（无机化学专业论文）系列铬（Ⅲ）配合物与牛血清白蛋白作用的光谱研究.pdf

捅姜 铬是哺乳动物的一种重要微量元素 它是维持正常的碳水化合物 和脂类化合物新陈代谢过程所必需的元素 血清白蛋白 s e r u m a l b u m i n 是人和哺乳动物体内血浆中含量最丰富的蛋白 推测其可能 对金属离子的转运起到重要作用 蛋白中的色氨酸内源荧光使其可以 用作局部构象变化的探针 用以对小分子与蛋白的结合反应进行定性 和定量研究 本文对系列铬 配合物 c r s a e n 2 c i s a c r s s a e n 2 s s a c r a s a e n 2 c i a s a c r n s a e n 2 c i n s a 与牛血清白蛋白的作用进行 了光谱研究 首先 使用荧光光谱观察了四个配合物与b s a 的作用 计算得 到了其作用的结合常数分别为k s a 2 3 4 x 1 0 4 k a s a 3 3 5 x 1 0 4 k s s a 2 0 2 x 1 0 4 k n s a 4 0 3 1 0 4 m 其次 通过同步荧光光谱监测表明 配合物与b s a 摩尔比为1 l 时 与b s a 的作用引起了b s a 荧光强度下降 主要原因是四种配合 物结合于b s a 第2 1 2 位t r p 残基附近位置而发生能量转移 并没有 改变t r p 的微环境 随着配合物浓度的增大 t r p 的荧光强度不仅有 所下降 且荧光峰位红移了5n m 表明此时b s a 的构象发生了变化 最后 根据热力学参数与作用力的关系可知 配合物与b s a 之 间以疏水作用为主 从分子结构可知配合物与b s a 之间也存在静电 作用 但从作用过程热力学参数 日对a g 的贡献较小的实验结果判 断 静电作用不是主要的 疏水作用是主要的 配合物与b s a 之间 的结合是熵驱动自发过程 关键词 牛血清白蛋白 铬 1 i i 酉e 合物 荧光光谱 紫外吸收谱 系列铬 i i i 配合物与牛血清白蛋白作用的光谱研究 a b s t r a c t c h r o m i u mi sa ne s s e n t i a lt r a c ee l e m e n tf o rm a m m a l sa n di sr e q u i r e d f o rm a i n t e n a n c eo fp r o p e rc a r b o h y d r a t ea n dl i p i dm e t a b o l i s m b e i n gt h e m o s ta b u n d a n tp r o t e i ni nb l o o dp l a s m a s e r u ma l b u m i n s a m a y b ep l a y s a ne s s e n t i a lr o l ei nt h et r a n s p o r to fm e t a li o n t h ei n t e r a c t i o no fs m a l l m o l e c u l e sa n dp r o t e i nc a nb ei n v e s t i g a t e du s i n gt h et r pa sa ne f f e c t i v e s t u d i n gc o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo ra r o m a t i cr e s i d u e m i c r o e n v i r o n m e n t c h a n g ep r o b e t h er e a c t i o n sb e t w e e nas e r i e so fc o m p l e x e so fc h r o m i u ma n db s a h a v e b e e nm e a s u r e db ym e a n so ff l u o r e s c e n c ea n ds y n c h r o n i z a t i o n f l u o r e s c e n c es p e c t r ai nt h i sp a p e r t h er e s u l t ss h o wa sf o l l o w s f i r s t l y t h ec o n d i t i o n a lb i n d i n gc o n s t a n t sa r ek s a22 3 4 x 10 4 k a s a2 3 3 5 x1 0 4 k s s a 2 0 2 x1 0 4a n dk n s a 4 0 3 1 0 4 m r e s p e c t i v e l y i n a d d i t i o n u s i n gs y n c h r o n i z a t i o n f l u o r e s c e n c e s p e c t r a w h e n b s a c o m p l e x e s r a t i oi s1 1 t h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fb s a d e c r e a s e s w h i c hi sa t t r i b u t et ot h ec o m p l e x e sb i n d i n gt or e s i d u e sn e a r t r p212a n dt h e nh a v i n gt h ee n e r g yt r a n s f e r h o w e v e r t h ee n v i r o n m e n t a r o u n dt r ph a sn o tb e e nc h a n g e d w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f t h ef o u rc o m p l e x e s t h e r en o to n l ye x i s t st h ed e c r e a s ei ni n t e n s i t yb u t e m i s s i o n 九 s h i f t i n g f r o m3 4 3t o3 4 8n m i n d i c a t i n gt h a tt h e c o n f o r m a t i o no fb s ai sc h a n g e d a c c o r d i n gt o t h er e l a t i o n sb e t w e e nt h et h e r m o d y n a m i c sp a r a m e t e r s a n da c t i n gf o r c e i ti m p l i e st h a tt h eb i n d i n gb e t w e e nc o m p l e x e sa n db s a b e l o n g sm o s t l y t oh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n b a s e do nt h em o l e c u l a r s t r u c t u r eo fc o m p l e x e sa n db s a t h e r ee x i s t si o n i ce f f e c t t o o h o w e v e r t h ee x p e r i m e n t a ls u g g e s t st h a te n t h a l p yd o i n gl e s sc o n t r i b u t i o nt oa g h y d r o p h o i b c i n t e r a c t i o n i s d o m i n a t i n g t h e r e f o r e t h ep r o c e s s o f i n t e r a c t i o nb e t w e e nc o m p l e x e sa n db s ai sd r i v e nb yp o s i t i v ee n t r o p y c h a n g e k e y w o r d s b o v i n es e r u ma l b u m i n s p e c t r a u vs p e c t r a c h r o m i u m m c o m p l e x f l u o r e s c e n c e i i 第一市综述 第一章综述 1 1 铬的生物功能研究 铬属于第一过渡系的 族 原子量为5 1 9 9 6 原子序数为2 4 银白色金属 质硬而脆 其密度是7 29 c m 3 熔点是18 5 74 2 0 c 沸点26 7 2 常见的化 合价态为0 2 3 6 随着价态升高 其氧化性增强 c r 具有很强的还 原性 在空气中不稳定 可被氧化成c r 而c r 主要与氧结合形成铬酸盐和重 铬酸盐 具有很强的氧化性 在酸性溶液中很容易被还原为c r c r 和c 在 生物体内存在的可能性很小 c r 是最稳定的价态 也是生物体内铬的主要存 在形式 铬的来源与分布一般以无机铬和有机铬两种形式存在 无机铬有 c r c l 3 6 h 2 0 c r 2 s 0 4 3 等 有机铬有酵母铬和螯合铬 如烟酸铬 吡啶羧酸铬 等 铬在动物体内以低浓度广泛分布于全身 肝脏 肺 肾脏 脾 禽类还有羽毛 是动物体内贮存铬的主要部位 被称为 铬库 组织和器官中铬的含量随年龄 的增长而下降 对哺乳动物而言 铬是一个很重要的微量元素 它是维持正常的碳水化台物 和脂类化合物新陈代谢过程所必需的 但是 试图在分子水平上解释铬的作 用却遇到了困难 目前的研究表明 铬结合的寡肽钙调蛋白在胰岛素信号的增大 过程中起到独一无二的作用 四十多年前 m e r t z 及其合作者发现铬是哺乳动物的一种重要微量元素 对饲喂专门饲糊的鼠的血液研究表明 铬缺乏会导致其不能对血糖的增加做出有 效的反应 现已证实 在食物中添加猪肾酸水解物或啤酒酵母这两种物质之一可 以改变这种情况 后来发现这两种物质都是富含铬的 而且在食物中添加简单的 铬盐 如c r c l 或铬钒合金 等物质同样可以改变葡萄糖的耐受量 我们把能改变 葡萄糖耐受量的饮食因素称为葡萄糖耐受因子 在过去的四十年里 这些结论不 断受到质疑 但是直到最近 2 0 世纪五一t 年代末 六十年代初的研究才被重视 现在的研究清楚的表明 严格控制环境条件 如避免不锈钢等 会引发鼠的 铬缺乏 铬缺乏的症状可以通过在食物中添加铬得以改变 食物中脂肪含量高会 使铬缺乏更严重 1 对人而言 已经明确观察到那些营养过剩的病人会出现铬缺 乏 表现出的症状与糖尿病人的相似 1 尽管如此 一些有威望的生物无机化学 家对金属离子在生物体系中的功能还是作了一个这样的评述 生物金属只包括 系列铬 配合物与牛m 清白蛋白作用的光漕研究 镁 钙 第一过渡系 除钪 钛 铬外 金属 钼 钨 镉和汞 1 为什么会出现 这样的分歧呢 事情很简单 如果铬是一个重要的营养元素 那么它一定与某个 特定的生物分子作用 发挥特定的生物功能 换言之 应该存在一种铬的天然生 物活性形式 可是截止综述时距第一次g t f 报道已经将近四十年了 还没有 足够的证据说明可分离并得到铬的生物活性形式 目前有三种含铬物质被认为有 生物活性 g t f c r p i c 3 l m w c r 实验室的工作人员决定去确认铬的特性 功能 生物活性作用模式 同时揭示铬影响糖和脂代谢及可能与糖尿病和心血管 疾病有关的机制 g t f g l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r 在明确了对铬的研究意义后 人们将努力的方向转到了寻找一个含铬的金属 有机物及其影响糖和脂代谢的可能机理 2 0 世纪六十年代初对附睾脂肪及稍后的 从铬缺乏的鼠中提取的脂肪研究表明 铬的作用与胰岛素有关 1 不幸的是 从这个观点出发导致了一些错误的工作 如尝试从b r e w e r s 酵母和猪l 肾粉末中 提取有生物活性的铬化合物 从b r e w e r s 酵母和酸消解猪肾粉末中提取的物质 很相似 b r e w e r s 酵母提取物可以很容易的大量获得 于是人们研究的目标都集 中到了b r e w e r s 酵母上 后来把b r e w e r s 酵母提取物也称为葡萄糖耐受因子 目前这个术语被广泛接受为专指b r e w e r s 酵母提取物 这在文献中曾经造成过 理解混乱 几个不同物质都被命名为g t f 显而易见 铬的活性形式是酸稳定 热稳定的维他命 含铬物质在b r e w e r s 酵母提耿物层析纯化之前的提取过程 中 在5mh c i 中回流18 小时的消解在很大程度上破坏了所有蛋白质和核酸组 分 幢1 提取物的组成推测为 铬离子 烟酸 甘氨酸 谷氨酸和半胱氨酸 但是这些结果无法在其它几个实验室得到证实 可是已经发现 在胰岛素的存在 下 b r e w e r s 酵母g t f 可以刺激铬缺乏鼠的脂肪细胞组织中的葡萄糖减少 g t f 影响葡萄糖代 i 的能力可以用动力学研究来解释 根据一系列胰岛素和 g t f 浓度下铬缺乏鼠体中提取的脂肪细胞造成的葡萄糖代谢速率 1 这些结论 表明g t f 在细胞中自身没有活性而仅仅是一个铬源 恢复铬缺失鼠细胞中的铬 池 l 一旦铬水平恢复了 g t f 实际上是禁止胰岛素催化葡萄糖代谢 可能是 因为g t f 结合了胰岛素 早期的推论 g t f 的本质功能是结合胰岛素 加强 其与胰岛素受体的相互作用 这些都是错误的 这些推论的得出首先是建立在铬 化合物与胰岛素在铬的非生理相关浓度下成键的 但是作者们自己指出浓度的矛 盾 现在这个实验室的大多数研究人员已经从猪肾和猪肾粉末中提取出了 第一章综述 l m w c r 这些物质酸消解后的产物与g t f 很相似f 1 因此 来源于哺乳动物 的g t f 可能由酸消解人工制得 为什么b r e w e r s 酵母聚集铬 它以何种方式聚 积铬至今还有疑问 吡啶甲酸铬c r p i c 3 g t f 中的烟酸成分的确认引起了人们合成烟酸铬化合物的极大兴趣 1 1 7 2 m c r 3 与吡啶乙酸 吡啶甲酸 异烟酸反应的产物在某些方面已经研究的很 深入1 2 i 在这些产物中 c r p i c 已经被研究的相当彻底并且成为一种很流行 的营养补充剂 作为营养补充剂 含有c r p i c 3 的产品每年的销售额达到l 亿美 元 有多种包装上市以方便人们获取 如片剂 口嚼片 运动饮料和营养条等 c r p i c 3 是一种吸收效果很好的补铬剂 而且被认为其有生物活性 2 5 的吸收率 对比食物的o 5 的吸收率 2 4 但是 c r p i c 3 并未显示出拥有任何自身活性 也不能在哺乳动物或其它有机体中天然生成 所以我们没有理由希望它会在体内 天然存在 特别是在组织中c r 3 和吡啶甲酸的浓度不太可能形成c r p i c 3 1 9 9 5 年 w e t t e r a h n 及其合作者对c r p i c 3 作为食品添加剂提出了疑问 他 们发现陔化合物对中国大颊鼠的卵巢细胞造成了浸润损伤 2 不幸的是他们的研 究使用的铬没有达到生理意义水平 因而他们的研究工作受到怀疑 最近这个实 验室的工作表明 在c r 3 的生理浓度 1 2 0r i m 生物还原剂例如抗坏血酸 硫 醇 5m m 条件下 c r p i c 3 会产生能切割d n a 的羟基自由基 2 6 这个性质源于 c r 与吡啶甲酸的螯合反应 配体改变了中心铬的氧化势 使得铬很容易被还原 还原态的铬与0 2 反应生成了还原态的氧 包括羟基自由基 这些结论与s u g d e l l 及其合作者早先的研究结果相一致 他们发现铬诱导有机体突变的物质形式中包 含有吡啶型n 与金属配位的螯合配体 i 近期的研究也表明c r p i c 3 在缓冲液1 2 引 合成胃液 中相当稳定 可以不受阻碍的穿过肠 随之发生的可能是c r p i c 3 可以完整地进入细胞 是存在潜在危害的形式 研究表明 补铬剂不能高效地把 铬释放到铬生物键合剂 如脱铁转铁蛋白口 a p o l m w c r 除非金属被还原到 c r 2 状态 因此 作为添加剂要起到铬源的作用 就必须把它归入到己被证实 的可导致接触反应产生自由基的化学反应类型中 在过去的十年问 科研工作者检验了定量饲喂鼠c r p i c 3 的效果 j 详细 检验含q c 3 补铬剂达到1 5 9 k g 的饮食饲喂2 4 周后的现象表明 对体重无影 响 对瘦肉与脂肪比例以及组织 心 睾丸 肝 肾 肌肉 脂肪细胞 脾 形态 尺寸或血液变化 紧密联系血清葡萄糖 胆固醇 胰岛素等 也没有影响 同时证 系列铬 1 1 1 蚍台物与 q j f l t 清白蛋白作用的光谱研究 明没有急性毒性效应 3 作为一个治疗非铬缺乏症的化合物 它对生长 脂肪组 织 葡萄糖 胰岛素 胆固醇水平不具有任何有益的影响 因此其作用受到质疑 当前这个实验室正在逐步研究测定c r p i c 3 的稳定性 亚细胞的分布以及由化合 物补充到动物体内的浓度 在研究测定c r p i c 3 或其它吡啶羧酸铬化合物的稳定性和分布过程中出现缺 少鉴定这些物质的分光光度技术的难题 此实验室的研究人员一直在研究顺磁性 的n m r 谱在测定潜在的生物相关的c r 3 十化合物中的应用 3 4 q 6 1 这些研究证明 了利用1 h 和2 hn m r 谱的组合 对单核或多核铬烟酸化合物中烟酸的质子谱都 被指认f 3 与此相似的是 这个化合物及其合成过程中产生的副产物 c r 2 u o h 2 p i c 4 的1 h 和2 hn m r 谱都被报告并指认 c r p i c 3 的电子光谱问题已 经争论了数十年 但是 从s t e a r n s 和a r m s t r o n g 最近的研究开始 2 2 这些矛盾 已经被解决 当前正在研究的是测定c r p i c 3 在细胞和组织中的分布浓度和形态 它是否保持完整的结构并存在潜在的切割d n a 的能力 l m w c r l o w m o l e c u l a r w e i g h tc h r o m i u m b i n d i n g 使用鼠脂肪细胞进行胰岛素剂量反应研究已经表明 仅含一个c r 3 的 l m w c r 具有天然生物功能 即时从鼠脂肪细胞中提取的l m w c r 和胰岛素能加 快葡萄糖或全部脂肪的代谢 生成c 0 2 这种加快作用的发生不会受到胰岛素要 求的半最高刺激浓度的变化的影响 l j 胰岛素半最高浓度缺少改变提出了在 胰岛素外部结合了胰岛素受体后l m w c r 进入胰岛素敏感细胞的机制 l l m w c r 刺激葡萄糖的代谢与铬的含量成 f 比口 l m w c r 是一个天然生成的寡 肽 由氨基乙酸 半胱氨酸 天冬氨酸盐 谷氨酸盐和超过总氨基酸残基量一半 以上的羧酸盐组成m4 尽管该分子的尺寸很小 分子量约1 5 0 0 但它能紧密 结合四个c r 3 kz1 0 2 m 4 而且高度络 h i l l 系数 n 3 4 7 1 30 1 这就表明本 质 只有a p o l m w c r 和h o l o l m w c r 共存于溶液中 a p o l m w c r 可以从生物分 子包括含2 个铬的转铁蛋白上接受铬 4 分光法研究指出 c r 与寡肽提供的 羧酸盐形成了一个由离子桥键键合的多核聚合物 4 h o l o l m w c r 可以简单地向 a p o l m w c r 溶液中加入c r 制得 此时形成桥键的阴离子可能是氧或氢氧根离 子 3 9 4 3 4 为标记从猪肾 猪肾榭13 1 兔 牛1 4 1 部分从狗 鼠肝 4 2 1 中提取纯化的寡肽 找了一个相关的从牛初乳中提取的含铬寡肽 m l m w c r 也是由同样的氨基酸组成 也可以刺激鼠脂肪细胞中依赖胰岛素的葡萄糖代谢 但氨基酸含量的比例明显不同p 现在还未从根本上揭示肝与牛初乳中的寡肽之 第一章综述 间的不同 令人j 隙奇的是 寡肽以脱除铬形式存在于胰岛素敏感细胞和细胞核中 可溶的部分 4 2 1 j v i n c e n ta n dj r a m i r e z u n p u b l i s h e dr e s u l t s 寡肽是以h o l o 形式 提取的 以便于其铬含量的进一步纯化测定 是体内或体外铬吸收步骤的必须 4 0 4 1 1 这个现象引出一个结论 l m w c r 可能是一个铬的解毒剂 但是 给鼠注 射c r 3 或铬盐不能引起l m w c r 的产生1 4 2 1 因此 当摄入大剂量的c r 3 或c 时 l m w c r 并不把它们转入到尿中 所谓的解毒功能并不是它的首要功能 l m w c r 被认为在胰岛素信号自动增大系统中起一定的作用 图1 p8 1 在此 机制中 a p o l m w c r 储存在胰岛素敏感细胞中 应激增加血液中胰岛素的浓度 例如在饭后血糖浓度增大的结果 胰岛素键合它的受体 引起一个构象变化 导致受体内部的酪氨酸残基自体磷酸化 这个过程把受体转变为活性的酪氨酸激 酶 把信号从胰岛素传递给细胞 应激胰岛素 铬从血液中移动到胰岛素敏感细 胞内 在这里 铬转移导致a p o l m w c r 填充铬 然后h o l o l m w c r 与受体结合 可能是有助于保持受体的活性构象 增大它的激酶活性 当信号关闭后 血液中 胰岛素水平下降很快 松弛受体的构象 h o l o l m w c r 从细胞中排出 最后 l m w c r 有效的排到尿液中 在研究细胞中胰岛素与l m w c r 的剂量反应的机理时 y o s h i m o t o 及其合作 者提出铬在细胞内葡萄糖的转运过程之中或之前起作用 4 首先在胰岛素键合受 体和葡萄糖的转运之间是信号转导过程 例如 蛋白质残基的磷酸化和去磷酸化 在他们实验室 l m w c r 在这些过程中的功能已经被确定 l m w c r 是胰岛素激 活胰岛素受体上酪氨酸激活酶活性的物质 并且能在脂肪细胞膜中激活膜的酪氨 酸磷酸化h 例如 向鼠脂肪细胞膜同时注入牛肝h o l o l m w c r 和1 0 0 n m 胰岛 素会导致依赖不同浓度变化的现象 胰岛素依赖酪氨酸蛋白激酶激活作用的刺激 会升高8 倍 与此同时 胰岛素缺乏则不会激活激酶活性 图2 1 4 激酶活化对l m w c r 的浓度作图 能够给出合适的双曲线并给出游离常数 k m s 大约为8 7 5 p m 表明其结合很紧密 用抗原决定部位a 螺旋的抗体阻 塞胰岛素外部 螺旋的结合位点 导致激酶激活胰岛素受体的活化作用的能力 丢失 4 3 o 用牛肝l m w c r 同时加入胰岛素来检测提取白鼠胰岛素受体的潜在活 性 结果表明 系列铬 配台物与牛血清白蛋白作用的光潜研究 f i g u r e1 p r o p o s e dm e c h a n i s m f o rt h ea c t i v a t i o no fi n s u l i n r e c e p t o ra c t i v i t yb y c h m m o d u l i n l m w c r j nr e s p o n s et oi n s u l i n t h ei n a c t i v ef o r mo fi n s u l i nr e c e p t o r i r i s c o n v e r t e dt ot h ea c t i v ef o t i nb yb i n d i n gi n s u l i nr 1 1 t h i st r i g g e r sam o v e m e n to fc h r o m i u m f r o mt h eb l o o di n t oj n s u l i n d e p e n d e n tc e l l s w h i c hi nt u r nr e s u l t s i na p o c h r o m o d u l i n p i n k t r i a n g l e b i n d i n gc h r o m i u mf i n a l l y t h eh o l o c h r o m o d u l i n g r e e no v a l b i n d st oj n s u l i n r e c e p t o gf u r t h e ra c t i v a t i n gt h er e c e p t o rk i n a s ea c t i v i t y a p o c h r o m o d u l i ni su n a b l et ob i n dt o r e c e d t o ra n da c t i v a t ek i n a s ea c t i v i t y w h e nt h ei n s u l i nc o n c e n t r a t i o n sd r o p h o l o c h r o m o d u l i n i sr e l e a s e df r o mt h ec e l lt or e l i e v ei t se f f e c t s l m w c r 能增大提取的受体酪氨酸蛋白激酶的活性7 倍左右 最终证明受体是与 l m w c r 反应的位点 从适合活性作的双曲线函数给出一个游离常数约为2 5 0 p m l 4 3 1 l m w c r 结合胰岛素的位点可以进一步被确定 通过对人类胰岛素受体 不 需要激酶激活的胰岛素 的b 折叠这个接触反应的活性片段 残基9 4 l 1 3 4 3 的研 究揭示l m w c r 在游离浓度为1 3 3p m 时可增大激酶活性3 倍 图4 因此 l m w c r 键合或靠近激酶活性位点 4 铬在l m w c r 激活胰岛素受体激酶活性过程中发挥 一个重要的作用 4 在鼠脂肪细胞膜中a p o l m w c r 则显示出激活依赖酪氨酸激 酶胰岛素活性的能力很小 极小的活性很容易归因于游离的铬 但是 用c r 滴定a p o l m w c r 能全部恢复其激活激酶活性的能力 达到最大活性时每个寡肽 大致须要4 个c r 3 这和曾经报道的从肝中提取的h o l o l m w c r 中铬的数量比是 一致的 每个寡肽四个铬 加入铬后 l m w c r 的活性可迅速恢复 和以前报道 的铬键合研究一致 表明铬的结合有高度的协同效应 以至于不充分补铬 h o l o l m w c r 迅速形成脱铬l m w c r 的络合物 l m w c r 的活化潜力恢复特指铬 除了铬 通常与生物系统有关联的过渡金属离子都不能增强a p o l m w c r 的活性 6 第一章综述 激活激酶活性 事实上 所有的离子 除了c r 3 相对于a p o l m w c r 都丧失了活 性 与此相似的 金属离子 在没有a p o l m w c r 时 对激活胰岛素依赖激酶活性都 没有影响 因此 l m w c r 加强对胰岛素的作用结合胰岛素受体刺激胰岛素依赖 蛋白酪氨酸激酶活性的作用铬特异的 并且直接依赖l m w c r 中铬的含量 在对人类胰岛素分泌过多症的研究中 b r a i nm o m s 及其合作者已经得出结 论 通过口服葡萄糖增加血液中胰岛素的浓度会引起原生质血浆中铬水平下降 在注射胰岛素后会使铬进一步丧失 4 血液中胰岛素浓度增加1 5h 后 血液中 铬水平开始恢复 实验过程中同时发现病人尿液中铬浓度增大 其总量大致与血 液中损失的铬量一致 1 通过对人和鼠组织的研究已经证实 铬与胰岛素依赖组织的结合对葡萄糖增 强是意味深长的 研究指出铬可能从血液中转运到胰岛素敏感细胞中 4 9 i 这个实 验室的科研人员近来证明在体内 铬被l m w c r 结合到鼠肝里胰岛素敏感的细胞 的细胞核和胞液中应激胰岛素 j r a m i r e za n dj b v i n c e n t u n p u b l i s h e dr e s u l t s 其它的许多研究证实铬对类似摄入糖的应激反应在9 0m i n 内排入尿液 5 0 5 3 与葡萄糖耐受量因糖应激反应降低一样 铬的移动和因此导致的铬流失 也降低l 1 在某些条件下 l m w c r 是尿液中铬的主要形式 1 从它们的动态平 衡和尿量的研究来看 储存在血液中的铬在血液中胰岛素浓度增大时被激活 晟 后以l m w c r 的形式出现在尿液中 铬的糖代谢的功能模型同时可以解释铬营养研究中的一些问题 铬不可用于 治疗口 仅作为一个营养补充剂 只有铬缺失病人希望从添加铬事物中获益 因 此 对c r p i c 3 和其他形式的铬营养补充剂的研究显示其对健康的许多特征如体 重和血象都无影响 给小鼠1 2 周每天2 0m gl m w c r 的治疗显示其对鼠只有很 小或没有任何影响 不幸的是 作为治疗的或事物添 j 1 齐i l m w c r 似乎很快被 排泄掉 给兔子注射l m w c r 可以导致铬迅速排出 特别是与其他形式的铬相比 l m w c r 铬酸盐 氯化铬三者的再吸收比例依次为2 3 5 8 5 7 9 2 5 1 4 这也可间接解释直接注射鼠的半致死量是很高的 达到1 3 5m g k g 4 l m w c r 这个名称不太实用 根据其可能反应机制 实验室的工作人员命名 这个寡肽为c t l r o m o d u l i n 铬调蛋白 取这个名称的依据是与其相似的钙调蛋白 c a l m o d u l i n 的命名规则 5 二者都结合四个金属离子 但是四个钙离子结合在 c a l m o d u l i n 上的一个结合位点上 二者的全分子蛋白都选择性的结合激酶和磷酸 酯酶来激活 系列铬 1 1 1 配合物与牛血清白蛋白作用的光谱研究 人工合成模型 最近的研究在铬的新型羧酸盐聚合物的制备上取得很多突破 己知配合物核 的数目大于2 小于8 并合成四种核 对称和不对称的h c r 3 0 c r 3 o h h t 6 0 c r 4 0 2 1 引瑚 其中制备并表征的大多数合成物含有对称性c r 3 0 核 对这类物质的 研究热可追溯到1 9 世纪末期 5 9 1 其他类型核的配合物只有在近几十年来以对称 性三核为原料制得 对铬调蛋白功能模型的研究给出了一个新规则 针对钙调蛋 白相当简单的结构 富羧酸盐寡肽键合四个铬离子 和胰岛素传导信号的自放大 过程 要求这个仿生物可溶且在水溶液中稳定 在己知的三核或四核铬一氧桥羧 酸盐配合物中只有极少数的可溶于水 在上述条件的基础上 合成出了两个聚合 物 c r 3 0 0 2 c c h 3 6 h 2 0 6 c r 3 0 2 c c h 2 c h 3 6 h 2 0 3 1 4 醋酸盐化合物不能 激活胰岛素受体中活性位点片段的酪氨酸蛋白激酶的活性 也不能在胰岛素存在 下催化脂肪细胞膜 事实上它抑制此活性 严格地对比丙酸盐类似物在激活激酶 活性的方式上与铬调蛋白非常相似 例如 从受体片段中提取的激酶 在1 0 0n m 游离浓度下可大约增大3 倍活性 图4 4 此化合物看起来像铬调蛋白的功能仿 生物 支持铬调蛋白中铬的多核聚合存在 已经发现丙酸盐仿生物在体内的作用很显著 每天给小鼠2 0m g k g 补充剂 1 2 周后血腊 总胆固醇 l d l 和h d l 胆固醇水平都下降了 而且可能减少体重 和脂肪 5 6 该化合物作为营养添加剂没有急性毒性 也没有像c r p i c 3 那样引起 d n a 损伤 川 因此 丙酸盐化合物可能是一个潜在的药剂 这些结果与假设机 制相一致 与无自身活性仅提供铬源的添加剂相比 功能仿生物 如果能完整地 进入胰岛素敏感细胞 可以捕捉胰岛素受体活性构象 增大胰岛素信号及细胞活 性 确定鼠体中仿生剂的分布和浓度 丌发第二代仿生剂和潜在药剂正在研究中 1 2 血清白蛋白的功能结构及理化性质 血清白蛋白 s e m ma l b u m i n 是人和哺乳动物体内血浆中含量最丰富的蛋白 质 约占血浆总蛋白的6 0 平均浓度为4 2g l 0 6 3m m o l l 有着极其重要的 生理功能 它是血液缓冲剂 能维持正常的血浆渗透压 并且它还可以够储存和 转运众多的内源性和外源性物质 如金属离子 脂肪酸 氨基酸 代谢物 胆红 第一章综述 素 酶 激素和药物等 另一方面 相对而言 血清白蛋白比较易于分离 提纯 可大量制备 所以 血清白蛋白成为研究蛋白质的理化性质 生物学功能 体内 代谢 临床应用及遗传变异等方面的理想蛋白质 从5 0 年代 国内8 0 年代末 开始 人们对血清白蛋白与金属离子 及药物分子等 的相互作用展开了大量研究 1 6 5 以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘 血清白蛋白的荧光 该蛋白质能够发出荧光 是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸残基 t r p t y r 和p h e 残基 通常三者的荧光强度比为1 0 0 9 o 5 6 7 根据蛋白质是否含有 色氮酸可将其分为两类 a 类蛋白 指不含t r p 残基只含t y r 和p h e 残基的蛋白 质 b 类蛋白 指既含t r p 残基又含t y r 和p h e 残基的蛋白质 血清白蛋白属于b 类蛋白 有较强的荧光 虽然三种生色基团都有自己的特征荧光峰 t r p t y r 和 p h e 的荧光峰位分别位于3 4 8 3 0 3 和2 8 2n m 但由于在蛋白质大分子内 由 p h e 到t y r 或t r p 的能量转移是非常有效的 因此整个分子的吸收和发射也不是 这些单体组分光学性质的简单加和 往往t r p 残基的荧光占优势地位 6 8 l 当在 2 7 0 2 9 0n r n 激发蛋白质时 不能忽略t v r 残基的贡献 当激发波长大于2 9 0m n 时 可认为荧光都来自与t r p 残基 h s a 中只含有一个2 1 4 位的t r p 残基 荧光 发射峰在3 5 0n m 附近 b s a 中有两个t r p 残基 分别位于1 3 4 位和2 1 2 位 一 般认为 荧光主要是从2 1 2 位t r p 残基发出的 6 9 j 在3 4 2m 左右 二者的最大 激发峰都约为2 8 0u r n t r p 残基可以用作局部构象变化或芳香族氨基酸残基微环境变化的探针 当加入金属离子等物质后 利用血清白蛋白内源荧光的变化 可以对结合反应进 行定性和定量研究 1 3 本课题的研究意义 铬是人和动物所必需的微量元素 是构成葡萄糖耐受因子 g t f 的重要组成 部分 无论是在自然条件还是在实验条件下 缺铬都可使组织对胰岛素的敏感性 降低 胰岛素最显著的生理功能是降低血糖 铬的生物活性在于作为胰岛素的必 要协同要素之一影响体内所有依赖胰岛素系统的代谢活动 包括糖代谢 脂肪代 谢和蛋白质代谢等 因此 补铬可达到降血糖 改善糖耐量的目的 9 系列铬 1 1 1 配合物与牛血清白蛋白作用的光谱研究 近年来有关营养铬的生物存在形式研究引起人们的关注 国内外在补铬方面 使用的有机铬主要是n 一毗啶甲酸铬 如何能得到一种生理活性更好 人体更容 易吸收的新型有机铬化合物便摆在我们面前 由此出发 我们实验室合成了一系 列铬配合物 牛血清白蛋白作为人体内含量最大的蛋白 推测其在铬的转运过程 中起到重要作用 本文对其中四种铬 i 配合物与牛血清白蛋白作用的光谱进行 了研究 1 0 第一章综述 参考文献 1 s c h w a r zk m e r t z w c h r o m i u m i i i a n dg l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r j a r c h b i o c h e m b i o p h y s 19 5 9 8 5 2 9 2 2 9 5 2 m e r t z w s c h w a r z k r e l a t i o no fg l u c o s et o l e r a n c ef a c t o rt oi m p a i r e d i n t r a v e n o u sg l u c o s et o l e r a n c eo fr a t so ns t o c kd i e t s j p h y s i 0 1 1 9 5 9 1 9 6 6 1 4 6 1 8 3 s t r i f f i e r j s p o l a n s k y m m a n d e r s o n r a o v e r p r o d u c t i o no fi n s u l i ni nt h e c h r o m i u m d e f i c i e n tr a t j m e t a b o l i s m19 9 9 4 8 10 6 3 10 6 8 4 4s t r i f f i e r j s p o l a n s k y m m d i e t a r yc h r o m i u md e c r e a s e si n s u l i nr e s i s t a n c ei n r a t sf e dah i g h f a t m i n e r a li m b a l a n c e dd i e t j m e t a b o l i s m19 9 8 4 7 3 9 6 4 0 0 5 a n d e r s o n r a c h r o m i u ma n dp a r e n t e r a ln u t r i t i o n j 1 n u t r i t i o n1 9 9 5 11 8 3 8 6 6 h o l m r h k e n n e p o h l p s o l o m o n e i s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a la s p e c t so f m e t a ls i t e si nb i o l o g y j c h e mr e v1 9 9 6 9 6 2 2 3 9 2 31 4 7 d a v i s c m v i n c e n t j b c h r o m i u mi nc a r b o h y d r a t ea n dl i p i dm e t a b o l i s m j b i 0 1 i n o r g c h e m 19 9 7 2 6 7 5 6 7 9 8 v i n c e n t j b m e c h a n i s m so fc h r o m i u m a c t i o n l o w m o l e c u l a r w e i g h t c h r o m i u m b i n d i n gs u b s t a n c e j a mc o i l n u t r 1 9 9 9 1 8 6 1 2 9 m e r t z w r o g i n s k i e e s c h w a r z k e f f e c to ft r i v a l e n tc h r o m i u mc o m p l e x e s o ng l u c o s eu p t a k eb ye p i d i d y m a lf a tt i s s u eo fr a t s j b i 0 1 c h e m 1 9 6 1 2 3 6 3 1 8 3 2 2 10 m e r t z w r o g i n s k i e e t h ee f f e c to ft r i v a l e n tc h r o m i u mo ng a l a c t o s ee n t r yi n r a te p i d i d y m a lf a tt i s s u e j 1 b i 0 1 c h e m 19 6 3 2 3 8 8 6 8 8 7 2 11 m e r t z w r o g i n s k i e e s c h r o e d e r h a s o m e a s p e c t s o f c h r o m i u m d e f i c i e n tr a t sr a i s e di nas t r i c t l yc o n t r o l l e de n v i r o n m e n t j 1 n u t r 1 9 6 5 8 6 1 0 7 11 2 1 2 t o e p f e r e w m e r t z w p o l a n s k y m m r o g i n s k i e e w o l g w r p r e p a r a t i o no fc h r o m i u m c o n t a i n i n gm a t e r i a lo fg l u c o s et o l e r a n c ef a c t o ra c t i v i t y f r o mb r e w e r sy e a s te x t r a c t sa n db ys y n t h e s i s j a g r i c f o o dc h e m 1 9 7 7 2 5 j 6 2 一1 6 6 系列铬 i l i 配合物与牛血清白蛋白作用的光谱研究 13 s u m r a l l k h v i n c e n t j b i sg l u c o s et o l e r a n c ef a c t o ra na r t i f a c tp r o d u c e db y a c i d h y d r o l y s i so fl o w m o l e c u l a r w e i g h tc h r o m i u m b i n d i n gs u b s t a n c e j p o l y h e d r o n1 9 9 7 1 6 4 1 7 1 4 1 7 7 1 4 a n d e r s o n r a b r a n t n e r j h p o l a n s k y m m