β雌二醇对人卵巢癌细胞株HO8910 KLK6基因表达的调节.doc

雌二醇对人卵巢癌细胞株HO8910 KLK6基因表达的调节【摘要】目的：探讨17雌二醇（17E2）对雌激素受体阳性人卵巢癌HO8910细胞中组织激肽释放酶6（kallikrein 6， KLK6）基因mRNA和蛋白表达以及细胞增殖的影响。方法：取对数生长期的HO8910细胞，加入不同浓度(110-7、110-8、110-9、110-10mol/L)的17E2培养72?h后，收集细胞，分别采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术（RTPCR）和流式细胞术，检测KLK6 mRNA和蛋白表达水平的变化，同时采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术检测细胞增殖活力和增殖周期的变化。 结果：与乙醇对照组相比，不同浓度的17E2使得KLK6基因mRNA和蛋白的表达明显上升（P0.01），同时G0/G1期细胞百分率下降,S期和G2/M期细胞百分率升高, 细胞增殖活力增强。结论：17E2对KLK6 mRNA和蛋白的表达具有上调作用，同时能促进卵巢癌HO8910细胞的增殖。 【关键词】 卵巢肿瘤 组织激肽释放酶类 雌激素类 A Role of estrogen on the expression of KLK6 in the human ovarian cancer cell line HO8910 ABSTRACT Objective： To investigate the effects of estrogen on the expression of KLK6 mRNA and protein in the human ovarian cancer cell line HO8910. Methods: HO8910 cells were incubated with 17βE2 at different concentration (1×10-7, 1×10-8, 1×10-9 and 1×10-10mol/L) for 72 hours. Then the expression levels of KLK6 mRNA and protein were measured by realtime fluorensence quantitive RTPCR and flow cytometry, respectively. Cell proliferation was measured by 3 (4, 5dimethylthiazolzyl)2, 5dipheny tetrazolium blue (MTT) colorimetric assay, and the cell cycle was detected by flow cytometry. Results: Compared with the ethanol controls, the expression of KLK6 mRNA and protein in the HO8910 cell line accompanied by different concentrations of 17βE2 increased (P0.01 ) and the cell proliferation increased significantly， also the cell percentage of the G0/G1 phase decreased and that of the S phase and the G2/M phase increased. Conclusion: Estrogen upregulates the expression of KLK6 mRNA and protein and stimulates HO8910 cell proliferation. KEY WORDS Ovarian neoplasms; Tissue kallikreins; Estrogens 人组织型激肽释放酶基因家族（kallikrein， KLK）位于人染色体19q13.3 13.4区域之间，共包括15个成员，编码一组具有丝氨酸蛋白酶活性的人组织型激肽释放酶（human kallikrein，hK）。研究发现KLK基因家族各成员广泛表达于人体各种组织，在多种肿瘤中表达异常，是一类颇具潜力的肿瘤标志家族1。研究表明，KLK基因及其编码的系列蛋白参与肿瘤细胞生长的调控、肿瘤血管的形成和胞外基质的重建，可促进或抑制肿瘤的浸润转移，有望成为临床肿瘤治疗的新靶点2。 KLK6是KLK基因家族成员之一，长约162?bp，编码的蛋白人组织性激肽释放酶6（human kallikrein 6，hK6）是由223个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶样活性。研究表明重组的hK6在体外能降解胞外基质蛋白，推测其可能在肿瘤的浸润中起作用3，目前KLK6参与肿瘤发生发展的确切机理尚不清楚。鉴于KLK基因家族受类固醇激素调节的共同特点，本实验拟在建立检测KLK6 mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶(RTPCR)链反应的基础上，探讨17β雌二醇（17βE2）对雌激素受体阳性的人卵巢癌HO8910细胞株中KLK6基因表达的调节作用，旨在阐明KLK6基因的功能及其在肿瘤发生发展中的作用。 1 材料与方法 1.1 试剂与材料 人卵巢癌HO8910细胞株购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。17βE2购自美国Sigma公司，RPMI1640培养基干粉为美国Gibico公司产品，RNA抽提试剂盒购自美国Invirtrogen公司，KLK6和GAPDH引物由上海博亚生物有限公司合成，逆转录试剂及Real Time RTPCR试剂均为大连Takara公司产品，10?000×SYBR Green I为美国Amresco产品,KLK6单克隆抗体（S2E2）购自英国Serotec公司，细胞固定和穿膜试剂为加拿大Caltag公司产品，MTT购自美国Sigma公司。 1.2 细胞培养 HO8910细胞株按常规方法培养于RPMI 1?640培养液中(含15%小牛血清，青霉素终浓度为100?U/ml、链霉素终浓度为100?μg/ml)，置于37?、含5%2温箱孵育，0.25%胰蛋白酶消化传代。17βE2用无水乙醇溶解，稀释成1×10-8、 1×10-7、 1×10-6、1×10-5mol/L，4?保存备用。取生长良好的HO8910细胞悬液（1×105个/ml，每孔2?ml）接种12孔细胞培养板。当细胞融合铺满30%时,在各孔中分别加入不同浓度的E2 20?μl，使其终浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L，每组各设3个复孔,继续培养72?h。 1.3 流式细胞仪检测HO8910细胞增殖周期的变化 将各孔细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，PBS洗涤后，取1×106个细胞与PI染色液（33?μg/ml PI, 0.13?mg/ml Rnase A, 10?mmol/l EDTA, 0.5%Triton X100）室温孵育20?min。FAScan检测DNAPI荧光强度。结果分析采用ModFit软件。 1.4 实时荧光定量PCR检测HO8910细胞中KLK6 mRNA表达 1.4.1 细胞总RNA的提取 将上述12孔板各孔中的培养液彻底吸净后,每孔加入500?μl Trizol裂解细胞,RNA提取按说明书的一步法进行。所得总RNA质量和浓度通过0.7%甲醛琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计鉴定分析。取A260/A280比值在1.81 2.00之间, RNA电泳28?和18?两条带密度值比约为21的RNA样品用于后续实验。RNA样品置于-70?冰箱保存。 1.4.2 引物设计 登陆GenBank获取KLK6mRNA序列(KLK6 mRNA:D78203)，采用软件Primer Premier 5.0设计特异性引物，并使上下游引物跨越2个内含子，以避免基因组DNA污染。GAPDH引物设计参考文献4。KLK6：上游引物5′TTCCTGCCAGGGTGATTCT3′，下游引物5′CACTTGGCCTGAATGGTTTT3′，片段长162?bp；GAPDH：上游引物5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，片段长度220?bp。 1.4.3 KLK6 mRNA表达水平的检测 采用荧光定量逆转录PCR。 逆转录反应时取总RNA 2?μg，20?μl反应体系中包括：MgCl2 5?mmol/L，dNTP 1?mmol/L，RNase inhibitor16U，AMV RTase XL 2U，Oligo dT Primer 20?pmol。反应条件为：30? 10?min，42? 40?min,95? 5?min，5? 5?min。实时荧光定量PCR时，20?μl体系包括：TaKaRa 2×Real time Master Mix 10?μl，40×SYBR 0.5?μl，500?nmol/L KLK6或GAPDH引物，cDNA 1?μl。反应条件为95? 5?min变性；95?10?s, 56?10?s，72?30?s，84?0?s, 40个循环，84?单次检测荧光，增益为62，扩增完毕后，进行熔解曲线分析，94? 1?min, 61? 1?min, 72? 1?min，然后以0.1?/s的速度升温到92?，连续监测荧光。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。采用样点拟合法分析结果得到标本中KLK6和GAPDH的阈值循环数(threshold cycle, Ct)值。利用检测到的Ct值，以GAPDH mRNA的量为内参照，计算KLK6 mRNA的相对量，计算公式5：2Ct(GAPDH)-Ct(KLK6)。 1.5 流式细胞仪检测HO8910细胞中hK6蛋白的表达 将孔中细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，PBS洗涤，加入100?μl试剂A（固定剂），室温避光孵育15?min，用PBS洗涤，1?500?r/min离心5?min，将沉淀细胞混匀，加入100?μl试剂B（穿膜试剂）和150倍稀释的hK6单抗10?μl，室温避光孵育30?min，离心, PBS（含5%小牛血清）洗涤后，向沉淀细胞中加入FITC标记的羊抗鼠IgG（H+L）10?μl，室温避光孵育30?min。PBS（含5%小牛血清）洗涤2遍后，用FAScan检测。用平均荧光强度（average fluorescence intensity，AFI）表示hK6蛋白表达量。 1.6 MTT检测细胞增殖活力变化 0.25胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含8胎牛血清的RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液后以每孔0.2?ml接种于96孔培养板中，每孔细胞数约3×103个。待各孔细胞基本融合后，分别加入不同浓度的17βE2 2?μl，使得终浓度分别为1×10-10、 1×10-9、 1×10-8、1×10-7mol/L。每组各设5个复孔，继续培养72?h。每孔加入MTT溶液(5?mgm1)20?μl，37?，继续孵育4?h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，加入150?μl DMSO至各孔，振荡10?min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定各孔在570?nm的光吸收值，记录结果。 1.7 统计学处理 结果以s表示,采用SPSS10.0统计软件行方差分析，并进行两两比较。 2 结 果 2.1 KLK6 mRNA 表达水平荧光定量RTPCR检测方法的鉴定 KLK6和GAPDH mRNA扩增熔解曲线显示单一熔解峰，扩增片段经2%琼脂糖凝胶电泳，与理论大小一致(图1)。扩增片段连接到pGEMT easy载体后测序，测序结果（图2）用BLAST与基因库比较，序列完全一致。 2.2 17βE2对HO8910细胞增殖周期的影响 见表1。表1 17βE2对HO8910细胞周期的影响由表1可见,经不同浓度17βE2作用72?h后, HO8910细胞G0/G1期细胞百分率降低,S期和G2/M期细胞百分率增高。 2.3 17βE2对HO8910细胞KLK6 mRNA和蛋白的表达水平的影响 见表2。 经不同浓度的17βE2作用后,与乙醇对照组相比，HO8910细胞中KLK6mRNA的表达相对含量显著升高（P0.01），流式细胞术检测的代表hK6含量的AFI也显著升高（P0.01）。表2 17βE2对HO8910细胞KLK6 mRNA和蛋白表达的调节表3 不同浓度E2作用后的吸光值(吸光值乙醇对照组0.459?30.063?81×10-101×10-91×10-81×10-7 由表3可见，不同浓度的17βE2作用72?h后，与乙醇对照组相比，HO8910细胞吸光值明显增加，细胞增殖活力明显增强（P0.01）。 3 讨 论 卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，由于发病机理尚未明确,目前患者治疗效果很差，死亡率居高不下。体外研究显示，雌孕激素对细胞内多种基因表达的调节是卵巢组织癌变的重要分子病理基础。研究发现，大多数KLK基因在甾体激素依赖性器官中表达，与类固醇激素调节密切相关。其中KLK6基因在卵巢、子宫、睾丸等激素依赖性器官的肿瘤中异常表达，与预后相关68；且联合检测患者血清hK6和CA125的水平将明显提高卵巢癌诊断的特异性（90）和敏感性（72）9。因此，进一步研究雌激素作用下KLK6基因的表达变化将对阐述卵巢癌的发病机制及评估KLK6在卵巢癌诊断和预后判断上的作用有着重大意义。 本实验研究中，经不同浓度（1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L）的17βE2作用于体外培养的卵巢癌HO8910细胞72?h后，实时荧光定量PCR技术检测发现，代表KLK6mRNA相对表达量的GAPDH和KLK6的Ct值之差逐渐增加，与乙醇对照组相比，差异有显著性意义（P0.01）；相应地，流式细胞术检测的代表hK6表达量的AFI也显著升高（P0.01）。Yousef等10在发现KLK6之初就观察到KLK6在乳腺癌BT474细胞系中的表达受雌激素、孕激素和雄激素的上调。有关KLK基因家族受类固醇激素调节的研究发现，KLK1KLK4基因启动子中存在激素反应元件（HRE），其他11个基因的启动子上均不存在功能性的HRE1。所以，KLK6基因的上调可能由于雌激素的间接调节，涉及到反式作用元件。 本研究结果表明，不同浓度的17βE2作用后，卵巢癌HO8910细胞G0/G1期细胞百分率下降,S期和G2/M期细胞百分率升高；同时MTT检测发现细胞的增殖活力增强