（生物化学与分子生物学专业论文）构建六邻体蛋白嵌合的5型腺病毒载体.pdf

浙江理工人学硕士学位论文 摘要 腺病毒( a d ) 载体以其高效感染众多种类细胞而作为基因运输载体在人类基因治疗中 广泛用。然而，大多数人群体内存在固有腺病毒抗体并且在首次注射腺病毒载体后迅速产 生大量免疫中和抗体会严重阻碍腺病毒的再次摄取和治疗基因表达，这已成为限制腺病毒 载体应用的瓶颈。为了克服载体免疫反应并且同时增强靶向性和促进基因持续表达，科学 家们所尝试的方法有抑制机体免疫、免疫调节、变换血清型、使用靶向性腺病毒载体、腺 病毒载体微胶囊、使用依赖于辅助病毒的腺病毒载体、开发使用非人类腺病毒载体以及修 饰腺病毒六邻体蛋白。其中直接改变腺病毒外壳蛋白结合中和抗体的免疫决定簇，这是逃 逸宿主免疫中和反应的最简单有效的策略。六邻体蛋白由于具有种属特异性的蛋白决定 簇，所以我们在改造六邻体蛋白方面进行了有益的尝试。 六邻体蛋白是组成腺病毒外壳的主要蛋白，每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体， 单体是大于9 0 0 个氨基酸残基的复杂蛋白。x 射线显示a d 5 的六邻体分子每个单体有一个 六面体的“基底”和暴露在外面的“塔尖 ，三个表面环状结构l o o p l 、l o o p 2 和l o o p 4 交叉盘错构成了塔的主要部分。对不同血清型腺病毒的六邻体序列进行比对后发现，编码 基底的序列是高度保守的，而编码暴露在外面的环的序列是高度变化的。其中编码l o o p l 的序列具有最大的差异性。 之前的研究表明不同亚型腺病毒之间全部替换a d s 六邻体蛋白基因往往导致不能包装 出病毒颗粒，所以我们采取部分精确改造六邻体蛋白的策略。首先，我们将非复制腺病毒 a d e a s y 六邻体结构的o o p l 基因替换为a d l l 构建了a d e a s y h e x o n a d l l l o o p l 腺病毒。其 次，我们将内源启动子调控的溶瘤腺病毒载体a d 2 0 5 的o o p l 基因中的h v r $ 进行替换， 构建了新型腺病毒载体a d 2 0 5 h v r l l ( 1 6 1 。我们通过连接的方法而不是细菌重组或者2 9 3 细胞内重组构建了两种5 型腺病毒载体的骨架质粒，并且在h e k 2 9 3 中进行了病毒包装实 验。实验结果表明，将l o o p l 基因替换为a d l l 仍然会破坏六邻体蛋白与周围粘结蛋白的相 互作用，从而阻碍病毒自身进行包装，最终没有得到成熟的改造后的腺病毒颗粒。而仅仅 改变h 己s 则可以避免改动六邻体蛋白的保守区域和核心结构，从而顺利包装出嵌合了1 1 型六邻体蛋白的5 型腺病毒，并且从病毒包装速度和转染效率可以看出改造后的 a d 2 0 5 h v r l l ( 1 6 ) 与未改造病毒相比其病毒稳定性等特征几乎没有受到影响。 这个课题首次用，b 亚型a d t t 腺病毒六邻体蛋白包装a d 5 基因组，并且得到了六邻体 蛋白嵌合的新型腺病毒a d 2 0 5 h v r l l ( 1 6 ) ，这为避免宿主对a d 5 载体的天然免疫及免疫中 和反应提供了新的思路，并且为今后进一步修饰腺病毒外壳蛋白提供了有用的数据。 i 浙江理工大学硕士学位论文 关键词：免疫逃逸；六邻体蛋白；5 型腺病毒载体；肿瘤基因治疗 n 浙江理工大学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o no fh e x o n c h i m a e r i ca d 5v e c t o r a b s t r a c t a d e n o v i r a l ( a d ) v e c t o r sc a l le f f i c i e n t l yt r a n s d u c eab r o a dr a n g eo fc e l lt y p e sa n dh a v eb e e n u s e de x t e n s i v e l yi nh u m a ng e n et h e r a p yf o rg e n ed e l i v e r ya p p l i c a t i o n s h o w e v e r , p r e v i o u s l y e x i s t e da n t i b o d i e si nt h em a j o r i t yo fh u m a np o p u l a t i o na n di n d u c t i o no fn e u t r a l i z i n ga n t i b o d y a f t e rt h ef i r s tu s eo fa d e n o v i r u sv e c t o r sw h i c hs e r i o u s l yb l o c k sa d e n o v i r u su p t a k ea n dr e d u c e s t r a n s g e n ee x p r e s s i o nb e c o m eam a j o rl i m i t a t i o ni nt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n i no r d e rt oo v e r c o m e v e c t o ri m m u n i t ya n di m p t o v et h et r o p i s ma n dd u r a t i o no ft r a n s g e n ee x p r e s s i o ns c i e n t i s t sh a v e d e v e l o p e dan u m b e ro fs t r a t e g i e si n c l u d i n gi m m u n o s u p p r e s s i o n ，i m m u n o m o d u l a t i o n ，s e r o t y p e s w i t c h i n g ，u s eo ft a r g e t e da dv e c t o r s ，m i c r o e n c a p s u l a t i o no fa dv e c t o r s ，u s eo fh e l p e r - d e p e n d e n t ( h d ) a dv e c t o r s ，d e v e l o p m e n to fn o n h u m a na dv e c t o r sa n dm o d i f i c a t i o no fh e x o np r o t e i n h o w e v e r , t h es i m p l e s ta n dm o s te f f e c t i v ew a yi st od i r e c t l yc h a n g et h ed e t e r m i n a n te p i t o p ew h i c h i n t e r a c t sw i t ht h en e u t r a l i z i n ga n t i b o d y a st h eh e x o np r o t e i nh a st h es p e c i f i ce p i t o p ew h i c h d e t e r m i n e st h ed i f f e r e n ts u b g r o u p ，w et r yt oe x c h a n g et h eh e x o np r o t e i nw i t ho t h e rs e r o t y p e a d e n o v i m s t h eh e x o nc o n t r i b u t e st h em a j o r i t yo ft h ea d e n o v i m sc a p s i d e a c hh e x o nc a p s o m e r ei sa h o m o t r i m e ro fa na p p r o x i m a t e l y9 0 0 一a m i n o a c i d l o n gp o l y p e p t i d e x r a yc r y s t a l l o g r a p h yo ft h e a ( 巧h e x o nt r i m e rh a sr e v e a l e dah e x a g o n a l “p e d e s t a l b a s ef r o mw h i c ha “t o w e r r e g i o np r o j e c t s o u t w a r di n t ot h es o l v e n t t h r e es u r f a c el o o p s ，l 1 ，l 2 ，a n dl 4 ，f r o me a c hm o n o m e ri n t e r d i g i t a t e t of o r mt h et o w e rd o m a i n ac o m p a r i s o no fh e x o ns e q u e n c e sf r o ms e v e r a ld i f f e r e n ts e r o t y p e s i n d i c a t e st h a tt h es e q u e n c e se n c o d i n gt h ep e d e s t a la r eh i g h l yc o n s e r v e dw h e r e a st h o s ee n c o d i n g t h eo u t w a r d l yd i s p o s e dl o o p ss h o wc o n s i d e r a b l ev a r i a b i l i t y t h es e q u e n c ee n c o d i n gt h el 1l o o p e x h i b i t st h eg r e a t e s td i v e r s i t y b e f o r eo u rs t u d yw ek n o wt h a te x c h a n g et h eh e x o np r o t e i nb e t w e e nt w od i f f e r e n ts e r o t y p e g e n e r a l l yc a nn o tp a c k a g et h ev i r u s ，s ow eo n l yc h a n g ep a r to ft h eh e x o ng e n ea n dm o d i f ) 7i t p r e c i s e l y f i r s t ，w ee x c h a n g et h el o o p l o fh e x o ng e n eb e t w e e na d e a s yw h i c hc a nn o tr e p l i c a t ea n d a d l lw h i c hb e l o n g st os u b g r o u pb ，a n dw eg e ta d e a s y - h e x o n a d l l l o o p l s e c o n d ，w em o d i f y o n c o l y t i ca d 2 0 5w h i c hh a se n d o g e n e s i sp r o m o t e ra n dc a nr e p l i c a t ei nt u m o rc e l l gb yo n l y e x c h a n g eh v r s ，a n dw eg e tt h en e w v i r u sa d 2 0 5 h v r l l ( 1 - 6 ) w e g e tt h ep l a s m i do fa d e n o v i r u s b yl i g a t i o nb u tn o tt h er e c o m b i n a t i o ni nb a c t e r i ao ri n2 9 3c e l l s t h er e s u l to ft h ef i r s te x p e r i m e n t i n d i c a t e st h a te x c h a n g el o o p lo fa d e a s ya n da d l lw i l ls t i l ld e s t r o yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n h e x o na n do t h e rc a p s i dp r o t e i n ，t h o nt h i sw i l lb l o c kt h ev i r u sp a c k a g e ，s ow ec a l ln o t g e tt h e i i i 浙江理工大学硕士学位论文 m a t u r ep a r t i c l eo ft h em o d i f i c a t i o nv i r u s n e v e r t h e l e s s ，i fw eo n l yc h a n g et h eh v r sw i t h o u t m o d i f y i n gt h ep r e s e r v er e g i o na n dt h ec o r es t r u c t u r eo fh e x o n ，w ec a i ls u c c e s s f u l l yp a c k a g et h e c h i m a e r i ca d e n o v i r u sa d 2 0 5 h v r l l ( 1 - 6 ) m o r e o v e r ，a d 2 0 5 h v r l l ( 1 6 ) d o e sn o tc h a n g ei t s c h a r a c t e rs u c ha ss t a b i l i t ya n dt r a n s f e c t i o n i nt h i sp r o g r a m ew et r yt op a c k a g ea d 5g e n o m eb ya d l lh e x o np r o t e i nf o rt h ef i r s t t i m e ，a n df o r t u n a t e l yw eg e tt h eh e x o nc h i m a e f i ca d e n o v i r u sa d 2 0 5 h v r l l ( 1 - 6 ) t h i si san e w s t r a t e g yf o re l u d i n gt h ei n n a t ei m m u n i t ya n dn e u t r a l i z a t i o nt oa d s ，w ea l s oo f f e ru s e f u ld a t af o r f u r t h e rm o d i f y i n ga d 5c a p s i d k e y w o r d s ：i m m u n ee v a s i o n ；h e x o np r o t e i n ；a d 5v e c t o r ；c a n c e rg e n et h e r a p y i v 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意 义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论 文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 交回学校授予的学位证书； 2 学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害， 进行公开道歉。 4 本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名：獬 日期：2 丛年月丝日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 一学位论文作者完全了解学校有关保留j 一使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口在 不保密口 。 学位论文作者签名：莎p 车j 殍 日期： 硼8 年3 月甜日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：跨缸 日期：如霹弓月7 侈日 浙江理工大学硕士学位论文 第一章前言 恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织不完全统计，全世界 每年死于癌症的患者达70 0 00 0 0 人，全世界平均每6 秒钟就有1 人患恶性肿瘤，约每1 0 个死亡的人群中就有一人死于恶性肿瘤。三十年前中国肿瘤发病人数每年仅为5 0 00 0 0 万， 而目前每年新增的肿瘤患者人数高达2 0 00 0 0 ，死亡人数为1 5 00 0 0 。我国现有肿瘤患者约 45 0 00 0 0 ，并呈逐年增长的趋势。第十一届全国肿瘤防治宣传周期间，国家卫生部公布了 一条惊人的数字：目前中国因癌症而死亡的人数已跃居各类死亡原因之首，在未来的二十 年内肿瘤的死亡人数还可能翻一番。恶性肿瘤发病率高，治疗困难，对于早期癌症患者， 一般采用传统的治疗方法如手术、放疗、化疗等，但对很多种晚期肿瘤病人来说，这些传 统治疗方法也是束手无策，因此临床上急待研究寻找一种更有效地治疗或缓解恶性肿瘤临 床体症的治疗方法以取代或辅助现有的传统治疗方法。 基因治疗作为近年来兴起的一种生物高新技术已经为恶性肿瘤的根治带来了新的希 望。基因治疗的概念一经提出就很快被用应于肿瘤的基因治疗，迄今为止在临床上围绕已 经开展的人类重大疾病的基因治疗研究方案中肿瘤的基因治疗占6 3 以上。基因治疗【1 】是 指通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人类自身基因结构 或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等方法从而达到治疗疾 病的目的。与现有的其他治疗方法和策略相比，基因治疗的特点在于直接通过基因水平的 操作和介入给予治疗或控制疾病。基因治疗被认为是生物医学和药学领域内的一次革命， 从根本上改变了现行临床医学治疗模式和观念，是当今生物医学发展最重要的里程碑，同 时也必将对传统制药业产生深远影响。 1 1 肿瘤基因治疗 肿瘤的基因治疗是基因治疗的最重要组成部分。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已 取得了重大进展，对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异， 显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长以及防止 肿瘤的转移。研究资料显示肿瘤的基因治疗临床应用已显示出一定的疗效且发展前景广 阔，但是现还不能充分地满足临床上治疗肿瘤患者的需要，目前肿瘤的基因治疗仍主要应 用于晚期的恶性肿瘤患者，特别是放疗或化疗失败的病人。肿瘤基因治疗成功与否最大程 7 浙江理工大学硕士学位论文 度上取决于治疗基因是否能被有效传递到肿瘤组织细胞以及治疗基因能否在肿瘤组织细 胞内高效特异地表达及其所产生的生物学活性。要解决这方面的问题主要从研究基因传递 载体和启动外源基因表达的调控以及选择什么样功能基因作为切入点，研究新的肿瘤靶向 性表达载体及选择合适的功能基因，使治疗基因不仅能被有效地传递到肿瘤组织，并且在 肿瘤组织内高效和专一性地表达，从而使功能基因在体内产生较高的生物学活性而发挥抗 肿瘤作用【2 捌 肿瘤基因治疗的具体操作方法是利用病毒或非病毒载体将治疗基因导入患者体内从 而直接杀伤肿瘤细胞；还可通过激活机体免疫系统或切断肿瘤组织供血等途径间接杀死肿 瘤细胞。肿瘤基因治疗的最初阶段是将目的基因克隆到表达载体上直接转移到细胞内使其 表达从而发挥抗肿瘤作用。但肿瘤的基因治疗在临床上治疗效果总是不够理想，往往不能 达到根治肿瘤及缓解肿瘤临床体症的目的。 1 1 1 肿瘤的基因病毒治疗 在肿瘤的基因治疗难以取得实质性进展的情况下，中科院上海生命科学院刘新垣院士 提出一种肿瘤治疗的新策略：肿瘤的基因病毒治疗【4 1 。其基本观点是：在肿瘤特异性增殖 病毒中加入抗癌基因，将肿瘤的基因治疗与病毒治疗结合起来。这种方案与传统基因治疗 使用病毒载体有本质的不同。所谓载体，从本意上讲，是一种基因运送工具，即将抗癌基 因运送至肿瘤细胞内，而其载体本身而言，并没有治疗作用。而基因病毒治疗是利用肿瘤 特异性增殖病毒将基因运送至肿瘤细胞内，其抗癌基因随着病毒在肿瘤细胞中复制，基因 的拷贝数也成千上万倍增加，基因的表达量大大提高；同时，作为载体的病毒依然具有杀 死癌细胞的能力。肿瘤的基因病毒治疗一方面克服了传统肿瘤基因治疗的转染效塞低、靶 向性差、抗癌基因表达量低的缺点，另一方面也克服了病毒治疗对肿瘤杀伤力不足的缺点 【5 1 ，因此，肿瘤的基因病毒治疗预期比单纯的基因治疗或病毒治疗效果要好。近年来，以 病毒为载体的基因病毒治疗成为肿瘤学研究领域的又一热点且取得了一定的成绩和新的 突破。这主要得益于近3 0 年来分子生物学、病毒学及肿瘤学的飞速发展以至多个病毒基 因组的测序工作的完成和对病毒基因的结构及其功能较为详细的了解。 1 1 2 病毒载体的选择 人们研究比较广泛和深入的病毒载体包括：逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺柜关病毒、 腺病毒、慢病毒和新城疫病毒等。在所有已经开发的病毒载体中，以腺病毒最为优越，大 8 浙江理工大学硕士学位论文 量研究资料表明利用靶向性腺病毒载体将目的基因导入肿瘤细胞治疗癌症具有广阔的应 用前景1 6 1 。近年来腺病毒载体成为肿瘤和代谢疾病的基因治疗基因治疗中最为普遍应用的 载体是由于它具有以下重要优点【7 1 ：腺病毒感染不以细胞是否增殖为必要条件，既可以 感染分裂期细胞，也可以感染非分裂期细胞；感染的细胞种类广泛，人类的大多数体细 胞均可被不同血清型的腺病毒所感染；所携带的治疗基因在体内非常稳定，极少出现载 体转入细胞后基因重排现象：腺病毒基因组不整合到细胞染色体上，不会对细胞基因组 造成影响；腺病毒本身没有包膜，进入人体后不易被补体所灭活，可直接静脉注射； 腺病毒载体的效价高，其病毒滴度可达1 0 9 - - 1 0 1 1 c f u m l ，可以满足临床基因治疗的要求。 对腺病毒疫苗的长期开发研究证明，其疫苗临床应用未见明显副作用，这表明应用腺病毒 载体具有很好的安全性。 目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：e 1 区或者e l & e 3 缺失的载体被称作第一代腺 病毒载体；e 2 区或者e 2 & e 4 缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病 毒载体( h e l p e r - d e p e n d e n t a d ，h d a d ) 通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为 第三代腺病毒载体【8 】。 1 1 3 肿瘤特异性增殖腺病毒载体 肿瘤增殖病毒或溶瘤增殖病毒是指能在肿瘤细胞内特异性地增殖且杀伤肿瘤细胞的 病毒载体【9 1 。肿瘤增殖腺病毒是经改造的腺病毒载体之一：通过基因工程技术改造病毒基 因组使其在肿瘤细胞内的感染、复制以及溶解细胞作用能有效地增强，而在正常体细胞内 这种效应会减弱甚至消失，改造后的病毒载体可选择性地杀灭肿瘤细胞而不影响正常细 胞。研究资料表明该类载体是最具发展潜力的病毒载体【1 0 1 j 有些肿瘤增殖腺病毒已经进入 临床期试验性研究阶段，而且单独病毒治疗可与传统的放化疗相结合，为晚期肿瘤患者 的治疗开辟了一个新的治疗途径。 1 1 3 1 肿瘤特异性增殖腺病毒载体的研究现状 肿瘤增殖腺病毒的研究和应用近年来发展迅速，在2 0 0 0 年n i h r a c 报告的3 5 0 例基 因治疗的临床研究中，只有2 采取了增殖病毒溶瘤机制策略，而恰恰是这种方法取得了 最为辉煌的临床疗效。 最具代表性的肿瘤特异增殖腺病毒有两类：一类是剔除在正常细胞中复制必需的基 因，但在肿瘤细胞中病毒复制不必要的基因，从而提高选择性。最具代表性的是j a m e s 等 9 浙江理工大学硕士学位论文 1 9 9 6 报道的e 1 b 基因功能缺失的腺病毒株o n x y - 0 1 5 或称d 1 1 5 2 0 ，可以选择性地在p 5 3 突变的肿瘤细胞中裂解性增殖，目前o n x y - 0 1 5 已被证实对原发性和继发性肝癌、头颈部 鳞状细胞癌均有效，已进入到多个i i 、i i i 期临床试验，o n x y - 0 1 5 是肿瘤增殖腺病毒的第 一次飞跃。 另一类肿瘤增殖腺病毒是利用肿瘤或者某类细胞特异的基因调控元件控制一些必需 的病毒基因的表达，使这些基因只能在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而使 病毒只能在肿瘤细胞中复制、增殖。腺病毒e 1 a 基因是腺病毒感染细胞后最早表达的基因 【1 1 1 。e 1 a 蛋白的功能很复杂，它可以促进细胞进入s 期，即细胞周期的合成期，有利于病 毒的复制【1 2 】；同时，e i a 蛋白可以作为反式作用因子，激活病毒的基因，以及细胞内其他 基因的转录，促进病毒的复制。总之，e i a 基因是病毒复制所必需的。因此使用肿瘤特异 性启动子控制e 纠基因的表达，就能达到控制病毒复制的目的i b 】。其中以c v 7 0 6 为代表， 它的特点是以p s a 启动子控制e i a 基因表达，病毒只能在p s a 阳性细胞尤其是前列腺癌 细胞进行特异性增殖，该病毒现在已用于前列腺癌瘤内直接注射进行局部治疗的i 期临床 试验【1 4 l 。c n 7 0 6 第二代产品c v 7 8 7 ，是用两个p s a 启动子增强子分别控制腺病毒的e 1 a 和e 1 b 区，具有比c n 7 0 6 更好的靶向功能，目前也已经进入i 期临床试验i l 引。 1 1 3 2 肿瘤增殖腺病毒载体的发展方向 尽管肿瘤增殖腺病毒在抗肿瘤方面取得了一定的成绩，但是总体而言，目前，构建的 肿瘤增殖腺病毒还不完善，尤其是由于多数人群接触过腺病毒并且体内产生腺病毒特异性 抗体，而且二次应用同一种a d 载体会被首次应用产生的大量免疫中和抗体所中和，这种 载体的免疫反应限制了a d 载体在临床上的应用1 1 6 】。未来肿瘤增殖腺病毒载体的研究有几 个值得关注的方向：增殖腺病毒携带目的基因：目前已有多个研究所开始应用肿瘤特性 增殖腺病毒携带一些目的基因，如应用o n x y - 0 1 5 类似物携带大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶( c d ) 基因，可明显提高病毒对肝癌细胞的杀伤力。改造腺病毒外壳蛋白：改造纤维蛋白、 五邻体和六邻体蛋白等。寻找肿瘤特异性增强子及启动子控制病毒增殖必需基因，产生 新型肿瘤特异性增殖腺病毒。减少病毒的免疫原性：一种方法是更换不同血清型的腺病 毒载体；另一种是应用i l - 1 2 和干扰素r 抑制中和抗体产生。因此构建新型具有逃逸机体 免疫中和能力的腺病毒载体成为很有意义的一项工作。下面就降低肿瘤增殖腺病毒载体外 壳免疫原性的研究做一综述。 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 l n i t i a lt r a n s d u c t i o n w i t hh a dv e c t o r p o o r 曩# 1， 摹、 i n i t i a lt r a n s d u e t i 0 1 1 w i t hh a dv e c t o r g o o d r e p e a tt r a n s d u c t i o n u i t h dv e c t o r 图1 1 机体免疫反应成为腺病毒基因治疗中的障碍 f i gl 一1 - p r e e x i s t i n gi m m u n i t ya sab a r r i e rt oa d e n o v i r a l ( a d lg e n et h e r a p y 1 2 降低肿瘤增殖腺病毒载体外壳免疫反应的研究 1 2 1 降低载体免疫反应的意义 迄今为止已知有5 0 多种血清型的腺病毒可以感染人类细胞，分别属于a 、b 、c 、d 、e 、 f 六种亚型。由于腺病毒具有广泛存在的特性，大多数人群都接触过腺病毒并且在体内产 生血清型特异性的腺病毒抗体。目前最常用的腺病毒载体是在5 型腺病毒( a d 5 ) 基础上改 造的，而人体内普遍存在针对5 型腺病毒固有抗体，这使病人首次应用腺病毒载体时就有 相当有一部分腺病毒被抗体中和而不能到达靶细胞。除此之外，首次应用用腺病毒载体逆 行治疗之后，体内会迅速产生特异性的免疫中和抗体( n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y ) ，大量的中和 抗体直接作用于病毒衣壳蛋白，所以二次应用腺病毒载体会使大部分病毒被中和而无法达 到治疗效果( 如图1 1 ) 。 1 1 沁 浙江理工大学硕士学位论文 通过对5 型腺病毒进行改造，第一代和第二代腺病毒载体己经删除基因组的e 1 区、 e 2 a 、 e 2 b 和e 4 区，减少了晚期基因表达并且一定程度上降低免疫反应和毒性作用，但 是并没有促进基因持续表达；h d a d 系统删除了大部分腺病毒基因组提高了转染效率并且 延长了基因表达时间，但是在h d - a d 注射的动物体内同样有很高水平的体液和细胞免疫 反应【1 7 1 ，这表明病毒衣壳蛋白对于免疫反应的产生才是根本的。由于无论首次注射哪种类 型a d 载体都会引起不同程度的载体免疫反应，因此为逃逸载体免疫进一步改造传统a d 载体十分重要。 1 2 2 腺病毒载体引发的免疫反应 大量动物实验以及临床试验证明由于宿主的天然免疫应用高剂量腺病毒载体不可避免 会引起肝中毒和急性炎症反应。天然免疫反应是随着巨噬细胞和树突状细胞表面的识别受 体识别腺病毒载体表面分子排列而被激活的，之后又会激活多种信号通路( h ，女 i m a p k 、 n f 心) 从而级联放大许多细胞因子和化学因子如1 18 | i l - 6 、i l - 8 、i l 1 2 、t n f f l 、r a n t e s ( r e g u l a t e du p o na c t i v a t i o n ，n o r m a lt - c e l le x p r e s s e da n ds e c r e t e d ) 、i p 一1 0 ( i n t e r f e r o n i n d u c i b l e p r o t e i n1 0 ) 、m i p ( m a c r o p h a g ei n f l a m m a t o r yp r o t e i n ) - 1 b 和m i p 一2 等，进而会引发炎症反应。 研究表明腺病毒衣壳蛋白是载体进入人体之后激发免疫反应的主要因素【1 9 1 ，衣壳蛋白 被识别后会引发天然免疫，细胞免疫和级联放大的体液免疫。腺病毒感染引起的免疫反应 会产生中和抗体( n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y ) 和非中和抗体( n o n n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y ) ，其中中 和抗体保护宿主免受病毒再次侵染并且抑制病毒扩散，因此这种中和免疫反应是重复使用 a d 载体时影响治疗效果的主要原因。针对腺病毒载体的免疫中和反应来自两个方面：胞 外的中和反应是由抗纤维状抗体( a n t i f i b e r ) 和抗五邻体蛋白抗体( a n t i p e n t o n ) 介导的导 致病毒颗粒在细胞外聚合；胞内中和反应是由抗六邻体蛋白( a n t i h e x o n ) 抗体介导的阻 止病毒颗粒从胞内体( e n d o s o m e ) 释放到细胞质。由于胞内中和反应只需要一个抗六邻体蛋 白抗体就足以阻断一个病毒入侵因此成为人体避免腺病毒侵染最为有效的免疫途径。基于 此科学家们推测对六邻体蛋白的修饰可能是克服宿主免疫中和反应最为有效的策略【2 0 】。 1 2 3 腺病毒载体免疫逃逸的方法 1 2 3 1 抑制机体免疫或者免疫调节( i m m u n o s u p r e s s i o no ri m m u n o m o d u l a t i o n ) ：使用 传统免疫抑制剂( 如环孢霉素，脱氧精瓜素d s g ，f k s 0 6 和c t l a 4 i g 等) 抑制机体的天然 免疫系统或者特异性抗体( 如抗c d 4 单克隆抗体) ，可以暂时调节机体免疫，从而使宿主允 1 2 浙江理工大学硕士学位论文 许更多剂量a d 载体存活并且延长治疗基因表达。比如短期消耗掉肝脏巨噬细胞可以提高肝 脏基因表达并且降t f f , a d 载体注射入小鼠后产生的体液免疫反应【2 1 】。这种方法虽然能够抑制 机体天然免疫系统，但是副作用是显而易见的，长期使用会导致机体骨髓造血系统处于高 度抑制状态，机体免疫系统“敌我不分”，往往导致机体伴发严重的感染，同时还可诱发机 体癌变 1 2 3 2 腺病毒衣壳的共价修饰( c o v a l e n tm o d i f i c a t i o no f a dc a p s i d ) ：对a d 载体衣壳免 疫决定簇进行共价修饰可以在首次使用a d 载体时降低机体天然免疫反应。k 匕女i h d a d 载体 外壳蛋白进行聚乙二醇化修饰( p e g y l a t i o n ) 后在体内和体外不会降低腺病毒转染效率并 且降低了血清q 丁i l - 6 、i l 广1 2 和t n f a 等细胞因子的含量从而减轻炎症反应【2 2 1 。r a d 5 载体共 价连接聚乙二醇多聚物后能否有效避免机体免疫取决于在外壳选择的连接位点和连接效 率( t h ed e g r e eo f p e g y l a t i o n ，d p ) ，l e es 2 3 】用带有荧光素标签的p e g s p a ( s u c c i n i m i d y le s t e r o f p e gp r o p i o n i ca c i d ) 可以有效地检测在不同条件下聚7 , - - 醇多聚物连接r a d 5 载体的效率。 1 2 3 3 改变腺病毒载体与细胞表面受体之间的相互作用( a l t e r i n gn a t i v ea dv e c t o ra n d c e l ls u r f a c er e c e p t o ri n t e r a c t i o n s ) ：h a d 家族除了b 亚型之外，a 、c 、d 、e 和f 亚型都是 通过a d 纤维状部分( f i b e r ) 的球形结构( k n o b ) 与宿主细胞膜的c a r 受体相互作用的。因 此改变外壳蛋白的纤维状部分可以使a d 载体靶向不同种类的细胞并且增强载体靶向性。例 如：a d 3 5 的f i b e r 蛋白取替a d 5 , 的f i b e r 在治疗胶质神经瘤中已取得了良好效果【2 4 1 。s t o f f a 等 2 5 j 将a d 5 载体的f i b e r 分别用a d 3k n o b ( a d 5 3 ) 、犬a d2 ，e j k n o b ( a d 5 c a v - 2 ) 、r g d ( a d 5 r g d ) 、 多赖氨酸( a d s p k 7 ) 或者r g d 联合多赖氨酸( a d 5 r g d p k 7 ) 进行修饰，改造后的载体提高了 对不依赖于c a r 的纤维原细胞和角质化细胞的靶向感染能力。z h e n gs 等对纤维状部分改造 后构建的a d 5 p k 7 载体其纤维状部分的球形结构用包含了多聚赖氨酸结构域( p o l y l y s i n e m o t i f ) 并且可以结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖( h e p a r a ns u l f a t ep r o t e o g l y c a n s ) ，a d 5 - p k 7 载体 在人类胶质瘤移植细胞( h u m a ng l i o m ax e n o g r a f t s ) 中的基因表达竟然提高1 0 0 0 倍【2 6 】。另外， 将纤维状部分的k k t k 结构域缺失同时将五邻体( p e n t o n ) 的r g d 结构域缺失能有效降低 载体对表面为c a r 受体的细胞的结合效率，同时大大降低了由巨噬细胞引起的炎症反应， 但仍然能引起与蟠同样的体液免疫中和反应【明。 在为降低免疫而对纤维状部分加以造方面，m y h r e 等 2 s 】对纤维状部分b e r ) 自三球形 结构删除虽然改变了靶向性并且降低宿主天然免疫反应，但是对于降低机体的细胞免疫 和体液免疫反应作用很小。 1 2 3 4 载体微胶囊( v e c t o rm i c r o e n c a p s u l a t i o n ) ：使用纳米材料或者化合物( 缸聚乙二 1 3 浙江理j f 大学硕士学位论文 醇阳离子脂质体，聚乙烯乙二醇干扰素，双层离子脂质体，微球体脂质体复合物，可降解 藻酸盐微粒) 包裹a d 载体并保护载体躲过宿主免疫中和抗体，顺利感染细胞并且表达治疗 基因，但是包裹后的a d 载体比包裹前其基因表达水平降低5 0 7 0 【2 9 1 。最近l a m e i r om h 等【3 0 】 以胆汁盐( b i l es a l t s ) 作为与壳聚糖配对的阴离子，使壳聚糖( c h i t o s a n ) 发生凝聚从而制 备了一种载体用微胶囊，这种腺病毒载体微胶囊可以高效地感染粘膜上皮细胞。 1 2 3 5 改变血清型( s e r o t y p es w i t c h i n g ) ：腺病毒载体引起的体液免疫中和抗体是血清型 专一的，所以改变a d 载体的血清型可以克服免疫中和反应。b 亚型的h a d 是利用辅因子蛋 白( c o f a c t o r p r o t e i n ) c d 4 6 与受体作用的，最新结构学研究1 3 1 】发现了包括a d l l 在内的b 亚 型腺病毒与c d 4 6 作用的机制，二者相互作用时表面蛋白结构的弯曲变化是相当保守的。由 于b 亚型的h a d 可以识别与h a d 5 不同的受体，所以可以靶向不同种类的细胞。p e t e r a b b i n k 【3 2 】 等比较了b 亚型和d 亚型的6 种腺病毒，发现这两种亚型腺病毒在人群中并不普遍存在，人 体内很少存在针对它们的特异性抗体，因而可以逃逸h a d 5 载体特异的免疫中和抗体，所以 开发该类腺病毒做载体是一种很有意义一种策略。其中h a d l l 和h a d 3 5 并不普遍存在并且 h a d l l 和h a d 3 5 的n a b ( a n t i a d n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y ) 大大低于乩5 载体所以是很有希望 开发的病毒载体。r a d 3 5 1 3 3 】( r e c o m b i n a n t a d 3 5 ) 相比较h a d 5 载体很大程度上提高了携带 基因转染神经胶质瘤细胞的能力，因此在恶性胶质瘤基因治疗中成为很好的候选载体。 1 2 3 6 使用h d a d 载体( u s eo f h e l p e r d e p e n d e n t a dv e c t o r s ) ：h d a d 载体【3 4 】删掉了腺 病毒基因组中除包装信号和末端反向互补序列( i n v e r t e dt e r m i n a lr e p e a t s ，i t r ) 之外的其他 序列，因此相对于第一代和第二代腺病毒载体引起的体内免疫反应极大地减弱了，并且保 持了很高效的转染效率和靶向性。目前h d a d 载体已经应用于多种器官比如肝脏和肌肉以 及中枢神经系统，在啮齿类和灵长类实验动物中都表现出高水平且长期的基因表达。在 h i ) a d 载体中插入四环素调控元件( t e t r a c y c l i n e d e p e n d e n t ，t e t o n ) 1 3 5 j 后，在鼠脑神经元 细胞和星型胶质细胞中有高效且可调控的基因表达，即使其体内存在a d 5 n a b ，小鼠大脑中 仍可以高效表达基因，说明h d a d 载体可以有效逃避5 型腺病毒引起的免疫中和反应。 m a r i a n e l ac a n d o l f i 3 6 等人用h d a d 载体分别转染不同种类的多形性胶质母细胞瘤 ( g l i o b l a s t o m am u l t i f o r m e ，6 b m ) ，研究表明尽管不同细胞表面与腺病毒进入细胞有关的三 种分子c a r ( c o x s a c k i ea n da d e n o v i r u sr e c e p t o r ) 、i n t ( i n t e g r i na v 6 3 ) 和m h c i ( m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e xc l a s si ) 表达量不相同，但是并不影响h d a d 载体携带编码基因的 高效表达。然而，h d a d 载体需要辅助病毒( h e l p e rv i r u s ) 通过反式作用提供各种病毒蛋 白，但在目前最常用的c r e 1 0 x p 系统下辅助病毒含量仍然达到0 1 1 ，如何将辅助病毒的 1 4 浙江理工大学硕士学位论文 含量降到最低是h d a d 载体系统仍需解决的问题。 1 2 3 7 使用非人类