a n a m y c i n ) ，头拖霉索( c e f o t a x i m e ) ，利福平 ( r i f a m p i c i n ) ，链檬素( s t r e p t o m y c i n ) 购自s i g m a 公司；潮霉素( h y g r o m y c i nb ) 聂燕芳中由大学硕士学位论史：f 4 2 m 舞变掣e p s p 台成酶摹固