（食品科学专业论文）枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得 注 如没有 其他需要特别声明的 本栏可空 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意 学位论文作者签名 李趟 导师签字 学位论文版权使用授权书 静芬 本学位论文作者完全了解出壅趣菹太堂有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和 借阅 本人授权出壅短蒸太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保 密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 左冰 勺尸 导师签字 趋罾 签字日期 2 0 0 8 年 月 日签字日期 2 0 0 8 年b 月 日 山东师范大学硕士学位论文 枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用 中文摘要 芽孢杆菌 肋c 订如s p p 是土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群 具有很强的抗逆能力和抗病作用 其生防机制主要包括竞争作用 拮抗作用和诱 导植物抗病性等方面 其产生的细胞壁降解酶 如蛋白酶 几丁质酶 夕 1 3 一 葡聚糖酶等 是重要的拮抗物质之一 已有研究表明 几丁质酶 c h i 血嬲e 和 夕 1 3 葡聚糖酶 夕 1 3 百u c a 麟e 在生防中的作用与真菌细胞壁结构有关 真 菌细胞壁成分较复杂 除了几丁质 夕 1 3 葡聚糖以外 还含有多种蛋白质 生 防芽孢杆菌产生的胞外蛋白酶可能在协同几丁质酶 夕 1 3 葡聚糖酶降解真菌细 胞壁 拮抗病原真菌中起到重要作用 本研究首先从真菌细胞壁蛋白质含量入手 对引起山东省主要作物病害的7 种病原真菌细胞壁蛋白质含量进行分析 研究了7 株生防芽孢杆菌对不同病原真 菌的生物防治效果与其3 种主要细胞壁降解酶活力的相关性 并进一步利用紫外 线 u v 硫酸二乙酯 d e s 及微波 m i c w a v e 对一株具有广谱抗菌活性 且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌 踟甜缸s z f 6 抛 t 2 进行诱变 以蛋白酶活力变化 为筛选指标 研究突变株和出发菌株对病原真菌拮抗作用的变化及粗酶液对菌丝 和孢子萌发的影响 以期探明芽孢杆菌胞外蛋白酶在生防中的地位和作用 为优 良拮抗芽孢杆菌的直接利用和菌株的遗传改良提供依据 具体结果如下 1 采用b r a d f 0 r d 法测定真菌细胞壁蛋白质含量 结果显示 供试7 种病原真菌细 胞壁交联蛋白含量均高于未交联蛋白 不同病菌菌丝细胞壁中总蛋白含量存在差 异 其中以棉花枯萎病菌 凡岱口一 聊卿d 朋坍 s p v 甜f 行尼c m 掰 含量最高 达 到7 4 1 1m g 西瓜枯萎病菌 凡岱口一材聊d 砂印d 础m s p z f 删聊 黄瓜枯萎病菌 凡岱口 玩掰a 砀印d 朋聊 s p 例洲聊g 伽 朋 小麦纹枯病菌 r 而之刀c 幻甩缸钾聊船 含量相当 其次为烟草赤星病菌 彳厅绷口砌口厅p 栩口纪 和小麦赤霉病菌 胍口砌m 弘朋加韶埘胧 番茄灰霉病菌 勘f 灿嘲p 瑚 含量较少 为2 6 2 6m g 2 生防芽孢杆菌的防治效果与菌株细胞壁降解酶活力的相关性研究 是建立芽孢 杆菌菌株筛选模型和菌株改良的基础 根据供试7 株生防芽孢杆菌的防效和细胞 壁降解酶活力 计算相关系数 结果显示 细胞壁降解酶中影响其防效的主要因 素是菌株的蛋白酶水平 同 1 3 葡聚糖酶水平 几丁质酶水平也有一定关系 以细胞壁蛋白含量最高的棉花枯萎病菌 f 铖卿d 懈历 s p 嬲加膨删脚 为靶标 时 蛋白酶水平相关系数达o 9 1 5 其余相关系数分别为夕 1 3 葡聚糖酶o 8 l l 山东师范大学硕士学位论文 h i 曲e s tc o n t e n to f7 41 1m gw 弱o b s e r v e di nf 嗍d 朋肌 s p s f 形融 川w l l i l e m el o w e s tc o m e n to f2 6 2 6m gi i lb c 折g fo 砂驴d 朋聊 s p 甩加例聊 f d 砂驴d 朋聊 s p 例例聊p 拥 朋锄dr c p m 坛s h a r e dt l l es i i i l i l a rr e s u l t sw k c hw e r e r e s p e c t i v l y4 9 2 7m 岛4 5 5 0m g 4 2 7 5m g 恤1 e 也ec o n t 锄to f fg 阳肌f z e 口刚珑 w 部3 8 9 8m g 2 1 1 1 ec o 玎e l a t i o n 孤a l y s i so f 曰口c f 跏s 仃a i n sb e 俩e e i lm ei l l l l i b i t o 巧e 脏c ta 1 1 dt h e a c t i v 毋o fc e l l w a l ld e 笋a d i n ge n z y m e si s 觚e l e m e l l t a l yr e s e a r c hf o rs n 面ns c r e e i l i n g 锄di m p r 0 v e m e n to fb i o c o n 仃0 la c t i 访够a c c o r d i n gt 0m ed i v e r s er e 叭h so fd i f 置b r e n t 肋c f 批s n a i l l si nc 伽j t i 0 lo f 丘v ep l a n tp a m o g e i l i c 胁百 n 1 i e eb i o l o 百c a li n d e x e s p r o t e 嬲e 夕 1 3 9 1 u c 肌嬲ea r l dc h i t i n 邪e w e r ei i l 仃0 d l l c e d a 1 1 dt l l e nc o n e l a t i o n c o e m c i e n tw 硒c a l c u l a t e df o re a c ho f l ea b o v e t h er e s u l ts h o w e dm a tt h ep r o t e 嬲e a c t e d 觚i 1 1 1 p o n a n tp a ni np r o c e s so fa n t a g o l l i 锄a g a i n s tp a n l o g e l l i c 如n 西w 1 1 i l e 夕一1 3 一9 1 u c a l l 豁ea 1 1 dc l l i t i n 勰es h o w e dc e r t a i l lc o 玎e l a t i o n t h ec o r r e l a t i o nc o e 伍c i e n t o f p r o t e a s e 锄o u n t e dt o0 9 1 5 锄df o l l o w e db y 夕一1 3 一出u c 孤弱et 0o 8 1 1 c l l i t i n 嬲et 0 o 5 7 2w h e l lfd 研驴d 瑚聊 s p v 船够础l 肌谢ml l i 曲e s tc e l l w a np r o t e i i l sc o l l t e n t u s e d 勰t 1 1 et a 唱e t t h es 锄ec o i l c l u s i o n sw e r ed r a w n 自o m l ei i e s t i g a t i o no ff 卿d 埘m s p 翻础垅州刀 所 f 口肌拥朗州聊觚d 彳 口抛朋口纪w h e r e 弱d i f f 打e n t c o n d i t i o n se x i s t e di nf 翻彤驴d 凡p 咒 s p z f w w 研w m lc l l i t i n 弱e 锄o u m i i l gt 0o 8 2 4 p r o t e 嬲et oo 6 2 3a i l d 夕一1 3 一g l u c a l l 雒et oo 4 9 7 3 肋c 肼淞s 6 打船t 2w a sap o t 胁t i a lb i o c o n 舡d la g e n ta g a i n s ta b r o a d s p e c t n 姗p 1 趾t p a t h o g e n i c 觚百w i t l lm ea b i l i t t 0p r o d u c ee x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e t oi n l p r 0 v ei t s 劬g a la n t a g o n i s t i cc 印a c i 砒m u t a g e n e t i cp r o 铲锄 w a u su n d e r t a l e nf o rt l l e c o n s t n l c t i o no fe x 昀c e l l u l a rp r o t e a s ed 甜v a t e s 1 w op r o t e a s em u t a n t sw i t hg e n e t i c s t a b i l i t yw e r eo b t a i l l e db ym e a l l so fu v i r r a d i a t i o n d e sa n dm i c r o w a v et r e a 舡n e n t s i tw 2 u sr e v e a l e dt l l a te x t r a c e l l u l a rp r o t e a s ea c t i v i t yo ft l l ep o s i t i v em u t a n tt 2 18w a s e l e v a t e db y1 0 8 5 觚dm en e g a t i v em u t a l l tt 2 2d e c r e a s e db y8 1 1 a r e r4 8h c u l t i v a t i o n w h e r e 鹊t h ea c t i v i t yo fc h i t i n a s ea 1 1 d夕一1 3 一g l u c a n a s ed i dn o tc h a n g e s i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt ot 1 1 ew i l dt y p et 2 4 h 1v i t r 0b i o a s s a y ss h o w e dn l a tt h ep o s i t i v em u t a n tt 2 l8p r o v e dt ob eb e t t e r a i l t a g o n i s t i sa g a i n s tfd 砂驴d 删川 s p s i 恐膨c m 朋 i t sc e l l 一厅e ec u l t u r e 丘l t r a t e s h o w e d 黟e a ti n l l i b i t i o nt om y c e l i a lg r o w t l la j l dc o l l i d i ag e m i n a t i o no ft h ep a t h o g e n 4 山东师范大学硕士学位论文 w l l i c h 也es w e l l i n g d i s t 碱o nh y p h 姐ds h o r t e ng 锄i i l a t i o nt u b e sw e 砖o b s e r v e d l l i l d e rl i g h ti i l i c r o s c o p e o n 也ec o n 仃a m e 枷b i t 0 巧e 彘c to ft l l en e g a t i v em m 飙t t 2 乏d e c r e 弱e dm 盯k e d l yt h a n 也ew i l dt y p et 2 a n dt 量l e r ew 勰n oo b v i o u se 彘c t0 n m o r p h o l o g y 订廿l eh y p h 瓤dc o n i d i a h 1e x p 鲥 眦e m sc o n d u c t e d0 nc u c u l n b e r i n f e c t e db yfo 砂印d 朋m s p c l 洌m e 坷 z 肌 s i 嘶f i c a n td i f i 衙e n c ei l li n h i b i t i o nw 弱 o b s e n r e db e 觚e e nw i l d 帅e 龃d 吐l ep r o t e 勰em u t a i 峪 t h em o r t 妙r a t eo fc u c 吼b e r s e e d l i i l 笋臼陀a t i e d 谢mt h ep o s i t i v em u t 舳tt 2 l 8w 弱m e r e l y4 0 o 锄l dm en e g a t i v e m u t a n tt 2 2w 弱7 9 6 w h i l e 廿1 ew i l dt y p et 2w 鹊5 4 3 a n dt 1 1 ec o n t r 0 1w 勰 8 0 1 t m s 咖d y 跚g g e s t s 廿l ep o s s i b i l 时o fu s i n g l u t 眦sw i 也 c r e t i o no f e x 缸a c e l l u l a rp r o t e 硒ea g a i n s tp l a n tp a d g e i l i cf i l l l 西 5 i ti si m p o r t 锄tf o rm em u t a n t s 埘也g e n c t i cs 缸l b i l 时t o 缸1 c 缸o n m a l l yi l lv 撕o u s e n v i r o m n e n t t w op r o t e 嬲em u t 狃t sw e r et a k e nt 0i 1 1 l l 丽tf 两mg e i 圮r a t i o n幻 g e n e r a t i o n t h ef 豁u l ts h o w e d 也a t 也ec a p a c i t yo fa l z y m ep r o d u c t i o n 锄d 也e a n t a g o l l i s t sd i dn o tc h a n g es i 鲥丘c a n t l yc o m p a r e dt 0m e 谢1 dt p e s o t 1 1 e yc 孤b e 印p l i e di 1 1 t 0p r a c t i c es t a b l y k e yw o r d s c e l l w a l lp r o t e i n s 曰口c f 玎淞s 甜易巧妇 c e l l w a l id c 笋a d i i l ge n z y m e s e x m 糙e l l u l a rp r o t e a s e m u t a g e n 鹤i s a n a g o i l i s m 5 山东师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 引言 植物真菌病害是影响农业生产和生态系统稳定的主要因素之一i l 据联合国 粮农组织估计 由于植物病害导致的平均作物经济损失约为总产量的1 0 1 5 化学农药在防治植物病害 保障农作物产量方面起着积极作用 但其现状不容乐 观 长期大剂量使用农药在导致农残的同时也严重破坏了生态环境 使有益微生 物被杀死 病原菌抗药性不断增强 进而导致防治难度和成本上升 2 3 1 近年来 随着人们环保意识的加强 基于植物和微生物 微生物和微生物之 间的相互作用发展起来的生物防治方法 因其对人体健康和生态环境安全无害 且不易引起病原抗药性等特点 被视为一种可以减少化学农药使用量的替代或补 充方法 2 胡 在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用 从理论上讲 任何能够降低植物病原微生物数量或致病性的微生物都具有生 防潜能 因此 植物病害生防微生物涉及真菌 放线菌 细菌乃至病毒 噬菌体 等很多种群 真菌主要有木霉菌 毛壳菌 酵母菌 淡紫拟青霉菌 轮枝菌及菌 根真菌等 放线菌主要有链霉菌及其变种 病毒主要利用弱毒株系 细菌主要有 土壤放射杆菌 伽6 口c 幼诹m 芽孢杆菌 鼬c 讲淞s p p 假单胞菌 n 伽面所d 刀嬲 s p p 和黄单胞菌 肠刀砌d 聊d 刀甜s p p 等属的一些种群的菌株 其中芽孢杆菌属 肋c 池岱泖 是近年来科研工作者研究的热点 生物防治成为植物病害防治的一个具有重大潜力且富有成效的措施 是现代 农业发展的必然趋势 为我国国民经济和农业的可持续发展发展提供了广阔前 景 因此寻找有效的生防微生物以及研究它们相关的生防作用机制也就成了当今 人们关注的热点 1 1 芽孢杆菌在生物防治中的应用 芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧 产芽孢的革兰氏阳性杆菌的总称 其生理 特征丰富多样 分布极其广泛 6 是土壤和植物体表根际的重要微生物种群 同 时还是植物体内常见的内生细菌 对人畜无毒无害 不污染环境 能产生多种抗 菌素和酶 具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用 芽孢杆菌突出的特征是生长快 营养简单 能产生耐热性内生芽孢 抗逆能力强 可以耐受各种不良环境 这有 利于生防菌剂的生产 剂型加工及在环境中存活 定殖与繁殖 田间应用研究已 经证实芽孢杆菌生防菌剂在稳定性 与化学农药的相容性和在不同植物不同年份 7 山东师范大学硕士学位论文 防效的一致性等方面 明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂 7 而且批量生产工 艺简单 成本也较低 使用方便 储存期长 是一种理想的生防微生物 8 用于植物病害生物防治的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌 丑s 6 f f 脑 短小 芽孢杆菌 最p 删加 地衣芽孢杆菌 b f 西e 甩和聊西 蜡状芽孢杆菌 b 陀淞 和多粘芽孢杆菌 召 p d 咖燃口 等 引 应用芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史 很多优良的分离菌株如 枯草芽孢杆菌已经应用于实践 美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌 且s 6 打胁 生 防菌株获得环保局 e i a 商品化或有限商品化生产应用许可 它们是g b 0 3 m b l 6 0 0 q s t 7 1 3 和且j 6 f 妇v a r 口朋 f d 均 电庙c 招以sf z b 2 4 1 0 1 g b 0 3 和m b l 6 0 0 分别由美国g u s t a f s o n 公司和m i c r o b i ol t d 公司开发 根部施用或拌种可防治镰 刀菌属 凡 s 口一 ms p p 曲霉属 彳印p 恻口淞s p p 链格孢属 么加朋口 妇s p p 和丝核菌属 r 泐c 幻 z 记s p p 引起的豆类 麦类 棉花和花生的根部病害 2 0 0 1 年g u s t a f s o n 又将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂 称 为b i o y i e l d t a e i l s a 公司生产的f z b 2 4 作为植物促长剂被商品化生产 商品名 t a e g r 0 蹦 施用于温室或室内栽培树苗 灌木和装饰植物根部 可防治镰刀菌和 丝核菌引起的根腐病和枯萎病 q s t 7 1 3 为a 留a q i l e s t 公司产品 商品名s e r e n a d e 叶面施用能防治蔬菜 樱桃 葡萄 葫芦和胡桃的细菌和真菌病害 此外 澳大 利亚开发的召 s 6 f 妇a 1 3 对麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的 防治和增产作用f l l 日本东京技术研究所的曰 j 甜6 f f 凰r b l 4 和b s 6 f f 凰n b 2 2 分 别对立枯丝核菌 r s d 肠 l f 尖孢镰刀菌 d 砂印d 脓肌 和户 j d z 口刀口c 删肌引 起的番茄病害有良好防效 1 2 1 c a v a g l i e r i 等从玉米根围分离获得生防菌株b s 6 f f 凰c e l 可大大降低玉米轮状镰刀 f p 川c f z z f d f d 甜 在作物根际的定殖力 并可抑制其伏马毒素b 1 的产生 1 3 c a z o r l a 等从鳄梨根际分离到的芽孢杆菌 p c l l6 0 8 和p c l l612 产生i t 嘶na 对t o m a t o 胆d 砂驴d 埘m s p 旭击c 捃 纱c 印g 坶f c f 和a v o c a d o 侬 础加妇刀p 阳勿讧表现出很高的抑制效果和根际定殖能力 1 4 1 我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害 促进作物生长等方面的应用研究也达 到了世界先进水平 现已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝 百抗 麦丰宁 纹曲宁等 云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药 百抗 获得农 药部登记注册 已在多个省推广使用 面积约46 6 7l u l l 2 百抗的有效成分是枯草 芽孢杆菌b 9 0 8 大田应用中对水稻纹枯病防效7 0 以上 其抑菌机制为营养竞争 位点占领等 南京农业大学生防菌b 3 商品名麦丰宁 是由枯草芽孢杆菌b 3 菌 山东师范大学硕士学位论文 株制成的活体生物杀菌剂 对小麦纹枯病田问防效达5 0 8 0 增产1 0 以上 其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长 菌核形成和菌核萌发 的抗菌物质 8 江苏省农业科学院陈志谊等人经过1 0 多年生物防治水稻病害的研 究获得了对多种病原菌有强烈抑制作用 防治水稻纹枯病效果达5 0 8 1 的曰 j 6 疗凰b 9 1 6 菌株 目前已进行农药登记 在江苏等地得到广泛推广1 1 5 莱阳农 学院b l 0 3 和 口 l 6 菌株对苹果霉心病和棉花炭疽病田间防效达9 0 1 1 6 1 中国农业 大学利用植物有益芽孢杆菌如蜡样芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌等研 制的水稻 小麦 蔬菜和经济作物增产菌系列产品 推广应用面积超过1 6 6 7 5 万 h m 2 增产1 0 2 0 并具有良好抗菌防病效果 1 7 1 此外 谢栋等发现只s 6 巧胁b s 9 8 能强烈抑制苹果轮纹病菌 砌声口砌咿d 印眦d 肠等植物病原真菌 芽孢杆菌b l b 2 对豌豆尖孢镰孢菌 f d 砂印d 础册 办 s p p 括f 有很强的抑菌作用 1 9 1 林东等发现枯草芽孢杆菌e s 甜6 珊bs 0 1 1 3 对水稻白叶枯病菌 xd 秽纪pp v d 哆即p 具有强烈的抑菌作用 2 0 内生芽孢杆菌 舶c f z z 淞s p p t b 2 对辣椒疫霉 用吵印 历d 旭够芦记f 引起的辣 椒苗和果疫病有良好的防治效果 其菌液可诱导植物抗性相关酶的变化f 2 1 穆常 青等发现枯草芽孢杆菌b 一3 3 2 的芽孢菌体悬浮液及发酵上清液对稻瘟病均表现 出较好的防治效果 5 0 以上 且预防叶瘟的效果与接种稻瘟病菌时叶面已定 殖的b 3 3 2 菌株的数量有关1 2 2 尹敬芳等的研究表明枯草芽孢杆菌b s 对7 种不 同来源的辣椒疫病病菌有较强的拮抗作用和生防效果 抑制率达到 3 3 2 5 9 4 显著高于枯草芽孢杆菌g f l 和荧光假单胞菌l x l b c a l 4 绿色 荧光蛋白标记显示该菌株可通过种子细菌化成功定殖于辣椒植株体内 2 3 1 y i y j 等从r 口厶幻 z 纪j d 肠万口c 口删册易发地的健康烟草茎部分离到的一株内生枯草芽孢杆 菌b 一0 0 1 其对r j d 肠 z 口 朋m 的防效优于链霉素 达4 0 0 3 r v 7 8 1 4 2 4 j 1 2 芽孢杆菌拮抗物质研究 1 2 1 芽孢杆菌产生的拮抗物质及其在植病生防中的应用 拮抗物质在植病生防中起到重要作用 是抗菌机制中研究的广泛而深入的方 面 也是筛选 利用生防微生物时首要考虑的问题 芽孢杆菌产生的拮抗物质主 要有核糖体合成的抗菌蛋白和非核糖体合成的抗生素及其他抗菌物质 1 2 1 1 核糖体合成的抗菌蛋白 核糖体合成的抗菌蛋白主要有细菌素 细胞壁降解酶类 如蛋白酶 几丁质 9 山东师范大学硕士学位论文 酶 夕 1 3 葡聚糖等 以及 些未鉴定的抗菌蛋白 2 5 2 6 1 这些抗菌蛋白抑菌谱广 结构简单且性质比较稳定 2 7 3 们 1 细菌素核糖体合成的小分子量抗菌多肽称为细菌素 是由细菌合成的 一类对微生物具有抗生作用的小分子量蛋白质 芽孢杆菌能产生多种细菌素 2 5 如枯草芽孢杆菌产生的s u b t i l i n 和s u b t i l o s i n 及巨大芽孢杆菌产生的m e g a c i 璐 对g 细菌具有很强的活性 枯草芽孢杆菌产生的b 砷b c i d i n 朋 1 3 1 6 a l i 血b l 和6 9k d a 小肽及b 如幽e 玎帕 聊西m 4 产生的m 4a m o e b i c i d a l 同时具有抗细菌 和真菌作用 抗菌肽具有分子量低 水溶性好 热稳定 强碱性和广谱抗菌等特 点 目前对其研究已经深入到分子结构 作用机制等多个方面 s u b t i l i n 的分子 量为3 3 1 7d a m e g a c i n s 的分子量为1 8 2 5d a s u b t i l o s i l l 的分子量为3 8 7 7d a 其中s u b t i l i i l 是研究比较清楚的细菌素 其前体是5 6 个a a 小肽 2 4 个a a 为信 号肽 经信号肽切除和一系列修饰包括m 脱水和s e r 与c y s 硫酯化形成3 2 个 a a 的活性小肽 具有抗低p h 和强热的特性 3 2 1 2 几丁质酶芽孢杆菌产生的几丁质酶有内切酶和外切酶2 类 内切酶的 产物为几丁质l 4 糖或寡聚几丁多糖 而外切酶的产物为几丁质单糖 产生几丁 质酶 c t l i t i i l 懿e 的芽孢杆菌有曰 幽豇砌d v 加淞 昱s 6 f 玎西 b c d 母删肠刀s b 聊铝i c z 纪一 删 b z i c 办删咖 柳西 曰 砌 一 t 硎s 括 曰 玖 研岱 b d 门c 肠7 坫 曰 s 泐阳历p 册d 础f 如和且阳6 旃等 3 3 3 4 1 几丁质酶属于诱导酶 几丁质酶的分泌受到很多条件的限制 舢f 记 肋c f 跏 耽6 砌属细菌已经被证明可分泌一些几丁质水解酶和几丁质连接蛋白 可以协调降解几丁质 进入到胞外环境 这些酶的合成在营养丰富的培养基上 被抑制 在补充几丁质的合成培养基上被诱导 3 5 d eb o e r 等从沙土中分离的 s 五肋d 肌矽办d 聊d z 口s 在s m 培养基中不能降解胶体几丁质 如果补充额外的生长因子 如酵母提取物 就可以降解胶状几丁质 3 6 所以m e t t e 提出筛选 个有潜在生 防能力细菌的可行性方法是 寻找可以稳定地产生抗生物质 而且抗生物质的产 生与培养基组成关系不大的菌株来作生防因子 一些来源于细菌的几丁质酶已经被纯化和定性 有的基因已被克隆 而且在 西c 矗p 晓矗纪c d 打中得到了表达 3 8 有人在 m 口打印 订肠中克隆一个2 8k b 的几丁质 酶基因 s 聊口厅印j l l f 肠3 4 s l 中的一个5 1l a 具有几丁质酶活性的蛋白也被纯化 c h i a 突变的菌株c 5 由于缺少这个5 lk d a 的蛋白而丧失了几丁质酶活性 同时也 降低了对某种牧草的斑点病的抑制能力 这也证明了 m 口如d p f 加产生的几丁质 l o 山东师范大学硕士学位论文 酶在生物防治中的作用p 9 3 葡聚糖酶芽孢杆菌产生的葡聚糖酶有夕 1 3 葡聚糖 夕 1 4 一葡聚糖酶 夕 1 6 葡聚糖酶和e i l d o 1 3 1 4 夕葡聚糖酶等 其中夕 1 3 葡聚糖酶具有分解 真菌细胞壁的作用 3 2 4 蛋白酶芽孢杆菌属是重要的蛋白酶生产菌株 产生蛋白酶的芽孢杆菌 主要有且j 6 f 她 丑俚m 坫 丑p 聊i 如岱 曰 抛 铡和 掰西 b s f 阳加砌册l 印 f f z 岱 根据国际生物化学和分子生物学联合会 n b 命名委员会的命名法 蛋白酶属水解酶类第4 亚类 e c 3 4 1 1 e c 3 4 4 2 5 蛋白酶根据其作用位点 可分为内肽酶和外肽酶 外肽酶分为氨肽酶和羧肽酶 可从肽链n 端和c 端切断 肽链 内肽酶根据作用机制分为s e r i l l e 丝氨酸蛋白酶 c y s t e i n e 半胱氨酸蛋 白酶 慨o n i n ep r o t e 嬲e s 苏氨酸蛋白酶 嬲p a r t i c 天门冬氨酸蛋白酶 m e t a l l o 金属蛋白酶 和蛳a 删cp r o t e 弱e s 谷氨酸蛋白酶 按最适p h 值分为 酸性蛋白酶 中性蛋白酶和碱性蛋白酶 很多芽孢杆菌一般能产生一种或多种蛋白酶 如b s 6 舭p e 1 1 产生1 5 a 的低分子量热稳定性丝氨酸碱性蛋白酶 4 0 丑c p 脚k c t c 3 6 7 4 在3 7 培养时 产生一种分子量为3 8l a 的中性蛋白酶 2 0 培养则产生一种分子量为3 6 如a 的金属蛋白酶 4 1 1 a 删扰溉m k 6 5 产生一种分子量为2 8k d a c a 依赖的热稳 定性碱性丝氨酸蛋白酶 4 2 且p 材扰加产生分子量为3 2k d a 的碱性蛋白酶 4 3 矗砌p 力咖瑚西产生一种分子量为2 8k d a 的碱性蛋白酶 4 4 1 b s 口阳坊p r m 印矗讹 t l s 3 3 产生3 种热稳定性金属蛋白酶s n b 4 5 肋c 讲姗印 k s m k 1 6 产生3 种碱 性蛋白酶m n h 其中m 蛋白酶在p h l l 时很快转化为h 蛋白酶 而h 蛋白酶在 p h 8 时可以转化为m 蛋白酶 n 蛋白酶被认为是m h 蛋白酶自溶的产物 4 6 1 5 其他抗菌蛋白芽孢杆菌还产生其他一些抗菌蛋白 如从枯草芽孢杆菌 p y 7 9 菌株分离的孢子成分 t 嬲a t f a n s i t i o n p h 硒es p o r e 舔s o i a t e da n t i b a c t 甜a l p r o t e i n t a s a 抗菌蛋白 对g 和g 细菌具有广谱抗菌活性 4 7 1 近年来我国有 很多分离纯化芽孢杆菌未知抗菌蛋白的报道 如从多粘类芽孢杆菌 尸口绷汤日c f 跏 p d 6 硼y 搬 w y l l 0 菌株中分离纯化到的分子量约2 6k d a 对稻瘟病菌具有拮抗 活性的抗菌蛋白p 2 4 8 枯草芽孢杆菌b 1 l o 抗棉花黄萎 枯萎病菌5 0k d a 2 9k d a 的抗菌蛋白 4 9 1 类芽孢杆菌l c 0 4 5 0 1 和l c l 0 5 菌株抗大丽轮枝菌 殆 地f 以f 脚 如 加p 蛋白类物质 地衣芽孢杆菌w 1 0 产生的4 6 0 4 9 2d a 抗真菌蛋白 5 2 对 于芽孢杆菌产生的拮抗蛋白的利用多数停留在平板抑菌活性研究水平 还没有在 山东师范大学硕士学位论文 田间防治应用的报道 1 2 1 2 非核糖体合成的抗生素 产生抗生素是芽孢杆菌抗菌作用的一个重要因素 芽孢杆菌产生的抗生素有 核糖体合成和非核糖体合成两类 其中核糖体合成的抗生素称为细菌素 已介绍 非核糖体合成的抗生素包括脂肽抗生素 多肽抗生素和次生代谢产生的其他抗菌 活性物质 如挥发性抗菌物质和脂肪氨基酸氮氧衍生物等 3 2 芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素主要有表面活性素 s u r f k t i l l 伊枯草杆菌 素 i t i l i i l l s 和丰原素 f e n g y e i n 3 大类 5 3 1 脂肽抗生素是一类主要由氨基酸和 特殊的或修饰过的氨基酸组成的小分子化合物 理化性质稳定 热稳定性好 甚 至1 2 1 高压灭菌3 0i i l i n 活性仍能保持在9 5 以上 对胰蛋白酶 蛋白酶k 等多 种蛋白酶不敏感 对氯仿等有机溶剂有一定的耐受性 抗紫外照射等 脂肽类抗 生素大多是带有d 型和l 型氨基酸的环肽 通过一个带有脂肪链的1 3 氨基酸连接 成环状 对丝状真菌和酵母都表现抗菌活性 i m 咖s 的脂肽类抗生素 如丑j 材6 巧胁合成的i n l r i n a c b a c i l l o m v c i l ll d f 和m y c o s u b t i l i n 等 一般对真菌具有强烈的拮抗作用 该类抗生素由亲脂的c 1 4 或c 1 5 夕氨基脂肪酸通过p 氨基和羧基与7 个强极性氨基酸短肽的n 端氨基和 c 端羧基形成内酯 s u r f a c t i n 类脂肽抗生素具有抗真菌 细菌 病毒以及表面活性剂的作用 包 括枯草芽孢杆菌产生的s u r f 孔t i n 和e s p 砸n s 等 其结构特点为一个c 1 3 一c 1 5 3 羟基 脂肪酸通过 氨基和羧基与7 肽末端基团形成内脂 as 施泌产生的f e l l g y c i n a b 和b c p 彤淞产生的p l i p a s t a t i n 均由t r 和1 1 e 与c 1 6 3 羟基脂肪酸通过内酯键成 环 具有很强的抗真菌活性和广泛的抗菌谱 芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素一般具有下列特征 是一类分子量远小于蛋白的物质 小的如杆菌溶素 b a c i l y s i n 的分子量 只有2 7 0d a 大的分子量也不过几千 如地衣菌素 l i c h e l l i f o m l i n 的分子量4 5 0 0 d a 通常某一菌株产生一系列结构和功能紧密相关的肽类物质 而较少产生单 一成分的抗菌物质 这些结构和功能相关的肽类物质一般相差一个氨基酸 最多 相差几个氨基酸 这对抗生素的分离纯化造成困难 有些脂肽类抗生素全部由氨基酸组成 有些则带有其他成分 如脂肪酸和 糖基等 在这些氨基酸中 常包含一些不常见氨基酸 如d 型氨基酸和夕 氨基酸 1 2 山东师范大学硕士学位论文 等 多数呈闭合环状 如抗霉枯草菌素 m y c o s u b t i l i n s 少数为线状如 碰z o c t i c i i l s 都具有相似的理化特性 对蛋白酶 p h 和温度具有较强的抗性 芽孢杆菌还可以产生线状 环状和分支环状多肽抗生素如m y c o b a c i l l i n f 5 4 1 p 0 l y m r i 1 1 o c 诅p e p t i n s z w i t e n 血c i l l 5 5 1 a p s l 5 6 l p 1 2 7 1 a z o x y b i 1 1 0 5 刀 b a c i l y s i n 5 8 1 g m m i c i d i i ls 是b 6 田 括产生的一个由完全一致的两个5 肽首尾相连 组成的环状短肽抗生素 5 4 1 l a l a 和一个稀有氨基酸l a 埘c a p s i i l 组成 是一个最 简单的多肽抗生素 a z o x y b a c i l l i n 由一个脂肪氨基酸和甲基偶氮氧侧链组成的抗 生素 b c a t r a c i n 是分支环肽抗生素 1 2 1 3 挥发性抗菌物质 很多微生物能够产生挥发性抗菌物质 a 丑t i 触g a lv 0 1 a t i e s a f v s m o o r e l a n d e c k 一5 9 1 最早报道蜡样芽孢杆菌能够产生对乃函旃d 如硎口如1 唾眺具有 活性的a f v s f i d d 锄a i l 研究表明枯草芽孢杆菌n c m i b l 2 3 7 6 在植物根部和堆肥 中能够产生具有广谱抗真菌活性的灿 s 但在沙土中检测不到a f v s 其对芽孢 杆菌生防作用的贡献可能是辅助性的 6 0 1 但目前还未见a f v s 种类与结构研究的 报道 1 2 1 4 其他抗菌物质 酚类物质 如b s 6 f 池b 9 9 8 7 产生的拮抗物质f 6 1 异构香豆素 如海洋生境的芽孢杆菌产生的一类拮抗物质 多烯类物质 己报道的多烯类化合物有b a c i l l a e n e d i m c i c i n x v m 陆c i d i n f 6 2 j 枯草芽孢杆菌b 2 菌株产生的抗小麦赤霉病菌 g 汤6 p 愆玩z p 口p 的胞外物质也属于多烯类抗菌物质 6 3 含有双糖的氨基糖苷 如由蜡状芽孢杆菌 c p r 毋 u w 8 5 分泌的化学结构 为3 一氨基一3 脱氧 d 一葡萄糖的拮抗物质 1 2 2 拮抗物质对植物病原真菌的作用 拮抗作用指微生物通过分泌一种或多种拮抗物质 作用于病原菌的细胞壁 细胞膜和蛋白质合成系统等 从而直接抑制或杀死病原菌 拮抗作用是拮抗生物 防治植物病害的一个重要机理 可通过以下途径来抑制物病原菌 1 2 2 1 作用于病原菌的细胞壁 生防菌对病原真菌的作用与真菌细胞壁的结构有关 病原真菌细胞壁成分较 复杂 大多含有几丁质 罗 1 3 葡聚糖 蛋白质和脂类等成分 删 因此 降解真 1 3 山东师范大学硕士学位论文 菌细胞壁需要多种酶的共同作用 细胞壁降解酶是芽孢杆菌产生的一类重要的抗 菌蛋白 伯杰细菌鉴定手册中芽孢杆菌属全部4 8 个种都可以分泌一系列可溶性胞 外酶 6 5 1 以前的一些研究已经表明细胞壁降解酶类如几丁质酶 蛋白酶 葡聚糖酶可 以降解真菌细胞壁 6 6 而且在防治植物病害方面起到了一定的作用 6 7 1 k 0 b a y a s l l i 等已经证明 朋口鲫五加的生防机制涉及胞外蛋白酶和几丁质酶的分泌 3 9 如果 真菌细胞被溶解或细胞壁被降解 那么就可以初步认为是细菌产生的细胞壁降解 酶在起作用 而且一旦细胞壁被破坏 以微生物就很容易被其他生物侵染 很容 易受其他物理和化学因子的影响 3 s 对病原菌造成更大的伤害 1 几丁质酶几丁质是自然界中最丰富的天然聚合体之一 也是一些有机 体的重要组成部分 如昆虫的外骨骼 甲壳类的贝及真菌和藻类的细胞壁 3 6 通 过现代细胞化学技术结合荧光和电镜技术可以观察到真菌菌丝顶端及侧壁里层 有几丁质存在 6 引 由此可以推断几丁质酶在真菌细胞壁降解过程中可起到重要作 用 某些细菌属 如 口f 妇 筇p 如朋d 咒傩 阳砌等可以分泌几丁质酶 6 9 1 并 且部分菌株也已经表现出防治某些植物真菌病害的潜在能力 2 9 7 0 1 几丁质酶生防 菌株对土传病害中的菌核病 丝核菌病和镰孢茵病等土壤习居性病害具有较好的 生防效果 这与该类病原所处的环境和病原形态解剖学特征有关 芽孢杆菌属产生的几丁质酶在植病生防中的应用研究很广 且册6 砌sw 1 1 3 在s c s p 培养基上 含几丁质 表现出广谱的抗真菌活性 可以引起fd 砂妒d 朋扔 菌丝膨胀和分解 几丁质酶在菌丝膨胀和分解中起到重要作用f 7 从百合根际分 离的拮抗细菌b c p 愆淞2 8 9 可以产生至少两种几丁质酶 c l l i c w c k c h 其 中c h i c h 对引起百合叶枯病的b d 砂如p 朋功觑的孢子萌发有抑制效果 7 2 曰 c e 坨淞q q 3 0 8 在s c s p 培养基上产生包括几丁质酶 脱乙酰几丁质酶 蛋白酶在 内的抗真菌水解酶类 对fd 砂印d 础扰 凡盯口一 所舳肠耐 口甩d 毋砌f 姗2 厅f 肌 m 菌 丝生长有明显的抑制作用 其培养液可抑制病菌孢子萌发和芽管伸长 7 3 2 夕 1 3 一葡聚糖酶夕 1 3 葡聚糖酶在植物病害防治过程中也起到了不可 替代的作用 产生口 1 3 一葡聚糖酶的咫例如聊d l 口c 印口d 一个株系 可减少 r s o 缸万f 伽砌肌加必i f 和 m 聊扰厅砌 聊产生的危害 有研究表明 木霉菌产 生的夕 1 3 葡聚糖酶能够抑制植物病原菌的孢子萌发和菌丝生长 7 4 3 蛋白酶芽孢杆菌是重要的工业用蛋白酶生产菌株 有关芽孢杆菌产蛋 白酶的报道很多 a i ll h 等分离到对根结线虫具有杀灭活性的根际细菌 发现 1 4 山东师范大学硕士学位论文 芽孢杆菌i m 2 1 9 产生的一种胞外表皮降解蛋白酶a p r 2 1 9 是重要的作用因子 这与 以前报道的可产生表皮降解蛋白酶的杀线虫芽孢杆菌剂口m 帕口c f 船 缸f p 阳 p d 淞g 4 肋c 讲淞b 1 6 类似 从根际其他4 株杀线虫芽孢杆菌中也扩增到 该表皮降解蛋白酶基因 另外 除a p r 2 1 9 外还有另一种中性蛋白酶n p r 2 1 9 具有拮 抗线虫活性 表明杀线虫芽孢杆菌中大量存在的表皮降解蛋白酶在该拮抗体系及 控制土壤线虫数量中发挥了重要作用 7 5 1 生防菌对病原真菌的降解与真菌细胞壁结构有关 国外有人从引起植物枯萎 病的尖孢镰刀菌 聊d 翮 的细胞壁中鉴定了一种能够提高其致病性和对 植物防卫蛋白具有抗性的糖蛋白 f e m l 其含量约占整个细胞壁重量的 5 0 6 0 并证明其同样存在于其他丝状真菌中 7 6 1 这表明生防菌对病菌细胞 壁的降解可能离不开蛋白酶的作用 s 矗阴d 抑 d 册d 刀 肌口厅印五肼口w 8 1 用来防治 由腐霉引起的猝倒病 主要是通过产生胞外蛋白酶 此酶纯化以后在离体的条件 下对矽p 踊m 班 肋竹 m 有很好的抑制作用f 6 6 1 g a c t om 等研究 z 玉册垅d l p d 厂口 幽口z c 阳胞外酶对酵母细胞的降解作用时发现 作为细胞壁重要骨架成分的葡聚糖 因受到外层蛋白类物质的保护而免于被降解 证明了蛋白酶在降解真菌细胞壁时 协同夕 1 3 葡聚糖酶发挥了重要作用f 7 7 同时 有研究表明 蛋白酶过量表达的 生防哈茨木霉 历幽d 如册口鼬 z 妇玎 m 突变株 7 8 及转蛋白酶基因的重组生防哈 茨木霉 z j l 口 z 砌 l 聊 7 9 显示了更高的生防活性 c o l 啪等用转座子诱变嗜麦 芽寡养假单胞菌 加口鲫厅讹 获得的过量表达胞外丝氨酸蛋白酶的菌株 提 高了该菌对终极腐霉 p 厅f 棚甜朋 的防效 6 6 l 这表明作为细胞壁降解酶之一的 蛋白酶在植病生防中具有巨大的应用潜能 1 2 2 2 作用于病原菌的细胞膜 细胞膜是一种半透性膜 是细胞的选择性屏障 生防菌产生的拮抗物质 如 某些抗生素 作用于细胞膜 从而破坏其屏障功能 纳他霉素 n a t a m y c i n 是 由纳塔尔链霉菌 刀口细肠凇话 经发酵产生的抑菌物质 它属于多烯大环内脂类 抗真菌剂 作用于真菌细胞质膜 与质膜中含有