（微生物与生化药学专业论文）我国南海相似蜂海绵相关微生物多样性及活性产物研究.pdf

中国协和医科大学硕士学位论文 目录 目录1 缩略词表4 中文摘要5 a b s t r a c t 6 第一章前言8 参考文献1 4 第二章实验材料及方法1 8 2 1 材料18 2 1 1工具酶类1 8 2 1 2 试剂盒l8 2 1 3m 破e r 1 8 2 1 。4 培养基成分18 2 1 5 p c r 引物1 8 2 1 6 抗生素1 9 2 1 7 其它试剂1 9 2 1 8 实验仪器1 9 2 1 9 培养基2 0 2 1 1 0 试剂和溶液配制2 l 2 1 1 1 抗生素的配制2 2 2 1 1 2 生物信息学软件2 3 2 1 1 3 菌株和质粒载体2 3 2 2 方法2 3 2 2 1 真菌基因组提取2 3 2 2 2 细菌菌落p c r 2 3 2 2 4d n a 片段纯化回收2 4 2 2 5 大肠杆菌感受态细胞的制备2 4 2 2 7 1 6 sr r n a 基因的限制性酶切片段多态性分析( r f l p ) 2 5 2 2 8 使用软件构建系统发育树2 5 2 2 9 硅胶柱层析2 6 2 2 1 0h p l c 分析和制备2 6 2 2 1 l 枯草芽孢杆菌6 3 5 0 1 孢子悬液制备2 7 2 2 1 2 钢圈法抗菌活性筛选实验2 7 2 2 1 3 纸片法抗菌活性筛选实验2 7 第三章相似蜂海绵( h 口如z d 厅口s 拥“肠刀s ) 相关真菌多样性研究2 8 3 1 实验方法2 8 3 1 1 海绵样品采集和处理一2 8 3 1 2 真菌分离2 8 3 13 菌种保藏2 9 3 1 4 真菌分子系统学分析2 9 3 2 实验结果31 3 2 1 分离得到真菌菌株菌落形态31 3 2 2 基因组提取的结果3 l i 一一 中国协和医科大学硕士学位论文 3 2 3i t s 序列扩增的结果：31 3 2 4b l a s t 比对结果3 2 3 2 5 分子系统学分析结果3 2 3 2 6g 朗l b a n k 注册号3 4 第四章相似蜂海绵( 凰刎咖即口砌“锄s ) 相关细菌多样性研究。3 6 4 1 可培养细菌多样性研究3 6 4 1 1实验方法3 6 4 1 2 菌种保藏3 6 4 1 3菌落p c r 获得各菌株1 6 sr r n a 序列3 6 4 1 4 限制性酶切片段长度多态性分析( r f l p ) 3 7 4 1 5 测序3 7 4 1 6 序列编辑和比对3 7 4 1 7b l a s t 3 7 4 1 8 系统树构建3 8 4 1 9g e n b a n k 注册3 8 4 2 实验结果3 8 4 2 1分离结果3 8 4 2 21 6 sr r n a 基因序列扩增结果3 8 4 2 3r f l p 分析结果3 8 4 2 4b l a s t 比对结果3 9 4 2 5 分子系统学分析结果4 0 4 2 6g e n b a n k 注册号4 2 4 3 相似蜂海绵相关未培养细菌多样性分析4 2 4 3 1海绵组织总基因组d n a 的提取4 2 4 3 2构建1 6 sr r n a 基因序列文库4 3 4 3 3i 讧l p 分析1 6 sr r n a 基因文库4 3 4 3 4 测序4 3 4 3 5 序列编辑和比对4 3 4 3 6 构建系统树4 3 4 4 实验结果4 3 4 4 1 总基因组提取结果4 3 4 4 21 6 sr r n a 基因文库构建的结果4 3 4 4 3 r f l p 分析结果4 4 4 4 4b l a s t 比对结果4 5 4 4 5 分子系统学分析4 6 4 4 6g e n b a n k 注册号4 8 4 5 讨论4 8 第五章相似蜂海绵相关微生物代谢产物研究5 0 5 1 实验方法5 0 5 1 1 真菌的发酵5 0 5 1 2 细菌的发酵5 0 5 1 3 发酵产物提取5 0 5 1 4 活性筛选5 0 5 1 5 活性物质分离5 0 2 3 51 5 1 51 5 2 5 2 5 5 5 7 6 0 6 3 6 5 6 7 6 8 髫由髯鹭( 誓由磋) 三 3 u 它琊3 m o u j m 口( i 兀q 妒u x o j 吖q ) s w 鲷号酱v n q 鲤雨平潍舛 9 s 它j 9 i i i 兀i o ds n 。叩n b bs n l i u 9 q 工 昭碉靴髯辫二+ 3 增i n s 伍3 a p o pi i i n i p o s 骠# 格髟鸳 a l n u ! m j 3 ds p u n 眦 鞠碉狲繇狲 a s e a i o n u o q 瞄 羽，辩雾稿茸碑鞠羽巾串刮 s m s ! i ：【出o u i o di 箍u a i1 碉b 母u 0 1 1 0 w s a j 魏狲戥狲骘聊勒戥狲 v n q 水m o s o q 瞄 犁召摹璐鞠号酱 u o ! 驷ju 睥叩a s 它妇u 坼i o d 嚣晕酗 s u i u j o f j o q 啦! a n 餮蛎蟛￥窖 胁o m ! s 北du 1 m ! x b 巩 印瑚a 。b ! 1 n 1b ! p a i nu 睥阳a 。它 h u 拯霉独士 3 册q o i ! 疆 盈刨刨善# 掣v n 0 i 的3 b d sp a q 印s u 它皿r b u 妇1 u i 舁露隧来- q - d 一抖靶霉幽暂 a p ! s 0 1 3 它i 碣。q d o ! q l i 兀d o j d o s i 迈珥髫采馨 u o ! w z ! p i j 吖q 螂! s 螂a 3 u a 3 s 3 | i o n u 惜强2 圈掰= r z o j l 9 3 b b j 3 3 u ! m 它j p 3 u 9 匹m 互 翳2 耐酴 3 p ! m o j qm n ! p ! 驴 娶甚嗵￥ 1 0 3 移疆3 柏t 1 3 t l 蹈 碉簸三墨狲戥狲骘捌 3 瑚私s o u d wa p j s o a l 3 n u o q 匹x 0 3 q 嗽印魏獠鸳髀羽，甄 s ! s 3 j o i i d 叫3 a l a1 3 8w a ! p 它蝠p 9 j n 弱p 平士盟军 o o hp a i l l l s ! p3 i q n p 鞑霉辙 j d 9 s 它q 鲷掷蘧学珂它p 8 a u z u 丑8 u ! 胞3 1 3p ! o 旺i i i vb 辑a 善錾晕击鹭 u ! 1 1 1 3 1 咖吖 擎殴动黪 s u 工 6 纽 s q s u i 击 a s b n d l d v n q j 3 d f n d w a 1 q 夏 s 工1 0 工d i h s i d v 工q 日 日丑 t 1 0 3 丑 d 工n p 丑0 0 q o h p p d q 丑3 v 8 d u 茸珏珂杀千蛐杀￥性盈咄蜗崮亡b 中国协和医科大学硕：b 学位论文 中文摘要 海绵是最原始的低等多细胞动物，主要分布于海洋环境，其特殊的滤食和生存 方式使之成为大量微生物聚集的场所，还从海绵中发现了大量的生物活性物质。海 绵相关微生物尤其是微生物新种也被陆续发现，并分离到许多具有药理活性的微生 物代谢产物。本课题致力于将分离培养技术与分子生物学手段( r f l p 和核糖体 r r n a 序列分析) 相结合，研究我国南海相似蜂海绵相关微生物多样性，同时从可 培养的微生物中筛选可应用于创新药物研究的活性产物，己取得如下进展： 1 调查了相似蜂海绵相关可培养真菌多样性 利用三种不同培养基：海水y p d 、海水p d a 和m 撕n ea g a r 从海绵内部组织匀 浆中分离培养得到4 5 株真菌，经过r d n a i t s 序列测定、b l a s t 比对和分子系统 学分析，最终将它们归属于2 门( 子囊菌门和担子菌门) 、8 目、1 2 属和1 6 种， 其中6 株有可能为首次发现的新种。上述菌株有待于进一步的分类鉴定。 2 调查了相似蜂海绵相关可培养细菌和未培养细菌的多样性 采用四种不同的培养基：m 撕n ea g a r 、海水l b 、海水高氏i 号和高氏i 号固 体培养基，分离培养得到3 5 0 株细菌，经r f l p 分析，得到8 9 个r f l p 型，再通过 1 6 s r d n a 序列测定、b l a s t 比对和分子系统学分析，最终将这些细菌归类为3 8 种。 另外，通过构建1 6 sr r n a 基因( r d n a ) 文库、r f l p 分析、d n a 测序等方法分析 了海绵相关未培养细菌的种群，共得到3 2 个互不相同的序列，分别表征不同细菌 菌株。 3 对可培养微生物进行了药理活性筛选，得到多株能产生药理活性物质的菌 株 将分离得到的真菌和细菌，分别采用g c 和t s b 培养基2 5 发酵培养7 天。 真菌发酵物用乙酸乙酯提取和浓缩得浸膏，用三种肿瘤细胞株人肠癌h c t 8 细胞， 人肝癌b e l 7 4 0 2 细胞和人肺癌a 5 4 9 细胞进行体外抗肿瘤活性筛选；用枯草芽孢杆 菌6 3 5 0 l 进行抗菌活性筛选；用b a c e 进行抗衰老活性筛选；用0 【葡萄糖苷酶抑制 模型和脂肪酶抑制模型等体外模型进行抗糖尿病活性筛选。初筛得到如下结果： 1 株具有体外抗肿瘤活性、7 株具有抗菌活性、4 株具有一定抗衰老活性和1 株具有 一定抗糖尿病活性。细菌发酵液取上清直接进行抗菌活性筛选，初筛获得2 株有抗 菌活性的细菌菌株。对真菌菌株f 6 2 的发酵物进行了分离纯化研究，通过柱层析和 高效液相色谱层析等方法，获得1 种具有抗菌活性的化合物，其结构有待于进一步 鉴定。 关键词相似蜂海绵；微生物多样性；r d n a ；活性产物；筛选 中国协和医科大学硕士学位论文 a bs t r a c t s p o n g e sa r ew e l l1 ( 1 1 0 w nt oh a r b o rd i v e r s em i c r o b e sa 1 1 dr e p r e s e n tas i 盟i f i c a n t s o u r c eo f b i o a c t i v en a m r a lp r o d u c t sd e r i v e d 舶mt l l em 撕n ee n v i r o 【l i i l e n t r e c e ms t u d i e s o nt h em i c r o b i a lc o m m u i l i t i e so fm a r i n es p o n g e sh a v eu n c o v e r e dp r e v i o u s l yu n d e s c r i b e d s p e c i e sa n da i la r r a yo fn e wc h e m i c a lc o m p o u n d s 1 1 1 “ss t u d y c u l t u r e d 印e n d e n t m e m o da n dc u l t u r e i n d e p e n d e n ta p p r o a c h e s ( m e t a - g e n o m i cd n a ，r f l pa l l dr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s ) w e r ea p p l i e d t 0i n v e s t i g a t em em em i c r o b i a ld i v e r s i t ya s s o c i a t e dw i t h m em a d n es p o n g e 月a z f c 肠甩口j 咖“肠淞c o l l e c t e di nm es o u mc h i n as e a b i o a c t i v e c o m p o n e n ts c r e e n i n go fm ec u l t l l r a b l em i c r o o r g 籼i s m sw a sc 耐e do u t s o m er e s u l t s w t eo b t a j n e da sf o l l o w s ： 1 d i v e r s i t yo ft h ec u l m r a b l e 如n 百a s s o c i a t e dw i t l l 日a z f c 肠，z 口s 咖“z 以淞 f o r t y _ f i v em n g a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e d 行o mt h eh o m o g e n a t eo fm e i m l e r t i s s u e 行o m m es p o n g e ，b yu s i n gt h r e ed i f f e r e n tm e d i a ：y p d ，p d a ( y p da i l dp d a w e r ep r 印a r e d w i t hn a t u r a ls e a w a t e n ，a n dm a r i n eb r o t h2 2l6 t h e s ef h g a ls t r a i n sw e r eg r o u p e di n t o2 p h y l m s ( a s c o m y c o t 4a n db a s 缸l i o m y c o t a ) ，8o r d e r s ，1 2g e n e r aa 1 1 dl6s p e c i e sb a l s e do n 。 t l l er d n a i t ss e q u e n c e sa n db 1 a s ta n a l y s i s s i xi s 0 1 a t e sm i 曲tb et h en o v e ls p e c i e sm a t n e e dt ob e 如n h e rd e t e m i n e db yo t l l e rc l a s s i f i c a t i o nm e t h o d s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sw a s m a d eo nm eb a s i so fm er d n a - i t ss e q u e n c e s 2 d i v e r s i t yo fm eb a c t e r i a lc 0 i i 】肛l u n i t ya s s o c i a t e dw i m 月白z f c z d ，z 口s i m “肠，坫 t h ec u l t l l r e d 印e n d e n tm e t l l o dt o g e t h e rw i t ht h em 0 1 e c u l a ra p p r o a c h e sw a su s e dt o i n v e s t i g a t et h ec u l m 】? a b l eb a c t 甜a lc o m m l l i l i t yi nt h es p o n g e 月a f f c 幻行口s f 聊“励淞t 1 1 r e e h u n d r e da i l df i r vc u l t u r a b l eb a c t 耐a ls t r a i n sw e r er e c 0 v e r e d t h e s eb a c t 耐a w e r e 孕o u p e di n t o8 91 6 sr d n ar f l pt y p e sb a s e do nm ee n z y i i l a t i ca n a l y s i so f 胁pi i ia n d 剧如i t h e8 9r f l pt y p e si n c l u d e d3 8s p e c i e sa c c o r d i n gt ot h e16 sr d n a b l z l s ta 1 1 a l y s i s u n c u l t u r e db a c t e r i a lc o m m u n i t ya s s o c i a t e dw i t hm es p o n g e 月a z f c 肠胛口s f 朋“肠，z sw a sa l s o i n v e s t i g a t e db yu s i n gt h ec u l t u r e - i n d e p e n d e n tm e t h o d t h e16 sf r n ag e n el i b r 耐e sw e r e f o u n d e db 2 l s e do nt l l ep c ra m p l m c a t i o no ft h et o t a lg e n o m i cd n a 丘o mm es p o n g e t i s s u ea n dt ac l o n i n g r f l pm e t h o da n dm e16 sr d n ab l a s ta n a l y s i sw e r eu s e dt o c l a s s i 母t h er a i l d e m l ys e l e c t e dc l o n e si nt h el i b r 撕e s t h i r t y _ t w oi n d e p e n d e n t c l o n e sw e r e 6 中国协和医科大学硕士学位论文 o b t a i n e d 、1 1 i c hr 印r e s e n t3 2d i f f b r e ms p e c i e sa n dm o s to fm e mb e l o n gt ot h eu n c u l t u r e d b a c t 耐a p h y l o g e i l e t i ca 1 1 a l y s i sw a l sa l s om a d e 3 b i o a c t i v ec o m p o n e n ts c r e e n i n go ft h ec u l t u r a b l em i c r o o r g a r m i s m s f e 肌e n t a t i o no ft h ec u l t u r a b l em i c r o o r g a i l i s m sw a sp e r f o m e db yu s i n gt h eg c m e d i u mf o r 缸1 9 ia 1 1 dt h et s bm e d i u mf o rb a c t 耐a a f c e r7d a y sf i 翎：n e n t a t i o nu n d e r 2 5 ，a nm em n g a lc u l t u r e sw e r ee x t r a c t e dw i t he m y la c e t a t e ，r e s p e c t i v e l y t h ec m d e e x t r a c t sw e r es c r e e n e df o rm ea n t i t u _ m o ra c t i v i t ya g a i n s tt h r e et u m o rc e nl i n e sh c t 一8 ， b e l 7 4 0 2a n da 5 4 0 ，a 1 1 t i b a c t 甜a la c t i v 时a g a i n s tb 以c i z z 螂s 曲f f 凰6 3 5 0 1 ，a n t i a g e i n g a c t i v i t yo nm eb a c em o d e la i l d f o rm ei nv i 缸da i l t i d i a b e t i ca c t i v i t yo nm es e v e r a l d i a b e t i cm o d e l s b a c t e r i a lc u l t i l r e f i l t r a t e sw e r ed i r e c t l yt e s t e df o rt 1 1 e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i 够a g a i n s tb 口c f ，如锯s “6 f i 凰6 35 01 t h ef 0 1 l o w i n gr e s u l t sw e r eo b t a i n e d ：o n em n g a l s t r a i nw i t hm ei i lv i t r oc y t o t o x i c i t ya g a i n s tm et u m o rc e nl i n e s ，7m n g a ls t r a i n sa n d2 b a c t e r i a ls t r a i n sw i 也m ea n t i - b a c t e r i a la c t i v i t y ，4f u n g a ls t r a i n sw i mt h ea 芏l t i a g e i n g a c t i v i t ya n do n e 向n g a ls t r a i n w i mt h ei nv i t r oa n t i d i a b e t i ca c t i v i t ) ，t h ea c t i v e c o m p o n e n t s o ft l l e 凡n g a ls 仃a i nf 6 2w e r e 如r m e rp 谢f i e dt h r o u g ht h ec o l o m c h r o m a t o 伊叩h y ，t l c ，h p l c ，e t c ，趾dp r e l i m i n a m yd e t e 衄i n e db yl c - m s o n e p u r i f i e dc o m p o n e n tw i m t h ea 王】t i - b a c t e r i a la c t i v i t yw a so b t a i n e d k e yw o r d s ：丑a 厅c 肠船口s i 聊“肠凇；m i c r o b i a ld i v e r s i t ) r ；r d n a ；b i o a c t i v ec o m p o n e n t ； s c r e e m n g 7 中国协和医科大学硕士学位论文 第一章前言 浩瀚的海洋约三亿六千多万平方公里，占整个地球表面的7 1 ；地球上的生物 资源8 0 生存在海洋里。海洋不仅是人类获取食物的重要来源，也是人类取之不尽 的天然药源【l 】。我国是世界上最早开发利用海洋药物的国家之一。远在公元前三世 纪，我国最早的医学文献黄帝内经中，就有以乌贼骨作丸饮、以鲍鱼汁治疗血 枯的记载，另外还有许多种海洋生物直接用做中药。现代海洋药物的研发己不仅仅 是局限于直接使用海洋生物，而着重于从中寻找具有开发价值的天然活性产物。由 于海洋环境的特殊性、生物的多样性，在几十万种不同门类的生物种群里蕴藏着大 量的化学结构新颖、生物活性特异、开发价值极大的生物活性物质【2 】。海洋天然 产物研究的热潮，起源于1 9 6 4 年日本京都的第三届天然产物化学国际会议上河豚 毒素化学结构的发表，之后，从海洋中发现的具有生物活性、结构独特的活性物质 越来越多，目前，多种海洋活性物质的研究已经进入临床阶段。然而，通常来自海 洋生物活性产物的含量非常低，而且大部分具有开发潜力的化合物结构很复杂，难 以人工合成，受试物的可持续供应以满足基础和临床研究的需要更成为海洋药物研 究的瓶颈。而最近的研究表明，有些活性物质往往由与海洋生物共、附生的微生物 所产生【3 4 5 】，海洋微生物蕴藏着巨大的形成活性天然产物的潜能。故而从海洋环境 和海洋生物中分离培养细菌和真菌，以获得海洋次生代谢产物是一种有效的可持续 发展的方案。为充分开发海洋微生物潜力，研究其生物多样性是一项重要的基础性 工作，而从海洋环境中分离培养海洋真菌、细菌对发现新颖活性化合物并开发成为 创新药物具有重要的意义。 1 1 海绵 海绵( s p o n g e ) 属于多孔动物门( p o r i f e r a ) ，是最原始的低等多细胞动物，全世界 研究过的海绵约1 0 ，0 0 0 1 5 ，0 0 0 种【8 】，我国也有5 ，0 0 0 种左右。海绵分布十分广泛， 除了大多数海绵存在于海洋以外，在陆地淡水湖泊、河流以及沼泽中还有约1 5 0 种 淡水海绵。它们分属于四个纲：寻常海绵纲( d e m o s p o n 百a e ) 、六放海绵纲 ( h e x a c t i n e l l i d e ) 、钙质海绵纲( c a l c a 陀a ) ，硬骨海绵纲( s c l e r o s p o n 百a e ) ，其中寻常海 绵纲占9 5 【9 1 。海绵作为一种滤食性动物( 图1 1 ) ，通过其特殊的滤食系统和其自 身疏松多孑l 的结构，使其成为富集海洋微生物的重要场所。一只1 千克的海绵每天 要过滤的海水可以达2 4 立方米，其中所含有的细菌数可达到5 1 0 6 个m l 【1 4 l5 1 。据 研究，有些海绵组织里的微生物能占到海绵体积的半【l6 】，比海水中微生物数量 高出2 3 个数量级 1 8 乏0 1 。作为在海洋中存在了5 亿年的多细胞动物，海绵却无法 自主运动，因此它防御天敌的措施可能主要在于化学防御，而一些研究表明，海绵 中国协和医科大学硕士学位论文 体内的微生物在海绵防御捕食者方面发挥着重要的作用【3 3 3 4 】。因而，最近几年关于 海绵相关微生物多样性的研究和微生物活性代谢产物的研究越来越多。 海绵属非经济类海洋生物，两千多年前，地中海沿岸的居民曾利用海绵( 角骨 海绵s p o n 西a ) 的角质骨骼作为沐浴、洗涤、医药、美术、美容等用。十九世纪初人 类从现代科学的角度认识海绵，对海绵进行了生物学分类。并从海绵不易被其它动 物捕食等特点，推测海绵体内可能存在一些特殊的化学防御物质。但直到二十世纪 五十年代，人们对于研究海绵体内的活性物质才产生很大的兴趣。随着海绵体内生 理活性物质的大量筛选和发现，近年来海绵已成为已知的海洋天然产物的最大来 源，因此对海绵的研究及其生理活性物质的开发己成为海洋药物开发的重要热点。 但在海绵相关药物开发上，同样存在着海洋生物药源供应上的瓶颈：即难以持续而 大量地提供基础和临床研究用药。目前的解决方案基本上有三种：一是采用人工养 殖海绵，目前取得了一些成功的例子，但是总的来说技术难度大，而且很多的海绵 都无法人工养殖。第二种方法是用化学合成手段制备海绵产物的结构类似物，此法 是目前最为常用的方法，许多已进入临床试验阶段的海绵来源的药物都是通过此方 法得到的。但是，此方法的局限在于很多海洋来源的化合物结构复杂，人工合成难 度大、步骤多、成本高，还有一些根本无法人工合成，因而很多药物被迫终止于临 床试验阶段。第三种方法是从海绵相关微生物着手，通过筛选得到能产生活性物质 的微生物，利用发酵工程技术制备用于基础和临床研究所需的活性产物。这一方法 有望解决海洋药物可持续供应的瓶颈问题，也正是本课题的意义所在。 + 靴t 蟑蟹f 辑修t 坤：蚋j ，和 舻t 移，撵。母，、 携 t 慷、取辫韩妒妒：节 瓣淘鬻 套辫瞎孳。矗簿盘编嘶张- 铤鬈锄锈冀蟹 中均磊貔荔! 肇# j 叠锋 ， 岛，琶礴。知薄 缝，越确霰嬲t i 嚣疆魄哮病， 图1 1 海绵滤食过程示意图 9 中国协和医科大学硕士学位论文 1 1 1 本实验所采集的海绵 图1 2 丰肉结海绵 图1 - 3 相似蜂海绵 上图为本实验室所采集的两种海绵，采集地点位于海南省陵水县新村港附近水 域，经中科院海洋所的李锦和教授鉴定为丰肉结海绵( g e f ? f o 枷c a m d 5 口 d e n d y ，1 8 8 9 ) ( 图1 1 ) 和相似蜂海绵( 月a ，f c f o ，l 口m a 胁z d ，z 口) s 砌“肠舢j o h s t o n ，1 8 4 2 ) ( 图1 2 ) ，本课题主要围绕相似蜂海绵展开。 1 2 海绵相关微生物多样性研究的方法 最早研究海绵相关微生物多样性的方法包括微生物分离培养与经典分类，这也 是目前仍然采用的主要方法之一。该方法要应用到不同培养基进行分离培养，对培 养的菌株进行形态学研究和理化性质研究并鉴定到种属，研究其生物多样性【1 0 。2 1 。 科学家们已经应用该方法调查了大量的海绵相关微生物，获得了相当丰富的可培养 的真菌和细菌【l ”1 1 ，为天然产物的研究与开发奠定了重要的物质基础。然而，传统 分类方法也面临一些困难，主要是由于许多微生物种类多、分布广、形态特征复杂， 且环境因素使得有些种类的形态特征和理化指标不够稳定，造成对一些物种的分类 上存在意见分歧。近年来许多分子生物学技术被引入到微生物分类工作中，使得传 统的分类方法如虎添翼。其中，基于核糖体r n a 基因( r d n a ) 序列分析的分子系 统学研究就提供了一种研究物种间系统发育关系和物种分类的有效方法【2 7 2 9 1 ，包 1 0 中国协和医科大学硕士学位论文 括r d n a i t s 序列、1 6 sr d n a 序列、线粒体细胞色素b 基因序列和线粒体1 2 sr d n a 序列的测定和s n p 、d d g e 、r f l p 等分析方法，这些方法在海绵相关微生物多样 性研究方面的应用已经有相当多成功的例子，取得很多新发现【1 6 ，2 2 粕】，特别在分析 一些形态学特征和生理生化指标都比较缺乏的菌株时其作用更明显。另一方面，由 于受到培养基种类的局限和培养条件的限制，目前自然环境中可培养微生物估计只 占很小一部分【1 6 】，大多数微生物很难通过常规培养方法分离出来，这样采用传统分 类方法就无法全面反映自然界的微生物多样性。分子生物学方法的应用可以弥补这 一缺憾，后者不仅可以用来快速分析可培养微生物的分类地位及其相互关系，也可 以用来发现大量的未培养( u i l c u l t u r e d ) 微生物，甚至可以通过宏基因组 ( m e t a - g e n o m i cd n a ) 技术发现有潜在开发利用价值的新的生物合成基因【3 4 】。最近 关于海绵相关微生物分子系统学与生物多样性的研究，大都采用基于核糖体小亚基 r n a 序列如细菌1 6 sr d n a 序列来研究原核生物的多样性；研究真菌多样性则通常 采用r d n a i t s 序列分析等方法。 1 2 1 r r n a 基因序列和i t s 序列在生物多样性研究中的作用 核糖体r n a 存在于所有的细胞形态的生物中，故而分析和比对这些r r n a 的序 列可以广泛地用于推断各种生物之间的进化关系。著名的古细菌、细菌和真核生物 三界理论就是基于r r n a 序列的分析手段而提出吲3 2 】。r r n a 分子由高保守序列和可 变序列组成。一些重要的序列区域在不同的物种中也是高度保守的，相同分类单元 的物种间都有其共同的分子标记，即指这些代表一个类型的保守序列，用于分子进 化关系分析。最常用的方法是通过测序或其它方法获得r r n a 分子的接近全长或部 分重要序列，通过构建系统树来推测生物间的进化关系。本研究就是基于核糖体 r r n a 基因序列分析来进行海绵相关微生物多样性研究的。 r d n a i t s 序列存在于真核生物中，其全称为核糖体r n a 基因( r d n a ) 内转录 间隔区( i n t e m a lt r a i l s c 曲e ds p a c e r i t s ) ，分为两个部分i t s l 和i t s 2 ，分别位于 1 8 sr d n a 、5 8 sr d n a 和2 8 sr d n a 三者之间。下图即显示出i t s l 、i t s 2 和一些 常用的引物位置。 中国协和医科大学硕士学位论文 l 盟覃u n 删 i 型卜 i 坠k i h i r d n a 18 s l t s l 5 8 si t s 2 r d n a r d n a 1 话2 + 亓孓41 话4 七a s i d i o。i t s 2 l t s 4i t s 铀a s i d i o 一 l t s 4 s 图1 - 3i t s 序列和引物示意图 核糖体1 6 sr n a 主要存在于原核细胞以及真核细胞的细胞器( 如：动物线粒 体、植物质体等) ，其功能同源且最为古老，既含保守序列也含可变序列，分子大 小( 约1 5 k b ) 适合操作。可变序列因不同的物种而各不相同，而保守区序列基本 不变，所以可以利用保守区来设计引物，将不同原核物种的1 6 sr n a 基因片段扩 增出来，利用可变区序列的差异来对不同的原核生物进行分类。 而真核生物r d n a i t s 序列由于不加入成熟的核糖体，受进化选择的压力较小， 则变异最快，从中可获得较多的遗传信息，其分辨率可以到种的级别【3 1 1 。由于 r d n a i t s 序列特殊位置和特性，其邻接的1 8 s 、5 8 s 和2 8 sr d n a 序列比较保守， 正好可用来设计一系列通用引物，扩增出不同分类单元的r d n a i t s 序列，使之更 易于被用作系统分类研究的分子标记。 当然，这些方法也存在自身的局限，比如，一方面具备相同的d n a 有时却不 一定表示两者是同一物种，另一方面，同一物种的某个d n a 也可能有较大的不同， 在序列差异上总会有一系列中间类型，等。d n a 质量和p c r 过程出现的误差也会 影响到分析结果。这就需要综合多种分析方法( 包括多种分子标记的比较和传统方 法的应用) 以得出科学的结论。工作中注意获得高质量的d n a 、采用高保真呦 酶、用多个测序结果相互校正等可避免上述误差的出现。 1 2 2 分子系统学研究方法简介 分子系统学研究主要是基于不同分类单元的d n a 序列和氨基酸序列，再利用 计算机软件构建系统发育树，以调查所研究的分类单元间的亲缘关系。 所谓系统发育树，是指描述一群有机体间的发生或进化关系的拓扑结构图。 构建系统树的方法主要有三种。一是简约法，其中应用最普遍的是最大简约法( m p 法) ，这种方法意在确定最短的系统树。也就是该类型树只需最少的进化步骤就能 解释所有的序列间的变异。利用m p 法构建系统树，实际上是从所有可能的树中间 挑选一个长度最小的树作为最终的系统发生树，是目前较为精确的方法，但是费时 中国协和医科大学硕士学位论文 较长，本文在构建真菌系统发生树时就采用了此法。二是距离法，其中最常用就是 邻接( n j ) 法，将遗传序列变异转化为距离来进行计算，此法快捷简便，因而较为常 用，本文也采用此法进行了分析。三是似然法，其中影响最大的是最大似然法，在 构建系统发育树时，首先得确定一个序列进化的模型，如k i m u r a 二参数模型等。 这些模型都是建立在一定的假设基础上，考虑两个分类单位之间的关系。此法应用 过程中需要各分类单元都具有完整的d n a 序列，运算时只考虑碱基的取代而不考 虑缺失和插入，计算过程比较复杂费时，故而应用性不如前两种方法。 目前分子系统学在研究微生物间的系统关系和发现新微生物物种方面取得了 显著的成就，但是难免存在一些问题。首先，研究依据比较单一，在进行微生物多 样性分析时，大多集中于1 6 s d n a 、1 8 sr d n a 、2 8 sr d n a 和r d n a i t s 序列等，这 些序列虽然在一定程度上能够反应物种间的进化关系，但是它们的碱基数量有限， 不可能完全反映出分类单元之间的系统发育关系，故而有时会有一些与真实情况相 矛盾的现象。再者，分析软件还需要进一步加强，每一种算法和模型都有其自身的 缺陷，导致一定程度的失真，影响分析的精确度。 虽然存在这样一些问题，但是在正确实验方法指导下和选择合适的模型或算 法，能最大程度降低这种失真，使之能反映真实的系统发育关系。 1 3 本论文的实验设计思路 1 3 1 研究的意义 如上所述，本实验主要通过分离培养的方法从海洋生物海绵中分离培养真 菌和细菌，一方面是希望从这些微生物中发现具有开发价值的活性化合物，包括抗 肿瘤、抗菌、抗衰老和抗糖尿病等药理活性的物质，并最终开发成为新药；另一方 面，通过基于分子生物学的方法，研究海绵相关微生物的多样性，发现新的物种， 为我国海洋微生物生态领域的研究积累有价值的数据；通过未培养微生物的研究， 为今后展开宏基因组方面的研究积累经验。 1 3 2 实验设计 总体上包括三个方面： 1 ) 相似蜂海绵相关真菌多样性分析 首先采用含有抗细菌抗生素的海水y p d 、海水p d a 及m 撕n eb r o t h 固体培养基 分离培养得到形态不同的真菌菌株，提取基因组d n a ，应用真菌“通用”引物如 i