（环境工程专业论文）高效液相色谱技术及在水质检测方面的应用.pdf

a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y a so n eo ft h es t r o n g e s tm e a n s o fs e p a r a t i o na n da n a l y s i s h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh a v eb e e n d e v e l o p e dg r e a t l yi nt h ea s p e c t so ft h e o r y p r a c t i c ea n de q u i p m e n ts y s t e m i nr e c e n t y e a r s f u r t h e re x p a n d e dt h es c o p eo fa p p l i c a t i o ni ne n v i r o n m e n t a l m e d i c a l l i f e s c i e n c e sa n do t h e rf i e l d s h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh a sb e e ni m p r o v e d a l s o o nt h eb a s i so ft h e o r ya n ds t r u c t u r e t h i sp a p e rm a i n l yd i s c u s s e sh o wt oa c h i e v e t h ep u r p o s eo fo p t i m i z a t i o no fs e p a r a t i o nc o n d i t i o n sf o r mt e s t i n gt h er e a le x p e r i m e n t s a n da n a l y z i n gp r o c e s so f d e t e c t i o ni nt h e o r yf o r maw a t e rq u a l i t ya n a l y s t sp e r s p e c t i v e t h i sp a p e ri n t r o d u c e st h eh i s t o r i c a ld e v e l o p m e n tp r o c e s sa n dc h a r a c t e r i s t i c so f h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a n dp r e s e n t st h er e s e a r c h e sa n da p p l i c a t i o n s a th o m ea n da b r o a di nt h ea s p e c t so fs e p a r a t i o no ft e c h n o l o g y s o f t w a r ea p p l i c a t i o n s a m p l ep r e t r e a t m e n tt h r o u g ht h el i t e r a t u r ea n da n a l y s i s i nt h ec h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s s a m p l e p r e t r e a t m e n t i s v e r yi m p o r t a n t s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n o n ek i n do fs a m p l ep r e t r e a t m e n ts k i l l si sb e c o m i n gm o r ea n d m o r ea p p l i c a b l ef o ri th a sas i g n i f i c a n ta d v a n t a g ei nt h ee x t r a c t i o no fo r g a n i s mi nt h e w a t e ri nc h i n a b a s e do nb r i e fi n t r o d u c t i o n so fs o m ec o m m o nm e t h o d so fs a m p l e p r e t r e a t m e n t t h i sp a p e rf o c u s e so np r e s e n t i n gt h es y s t e m a t i cp r o c e d u r e so fs o l i d p h a s e e x t r a c t i o n c o m m o np r o b l e m sc o l l e c t e di n t h e e x p e r i m e n ta n dp r o s p e c t i n g t h e d e v e l o p m e n to fa u t o m a t e ds o l i d p h a s ee x t r a c t i o ni nt h ef u t u r e h i g h p r e s s u r ef l u i dp u m p c o l u m n d e t e c t o r t h et h r e ek e yc o m p o n e n t so f 1 1 i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n ds t a t i o n a r yp h a s e m o b i l ep h a s e c o l u m n t h ec o r eo fh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o ns y s t e mn o to n l y c o m p l e m e n tb u ta l s oi m p a c te a c ho t h e r s t h ew a yt o a c h i e v et h eb e s ts e p a r a t i o n e f f i c i e n c yi st om e e te a c ho t h e r sp e r f e c t l yb yc o r r e c tc h o i c ea n dc a r e f u ld e s i g n t h i s p a p e rs y s t e m a t i c a l l yi n t r o d u c e s t h es t r u c t u r e s f u n c t i o n sa n dt y p e so fc o l u m n h i g h p r e s s u r ef l u i dp u m pa n dd e t e c t o rs e p a r a t e l y f o c u s i n go nt h ea p p r o p r i a t eu s eo f m o b i l ep h a s e t h em e a n sa n de x p e r i e n c eo fa d j u s t i n gm o b i l ep h a s e a sw e l la st h ew a y o fa d j u s t i n gs p e c t r a la n a l y s i sw i t ha d d e dm o d i f i e r f o rt h ec o m p l e x i t yo ft h ed e t e c t e d o r g a n i s mi nw a t e r t h ep a p e ra l s oc o n d u c t sai n d i v i d u a li n t r o d u c t i o nf o rg r a d i e n t e l u t i o n d e r i v a t i z a t i o ni nw a t e rq u a l i t yt e s t i n gh a sb e e na p p l i e dw e l l s ot h i sp a p e r i n t r o d u c e st h ec o m m o n l yu s e dd e r i v a t i z a t i o nm e t h o d s t h e i rc o r r e s p o n d i n gr e a g e n t sa s w e l l 鹊c h o i c ef o rd e r i v a t i v ea g e n t n ee x p e r i m e n ti s t h ec h a n g i n gc o n d i t i o n so fc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n s i m p a c to nt h em i c r o c y s t i n l i 乙一r r t h ei n f l u e n c eo ns e p a r a t i o ne f f e c to ft h e m i c r o c y s t i n l r r rb ya d j u s t i n gs u c hs e p a r a t i o nc o n d i t i o n sa sf l o wr a t e b u f f e r s o l u t i o n m o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o na n dp hv a l u ec a l lb eo b s e r v e da n dt h ei m p o r t a n t r o l eo fm o b i l ep h a s ei nc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nc a nb er e f l e c t e dd i r e c t l y t h i sp a p e rt a k e ss o m et e s ti t e m si n s t a n d a r dt e s tm e t h o df o rd r i n k i n gw a t e r a s e x a m p l e sf o re x p e r i m e n tt ov e r i f yt h ea b o v et h e o r yt 1 1 j r o u g ht h ec o n c r e t ep r a c t i c e a d j u s t sa n di m p r o v e sd e t e c t i o nm e a s u r e sa c c o r d i n gt ot h ea b o v e m e n t i o n e dl i q u i d c h r o m a t o g r a p h yk n o w l e d g e k e yw o r d s s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n c o l u m n d e t e c t o r g r a d i e n te l u t i o n p o s t c o l u m n d e r i v a t j z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果 除了文中特别加以标注和致谢之处外 论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果 也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文巾作 了明确的说明并表示了谢意 学位论文版权使用授权书 箩月0 日 本学位论文作者完全了解 苤鲞盘鲎有关保留 使用学位论文的规定 特授权苤盗基堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以供查阅和借阅 同意学校向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 学位论文作者签名 马籁 导师签名 签字日期 二一罗年乡月夕日 签字吼沙r 年 月面日 第一章绪论 1 1 高效液相色谱法简介 1 1 1 历史发展进程 第一章绪论 在液相色谱中 采用颗粒十分细的高效固定相 并采用高压泵输送流动相 全部工作通过仪器来完成 这种新的仪器分析方法称为高效液相色谱法 h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 以下简称h p l c 在过去三十多年里 高 效液相色谱已成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一 1 9 4 1 年 高 效液相色谱的市场销售量是1 4 亿美元 就是一个较好的证据 现在 高效液相色 谱几乎能够分析所有的有机 高分子及生物试样 在目前已知的有机化合物中 若事先不进行化学改性 只有2 0 的化合物用气相色谱可以得到较好的分离 而 8 0 的有机化合物则需要高效液相色谱分析 目前 高效液相色谱在有机化学 生 化 医学 药物临床 化工 食品卫生 环境监测 商检 和法检等方面都有广 泛的用途 而在生物和高分予试样的分离和分析中更是独领风骚 在短短的三十 多年里 高效液相色谱从初创一下发展成为成熟而广泛应用的分析方法 的确是 化学史上一件引人注目的事情 高效液相色谱发展史上的一个重要的里程碑是1 9 7 1 年 现代液相色谱实践 一书的出版 在1 9 7 1 年以前 普遍使用的方法是改变固定相来作为调整选择性参 数的方法 改变固定相优于改变流动相可能基于以下两个方面的原因 第一 研 究者在g c 研究中不倾向于改变流动相来改变选择性 第二 使用液一液色谱时 改变流动相常常需要固定相上的同时改变 以保持两种液相的不相混溶性 这段 时间是高效液相色谱的前奏和萌芽 而直到1 9 7 1 年后高效液相色谱的分析方法才 逐步建立和完善瞄1 回顾h p l c 的发展历史 主要的大事件如下表1 1 综上所述 高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上 引入气相色谱理论和 技术 并对经典液相色谱法的固定相 设备 材料 技术及理论应用进行了系列 改进而发展起来的新型分析分离技术 在高效液相发展的过程中 分析学家们主 要进行了以下突破性几项工作 第一 色谱柱的改进和完善 主要包括固定相填 充微粒粒度的改进和流动相溶剂的选择 第二 仪器方面的改进工作 加入了一 个高压泵 缩短了分离时间 高效液相色谱有效塔板数比传统液相色谱提高了数 第一章绪论 百倍 提高了分离效率 第三 与计算机联用之后 自动化程度大大提高 表卜1h p l c 的发展历史的主要重大事件 1 1 2 高效液相色谱法特点 传统的柱色谱 薄层色谱和纸色谱其操作繁琐 分析时间冗长 因而未受到 重视 气相色谱法具有选择性高 分离效率高 灵敏度高 分离速度快的特点 但它仅适用于分析蒸气压低 沸点低的样品 全部有机化合物的2 0 高效液相 色谱法使用了伞多孔微粒固定相 装填在小口径短不锈钢柱内 流动相通过高压 输液泵 进入高柱压的色谱柱 溶质在固定相的传质 扩散速度大大加快 能在 短的分析时间内获得高柱效和高分离能力 并保持液相色谱法对样品适用范同广 流动相种类选择多等特点 此外由于分析原理的不同 高效液相色谱法适用于高 沸点的有机物 高分子和热稳定性差的化合物 以及生物活性物质的分析和分离 弥补了气相色谱法的不足 针对高效液相色谱的优越性 其特点总结如下眵1 1 分离效能高高效微粒固定相填料的使用 使液相色谱填充柱的柱效可达 5 1 0 3 3 1 0 4 块 m 理论塔板数 远远高于气相色谱梓1 0 3 块 m 理论塔板数 2 选择性高由于色谱柱具有高柱效 流动相可以控制和改善分离过程巾的 选择性 因此高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构 体 还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体 第一章绪论 3 检测灵敏度高高效液相色谱使用的检测器大多数都有较高的灵敏度 紫 外检测器的最小使用量可达1 0 呻g 荧光检测器的最小使用量可达1 0 1 2 9 4 分析速度快高压输液泵的使用 使分析时间大大缩短 当输液泵压力增 加 流动相流速就会加快 完成一个样品仅需要几分钟到几十分钟 除以上特点外 高效液相色谱的使用范围也在不断扩展 由于它使用了非破 坏性检测器 样品被分析后 大多数情况可除去流动相 实现对少数珍贵样品的 回收 也可用于样品的纯化制备 1 2 国内外应用与研究现状 在分离技术方面 2 0 0 4 年 w a t e r s 开发了一种新的液相色谱技术改变了分离 科学 我i f i n 它a c q u i t y 超高效液相色谱或u p l c 它使用d p 仅为1 7pm 的新型 固定相 色谱仪提供的ap 达1 4 0 m p a 2 0 0 0 p s i 可使在常规高效液相色谱需要分 析3 0 m i n 的样品在超高效液相色谱短短仅需5 m i n 并呈现出色谱柱柱效达2 0 万 块 m 理论塔板数的超高柱效 它保证高通量和高分析效率 却不会牺丰牛分离度h 1 然而u p l c 仍有其局限性 当小填料色谱柱在非常高的压力下进行操作 剧烈的摩 擦和溶剂的耐压性在实际应用中将受到限制 此外l c m s 联用技术的发展 简化 了样品过程 缩短了分析周期 并且不需要进行衍牛化n 1 在软件应用方面 色谱检测软件更加人性化 色谱方法的发眨和转换更加便 利 有机溶液的浓度 p h 温度 缓冲溶液的浓度能够更加有效的观察和改变n 在样品前处理方面 食品安全 医疗 国家安伞应用的市场在以高速率进行 增长 实验室力求整个样品前处理完全自动化使人的作用降至最低 而不是部分 实现 他们希望使之比目前的技术更快 更便宜 更好 更环保 这也应该是所 有液相色谱工作者共同努力的方向 由于国家支持和色谱专家和工作者的共同努力 高效液相色谱在我国食品安 全 医疗 化工 生物等方面都得到了广泛的应用 许多高效液相色谱方法都被 制定为国家检测标准进行执行 在色谱柱填料和液相色谱仪器制作方面也逐见完 善 第二章高教液帽色甜技术简介 第二章高效液相色谱技术简介 21 样品预处理 固相萃取技术 在色谱分析中 样品前处理具有1 分重要的意义 对组成复杂 含量低或受 外界条件 日光照射 受热 电磁辐射 氧化等 作用f 舡发生变化的不稳定样品 都需要经过与处理才能进行色谱分析 此外根据国际l c g c 杂志对外界1 0 0 0 多个 实验聿进行的统计 样品前处理所花赞的时问占整个分析过程的6 1 见图2 一1 从包谱分析的整个过程看 见图2 2 该统计发现在分析过程中样品前处理j 生 的误差最大 高返3 0 样品处理 6 1 数据处理2 7 9 6 采样6 分析6 图21 分析过程中各步骤所花费的时间 色谱柱 操作1 鲋 样品处理3 0 积分8 进样6 交叉污染4 图2 2 色谱过程中误差来源产生的几率 21 1 常见的样品前处理方法以及固相萃取技术的优势 经典的样品预处理方法有 液渡萃取法 蒸馏法 升华法 沉淀法 过滤法 第二章高效液相色谱技术简介 络合法 索氏提取法等 其中最传统也是水质检验中最常用的方法是液液萃取法 固相萃取 s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n 简称s p e 技术 发展于上世纪7 0 年 代 是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附 与样品的基体和干扰化 合物分离 然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附 达到分离和富集目标化合物的目 的盯3 与传统的液液萃取法相比固相萃取法有很多优点 见表2 i 目前在国际 上s p e 技术在许多领域逐渐取代了液液萃取而成为样品前处理的有效手段 表2 一l 液液萃取与固相萃取比较 从表2 1 可以看到同相萃取技术很大程度弥补了液液萃取的不足 虽然固相 萃取技术由于本身的原理和构造 存在一定的局限性 但是在水中有机物的前处 理方面有显著的优势 在国内正得到越来越多的应用 2 1 2 固相萃取的基本程序 2 1 2 1 实验前的准备 影响保留的三个因素 分析物 基质 吸附剂 分析物的保留可通过基质和 吸附剂进行改善阳1 三者之间关系如下图2 3 1 吸附剂的选择 使用固相萃取技术 有三种常用的萃取机理 极性 非极性和离子交换 萃 取机理的选择首先要考虑样品基质的组分和目标分析物 卜的官能团 给定萃取机理的每一种吸附剂对于既定化合物而言 都具有独特的保留和选 择性 尽管如此 对于非极性萃取机理 则必须试用几种不同的吸附剂 选择一 种最为适合的吸附剂 可以兼顾回收率和净化效果 已达到最佳的萃取结果 第 章高救浊相色谱拉术简介 l 毁附荆基质 罔2 3 分析物 基质 吸附剂之间的关系 例如 c 1 8 和c 8 吸附剂从水溶性基质中萃取非极性分析物 都会得到很高的 叫收率 但是c 8 的极性稍高 使得许多基质干扰成分穿透吸附剂而不被保留 但 是这此干扰物质却可能在强非极性的c 1 8 吸附剂上发牛保留 所以 使用c 8 吸附 剂有时会得到很干净的萃取效果 此外吸附剂选好后还要考虑其容量 吸附剂的容量定义为 给定赝量的吸附 剂 在最佳条件下可以保留分析物的总质量 不同的键合硅胶吸附剂 其保留容 量也有很大币同 对于极性和非极性硅胶基质的吸附剂而言 其保留容量常常小 于吸附剂质量的1 有时也会超过5 例如5 0 0 m g c l 8 吸附剂至多可以保留2 5r n g 目标分析物和干扰物质 在某一个处理过程中 对给定吸附剂需要选择所需用量 时 不但要考虑对目标分析物的保留容量 还要考虑样品中可能会发生共保留的 样品干扰组分 一般较大的吸附剂质量 保留容量也会很大 但是所需要的洗脱 溶剂量也台加大 与小柱床体积吸附剂的s p e 柱相比 最终洗脱液中的分析物浓 度也会偏低 2 基质的考虑 首先 考虑从干扰物 样品基质中萃取物质 并找到分析物中与干扰物质不同 的化学官能团 选择合适的吸附剂 使其与目标分析物之间的相互作用和与干扰 物之间的相互作用机理不同 例如 分析物中包含苯环官能团 则可以选择苯基 固定相 其次 考虑样品基质 如果分析物一般带有正电荷 但基质却是盐溶液 那 么如果选择阳离子吸附剂 分析物和其它干扰物会与吸附剂上的离子交换情点产 生竞争吸附作用 就不会得到太好的萃取净化效果 3 样品预处理 调节样品的p h 值 改善吸附剂对分析物质的保留 第二章高效液相色谱技术简介 例如 选择c 1 8 等非极性吸附剂 而分析物含有带电的官能团 萃取前需要 对样品的p h 值进行升高或者降低 以中和分析物上的电荷 并以此来增加分析物 的保留效果 相反 如果选择离子交换吸附剂 可以调节样品p h 以保证分析物中 的重要成分带有合适的电荷 从而达到最佳保留效果 对被测组分在样品中溶解性较差的物质 可以添加适量的改性剂 以增加其 在样品中的溶解度 2 1 2 2 固相萃取的四个基本步骤 固相萃取技术在样品处理中的作用分两种 一是净化 二是富集或者溶剂交 换 从水相到有机相 这两种作用可能同时存在 固相萃取的基本程序可分为以 下四个步骤 如图2 4 1 但实际应用时可根据最后分析手段对样品的要求对这 四个步骤进行增加或减少 c o n d l t t o n l n g 二o i v e n t car娥tridq却e 然嬲口触 o i r 图2 4 固相萃取实验步骤 1 活化 使柱床溶剂化 从而产生一个使样品基质与s p e 吸附剂可发生重复性的相互 作用的环境 采用一定体积的合适的溶剂淋洗柱床 随后用与样品基质溶剂特性 相似的溶剂淋洗 例如 常见c 1 8s p e 柱的活化是先用甲醇 随后用水进行淋洗 以创造一个适合水溶性样品基质中分析物萃取的环境 2 保留 将样品加入到活化后的s p e 柱中 分析物以及其它样品基质组分 通过一种 或多种作用力 例如范德华力或者c h 链和c 1 8 键合相上c h 链之间的非极性相互 作用 在吸附剂上发生保留 基质干扰组分会穿透c 1 8 键合相 而不发生保留 因此在样品保留操作这一步骤 可能已经发生了净化作用 m如口写一 訾一 蓉 一埘l 鼢蛾呻一 砂翠口 裴 第二章高效液相色谱技术简介 3 淋洗 用溶剂淋洗s p e 柱 以洗掉干扰组分 而将分析物保留在柱床上 例如 在 c 1 8 吸附剂上进行的非极性萃取 常用的淋洗溶剂是水 缓冲液或者是水与溶剂的 萃取物 4 洗脱 选择可以打破分析物和吸附剂之间相互作用的合适溶剂来淋洗柱床 选择性 的洗脱目标分析物 以非极性萃取为例 有机溶剂具有足够强的洗脱能力 可以 打破非极性分析物和c 1 8 键合相之间的相互作用 如甲醇 乙腈 二氯甲烷等 此外 如果最后的洗脱溶剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂 而分析手段为反 相h p l c 则固相柱上的残留水对分析影响不大 但是 当非水溶性有机溶剂为洗 脱剂或分析手段又为气相色谱时 应该在淋洗后对固相柱进行干燥 2 1 3 实验常见问题及解决 以下主要是针对非极性萃取常出现的问题 2 1 3 1 保留不充分 1 问题 在上样保留分析物阶段 就发生洗脱现象 2 解决方案 1 增强基质环境中的极性 如果样品在有机溶剂中 将溶剂转为水或者缓冲 液 以保证正常保留 2 如果目标分析物是中性 将会更容易被保留 因此 如果分析物带电 则 可通过调节p h 值来中和分析物基团上的电荷 3 上样时 一定要确认柱床仍处在于活化后的润湿状态 如果活化后真空仍 然保留 时间超过l m i n 后 必须重新进行活化操作 w a t e r s 的h l b 除外 4 降低样品流速 可通过阀调节 当所有吸附剂柱床小于1 9 时 常用的样品 流速为2 4 m l m i n 2 1 3 2 净化不彻底 1 问题 在分析过程中出现干扰峰或者假阳性 2 解决方案 1 用不同的混合溶剂和缓冲液进行选择性淋洗 去除干扰物而不洗脱目标分 析物 第二章高效液相色谱技术简介 2 用不溶解目标分析物溶剂淋洗 3 试用不同的非极性吸附剂 4 试用其它选择性较强的保留机理 一般极性萃取比非极性萃取有更强的选 择性 离子交换比极性萃取的选择性还要强 5 可以叠加使用不同类型吸附剂的s p e 柱 例如 将s c x 阳离子交换柱至于 c 1 8 上面 在样品达到c 1 8 柱前 可以去除大部分阳离子干扰物 2 1 3 3 洗脱不充分 1 问题 分析物的洗脱量 9 0 上样量 2 解决方案 1 确认选择的洗脱剂可以溶解目标分析物 2 有些物质会受到吸附剂表面未键合硅醇基的次级相互作用 通过试验用溶 剂结合不同p h 值得缓冲溶液来消除这些次级作用 例如 在洗脱溶剂中加入0 5 的盐酸或者5 的三乙胺 可以提高带有氨基的化合物的回收率 3 改用更强一些的洗脱剂 或者在洗脱液中加入强洗脱溶剂 4 如果使用合适的溶剂也无法将分析物从c 1 8 吸附剂i 二洗脱 则可以选用非 极性特性稍弱的c 8 或者c 2 吸附剂 可能会更容易洗脱 5 将所有洗脱液 分2 3 次分别进行洗脱 2 1 3 4 回收率不稳定 1 问题 分析物的洗脱量 9 0 上样量 2 解决方案 1 加大洗脱体积 2 使用更强的洗脱溶剂或者加入各种缓冲溶液 以找到更好的洗脱溶剂来洗 脱所有的目标分析物 再次 要考虑次级相互作用的影响 3 确认目标分析物在整个过程中不会发生降解 4 基质中可能含有不同水平的干扰萃取的化合物 如果由于样品中的盐分导 致1 同的保留结果 可用水稀释样品 另外 样品中高含量的脂肪会降低吸附剂 对分析物的保留容量 如有需要 可更换大柱床s p e 柱 5 调整样品的p h 以抑制分析物的离子化 中性物质与带电荷物质相比 在 非极性吸附剂上的保留效果更好 生物样品中 分析物可能会与蛋白发生键合 可以通过调节p h 值 加入改性剂或者对蛋白进行沉淀以破坏这种键合作用 6 确保柱床已经经过正确活化 并且要确认上样和洗脱步骤的样品和溶剂流 第二章i 岳效液相色谱技术简介 速不会太高 2 1 4 固相萃取的自动化 样品前处理是化学分析过程中的重要一环 它直接影响最后的分析结果 自 动化是解决样品前处理过程中遇到的一系列问题的最佳方法 它可广泛用于体内 药物分折 生化分折 环保分折以及食品分折中的自动化样品前处理 随着技术 的不断发展 大家越来越认识到固相萃取自动化的重要性 它不仪能自动处理各 种样品 与h p l c g c 联用 使整个分析过程自动化 将分析人员从繁琐的工作中 解放出来 更重要的是可以提高分折的准确度和精密度 便于方法的传递和实验 室的质量控制 训 2 2 高效液相色谱条件的选择 高效液相色谱仪的三大关键部件分别为 高压输液泵 色谱柱 检测器 而 h p l c 的分离过程又是在色谱梓内进行的 这个分离系统包括固定相 流动相和色 谱柱 液相色谱分离效率和分离能力取决于固定相和流动相的精心设计和配合 1 因此 为了能够有目的性的进行实验 确保实验更好完成 对该三大关键部件的 理解和选择十分重要 2 2 1 色谱柱的选择 柱子是色谱的核心 没有选择正确的色谱柱和恰当的操作条件 高效液相色 谱分离方法的发展和最佳化将无法实现 引 好的色谱柱要求耐高压 耐腐蚀 抗 氧化 密封不漏液和柱内死体积小等等 2 2 1 1 固定相的选择 高效液相色谱法中常用的液l 司色谱法 液液色谱法 键合相色谱法 亲和色 谱法和体积排阻色谱法 选择正确的色谱柱首先要了解不同色谱方法对应其固定 相及其特性 见表2 2 以及常见分离方法的使用率 见表2 3 针对 生活饮用水标准检验方法 中被检测项目的性质 考虑到色谱柱稳定 性 柱效 柱寿命 重现性 选择性 并可进行梯度洗脱操作 高效液相色谱法 进行水质分析时我们首选键合相色谱法 柱填料首选键合固定相中的反相键合相 实验表明反相键合相的稳定性比正相键合相更好 第二章高效液相色谱技术简介 表2 2 不同色谱方法对应其固定相及其特性 第二章高效液相色谱技术简介 正向键合相5 9 c n n h 等 水相 3 6 2 2 1 2 孑l 径的选择 色谱柱孔径的选择要考虑被检测物质的分子量 二者关系如下表2 4 表2 4 被测物之分子量与柱孔径之间的关系 被测物之分子量柱孔径 3 0 0 06 0 1 2 5a 3 0 0 0 1 0 0 0 01 2 5 3 0 0a 2 2 1 2 粒径的选择 高效液相色谱柱标准粒径为3 3 5um 和5um 生产厂商现在能制造的小直径 粒子排列相当紧密 平均粒径可达1 5pm n 3 2 2 1 2 柱长的选择 色谱柱越长 柱效越高 可以得到较高的理论塔板数 但同时也延长了检测 时间 2 2 2 流动相的选择 2 2 2 1 宏观上选择 1 用作流动相的溶剂应与固定相不互溶 并能保持色谱柱的稳定性 所用溶 剂应有高纯度 以防所含微量杂质在柱中积累 引起柱性能的改变 第二章高效液相色谱技术简介 2 选用的溶剂性能应与所用的检测器相匹配 如使用紫外吸收检测器 就不 能选用在检测波长有紫外吸收的溶剂 若使用示差折光检测器 就不能使用梯度 洗脱 因随溶剂组成的改变 流动相的折光指数也在改变 就无法使基线稳定 3 选用的溶剂应对样品有足够的溶解力 以提高检测的灵敏度 4 选用的溶剂应具有低粘度和适当的低沸点 使用低粘度溶剂 可减小溶质 的传值阻力 利于降低柱压并提高柱效 低沸点的溶剂易用蒸馏的方法从柱后收 集液中除去 利于样品的制备和纯化 但沸点不要太低 否则容易产生气泡 导 致实验无法进行 5 选用溶剂时应考虑其毒性 易燃性 可压缩性等 以保证操作人员的安全 6 溶剂的纯度并非液相色谱流动相都应使用十分纯的溶剂 关键是能否满 足检测器的要求和使用不同瓶 或批号 的溶剂时 能否得到重复的色谱保留数 据 作痕量组分分析时 要求溶剂纯度较高 用紫外检测器时 使用波长越短 如 2 0 0 n m 要求溶剂纯度越高 7 在流动相配制好后 一定要进行脱气 除去溶解在流动相中微量气体 既 有利于检测 还可以防止流动相中微量氧气与样品发生作用 常用的脱气方法有 真空脱气 通氦脱气 超声波脱气 制 2 2 2 2 在键合相色谱中流动相选择的一般原则 在键合相色谱分析中常使用二元混合溶剂作为流动相 此时流动相的极性参 数p 可按下述公式 2 1 进行计算 p m i x a x p a o bx p b 2 1 式中p m i x 为二元混合溶剂的极性参数 p a p b 分别为溶剂a 和溶剂b 的极性参数 常用参数表2 5 a b 分别为溶剂a 和溶剂b 在混合溶剂中所占的体积分数 表2 5 键合相色谱常用混合溶剂的极性参数值 第二章高效液相色谱技术简介 在正向色谱中 流动相的土体成分一般为己烷 或正庚烷 为改善分离的选 择性 常加入的优选溶剂为乙醚或甲基叔丁基醚 在反向键合相色谱中 流动相的主体成分一般为水 为改善分离的选择性 常加入的优选溶剂为甲醇 乙腈和四氢呋喃 一般情况下 甲醇一水系统己能满足多数样品的分离要求 且流动相粘度小 价格低 是反相色谱最常用的流动相 但做初始实验则推荐采用乙腈一水系统 因 为与甲醇相比 乙腈的溶剂强度较高且粘度较小 并可满足在紫外1 8 5 2 0 5 n m 处 检测的要求 但乙腈毒性较大 使用二元混合溶剂的不足之处 是由于非极性溶剂 如戊烷 和极性溶剂 甲 醇 有时不能以任意比例混合 而发生溶剂分层现象 此时可加入分别能与这两 种溶剂混合的具有中等极性的第三种溶剂 如异丙醇 二氯甲烷 二氯乙烷 乙 酸乙酯等 构成三元溶剂系统 而使混合溶剂强度发生改变 当分离含极性差别 较大的多组分样品时 为了使各组分均有合适的k 值并分离良好 也需采用梯度 洗脱技术 2 2 2 3 改善色谱分离的选择 性 1 向流动相中加入改性剂调节p h 值 1 抑制溶质的离子化 在反相色谱中常向含水流动相中加入酸 碱 或缓冲溶液 以使流动相的p h 值控制在一定数值 抑制溶质的离子化 减少谱带拖尾 改善峰形 以提高分离 的选择性 例如在在分析有机弱酸时 常向甲醇一水流动相中加入1 甲酸 或乙 酸 三氯乙酸 h p 0 h s o 就可以抑制溶质的离子化 获对称的色谱峰 对于 弱碱性样品向流动相中加入1 三乙胺 也可以达到同样的效果 2 调节离子强度 反相色谱中 当被分析物质为易离解的有机物时 随流动相p h 值的增加 键 合相表面残存的硅羟基与碱的阴离子的亲和能力增强 会引起峰形拖尾并干扰分 离 在流动性中加入0 1 一1 的乙酸盐或硫酸盐 硼酸盐 因为盐效应减弱残存硅 羟基的干扰作用 抑制峰形拖尾并改善分离效果 但经常使用磷酸盐或卤化物会 造成硅烷化固定相的降解 通常调节p h 对中性化合物的影响不大 但对带有离子化基团的化合物 如氨 基 羧基 羟基等 保留因子影响可达1 0 3 0 倍 分离度也发生明显的变化 但 是注意 如果使用的流动相中加入缓冲盐 最好在使用前用纯水过渡 如果缓冲 盐或离子对试剂浓度较低 则需要较长时问来平衡 2 调节流动相的溶剂极性强度 分析开发中流动相调整的三原则 第二章高效液相色谱技术简介 1 由强到弱 一般先用9 0 的乙腈 或甲醇 水 或缓冲溶液 进行试验 这 样可以很快地得到分离结果 然后根据出峰情况调整有机溶剂 乙腈或甲醇 的比 例 2 三倍规则 每减少1 0 的有机溶剂 甲醇或乙腈 的量 保留因子约增加3 倍 此为三倍规则 这是一个聪明而又省力的办法 调整的过程中 注意观察各 个峰的分离情况 3 粗调转微调 当分离达到一定程度 应将有机溶剂1 0 的改变量调整为5 并据此规则逐渐降低调整率 直至各组分的分离情况不再改变 2 2 3 泵的选择 高压输液泵的性质是以高压的形式 将流动相连续不断的输送到色谱流路系 统 典型的高压泵的种类有 注射泵 单头柱塞泵 双头柱塞泵 往复隔膜泵 气动放大泵 螺旋传动柱塞泵 高压泵按输液特性和工作原理 可分为恒压泵和恒流泵 由于高效液相色谱 分析要求流量稳定 目前一般使用的是往复式柱塞泵 它是一种恒流泵 最高输 出压可达4 1 0 p a 流速为0 0 1 1 0 m l m i n 输液系统的发展方向是采用多溶剂单泵 即在低压下进行连续混合以得到二元 三元 四元梯度的供液 为完成最佳分离 提供理想条件 对高压泵的要求是供液恒定 死体积小 密封性能好好等等 下 表2 6 为各厂家的输液泵 各具特色 2 2 4 梯度洗脱 梯度洗脱是采用两种 或多种 不同洗脱能力的溶剂 在分离过程中按一定 程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式 通过流动相极性的变化 来调整被分离样品的选择因子和保留时间 以使柱系统具有最好的选择性和最大 的峰容量来满足色谱分离在尽量短的时间内获得足够分辨率的要求 梯度洗脱技 术能够提高分离度 缩短分析时间 改善峰形 降低最小检测量并提高分析精度 对于复杂化合物 特别是保留性能相差较大混合物的分离 梯度是一种极为重要 的手段 1 别 第二章高效液相色谱技术简介 表2 6 各厂家 公司 高压泵的性能特点 2 2 4 1 梯度洗脱装置 梯度洗脱的溶剂系统可以是二元 三元或四元 但常用的是二元溶剂梯度 梯度洗脱主要有两种方式 即低压梯度洗脱和高压梯度洗脱 1 低压梯度洗脱装置 第二章高效液相色谱技术简介 又称外梯度洗脱 它的特点是溶剂在常压下 采用自动切换阀 按一定程序 进行混合 然后由一台高j 玉输液泵输送到色谱柱进行分离 它的装置如下图2 5 i 溶剂a 卜 驯向l 扯巴 i ll换 压佯谱 i 溶剂b r 阀泵阀拄 i l 莎 i 溶剂c 图2 5 低压梯度洗脱装置 2 高压梯度洗脱装置 又称内梯度洗脱 它的特点是两种或两种以上的溶剂有两台 或两台以上 高压泵输送到混合室 即在高压下混合 然后再进入色谱柱进行分离 高压梯度 洗脱对溶剂的脱气要求不如低j 玉梯度洗脱严格 但由于需要多台泵 因而成本较 高 它的装置如下图2 6 i 涮ah 泵al 昆j 垃 巴 11 i 合样 潜 i 溶剂b 泵b 物 阀 住 i 图2 6 高压梯度洗脱装置 2 2 4 2 梯度洗脱的可变参数 1 a 及b 液 流动相 的成分和化学特性 见2 2 2 流动相的选择 2 梯度的陡度 梯度陡度和各组分色谱峰的平均容量冈子成反比 梯度陡度增加梯度时间缩 短 但也减低了各组分间的分离度 反之 梯度陡度减小 则会改善各组分间的 分离度 却延长了总的分析时间 因此在梯度洗脱过程中梯度陡度的选择不能太 大 也不能太小 其数值适中才能获得满意的分离效果 3 梯度的变化形状 见图2 7 第二章高效液相色谱技术简介 图2 7 梯度的变化形状 2 2 4 3 梯度洗脱时应该注意的一些问题 在进行梯度洗脱时 由于多种溶剂混合 而且组成不断变化 因此必然带来 一些特殊的问题 问题如下 1 要注意溶剂的互溶性 不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相 有些 溶剂在一定的比例内互溶 超出一定的范围后就不会互溶 例如 乙腈和i m o l l 的醋酸铵 p h 5 1 6 做梯度洗脱 乙腈含量超过7 0 时就会出现不溶 甲醇和乙 烷混合 甲醇含量高于3 0 时就会分层等 当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析 出盐的结晶体 尤其使用磷酸盐时需特别小心 2 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 以保证好的重现性 进行样品分析前 必须进行空白梯度洗脱 以辨认溶剂杂质峰 因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱 头上后会被强的溶剂洗脱出来 用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气 以防止溶剂混 合时产生气泡 3 混合溶剂的黏度常随组成而变化 因此在梯度洗脱时常会出现压力变化 例如纯水或甲醇的黏度都比较小 但是当二者以相近的比例混合时黏度会增大很 多 此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍 因此要防止梯度洗脱过程中压 力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力 4 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理 使其恢复到初始的状态 需让1 0 一3 0 倍柱容积的初始流动相流经色谱柱 使固定相和初始流动相达到完全 平衡 5 注意梯度洗脱用水的有机物残留 往往在等度洗脱时用的水 在梯度洗脱 时发生问题 鬼峰 这是因为在梯度过程中 水占的比例很高时的流动相洗脱 能力很低 此时水中的有机物残留就被色谱梓吸附并浓缩 等到强溶剂占高比例 时 浓缩的有机物被高洗脱能力的流动相洗脱而流出色谱柱 并成为一个色谱峰 从而干扰分析 第二章高效液相色谱技术简介 2 2 5 检测器的选择 检测器是h p l c 仪的三大关键部件之一 其作用是把洗脱液中组分的量转变为 电信号 h p l c 的检测器要求灵敏度高 噪音低 即对温度 流量等外界变化不敏 感 线性范围宽 重复性好和适用范围广 2 2 5 1 分类 1 按原理可分为光学检测器 如紫外 荧光 示差折光 蒸发光散射 热 学检测器 如吸附热 电化学检测器 如极谱 库仑 安培 电学检测器 电 导 介电常数 压电石英频率 放射性检测器 闪烁计数 电子捕获 氦离子化 以及氢火焰离子化检测器 2 按测量性质可分为通用型和专属型 又称选择性 通用型检测器测量的 是一般物质均具有的性质 它对溶剂和溶质组分均有反应 如示差折光 蒸发光 散射检测器 通用型的灵敏度一般比专属型的低 专属型检测器只能检测某些组 分的某一性质 如紫外 荧光检测器 它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有 响应 3 按检测方式分为浓度型和质量型 浓度型检测器的响应与流动相中组分的 浓度有关 质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关 4 检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种 2 2 5 2 常用检测器 1 紫外检测器 u l t r a v i o l e td e t e c t o r u v 检测器是h p l c 中应用最广泛的检测器 当检测波长范围包括可见光时 又 称为紫外一可见检测器 它灵敏度高 噪音低 线性范围宽 对流速和温度均不敏 感 可于制备色谱 由于灵敏高 因此即使是那些光吸收小 消光系数低的物质 也可用u v 检测器进行微量分析 但要注意流动相中各种溶剂的