植病生防菌枯萎病生防菌哈茨木霉 (TRICHODERMA HARZIANUM)的.doc

时间就是金钱，效率就是生命！92分类号： 单位代码：10389密 级： 学号：1081711福建农林大学硕士学位论文植病生防菌枯萎病生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物学特性的研究研究及其对镰刀菌的抑制作用学 科 门 类：理学一级学科名称：生物学二级学科名称：微生物学研 究 方 向：应用微生物研 究 生：张衡宇指 导 教 师：吴刚 教授、博士 刘波 研究员、博士完 成 时 间：二0一一年四月 唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！Thesis for Masters Degree of Fujian Agriculture and Forestry UniversityStudies on the biological characteristics of Trichoderma harzianum as a biocontrol agent on and the restriction to Fusarium spp. as a biological agent against fusarium wilt diseaseDiscipline Field:SciencePrimary Discipline: Biology scienceSubordinate Discipline: MicrobiologyPostgraduate: Applied microbiologyCandidate: Zhang HengyuSupervisor: Prof. Dr. Wu GangProf. Res. Dr. Liu BoSubmitted time: April, 2011独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目 录中文摘要1Abstract2第一章 综 述11 哈茨木霉在植物病害防治中的应用12 哈茨木霉生防机理的研究进展22.1 抗生作用22.2 竞争作用和重寄生作用22.3 可诱导植物对病菌的抗性33 哈茨木霉的生物学研究33.1 营养条件33.2 培养条件44 哈茨木霉的脂肪酸生态学45 木霉的绿色荧光蛋白标记研究55.1 绿色荧光蛋白的研究55.2 木霉的绿色荧光蛋白标记和应用66 PLFA法在微生物群落结构研究中的应用6第二章 哈茨木霉的分离、筛选与鉴定8引言81 材料与方法81.1 材料81.2 方法82 结果与分析92.1 土壤标本中木霉菌的分离92.2 枯萎病生防功能木霉菌初步筛选92.3 木霉菌的形态学及ITS鉴定103 讨论11第三章 哈茨木霉的生物学特性12引言121 材料与方法121.1 试验材料121.2 试验方法122 结果与分析142.1 不同营养对FJAT-9040菌丝生长和产孢量的影响142.2 培养时间对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响202.3 接种量对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响202.4 温度对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响202.5 初始pH值对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响212.6 哈茨木霉FJAT-9040最适抑菌条件研究213 讨论23第四章 哈茨木霉的脂肪酸生态学特性25引言251 材料与方法251.1 试验材料251.2 试验方法252 结果与分析272.1 哈茨木霉脂肪酸特征指纹图谱构建272.2 营养条件对哈茨木霉菌脂肪酸的影响282.3 不同处理哈茨木霉脂肪酸生物标记的检测312.4 不同处理间哈茨木霉脂肪酸生物标记的分布特性分析322.5 不同处理脂肪酸生物标记多样性指数比较343 讨论35第五章 哈茨木霉对尖孢镰刀菌的抑制作用37引言371 材料与方法371.1 试验材料371.2 试验方法372 结果与分析382.1 平板对峙法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果382.2 抑菌圈法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果392.3 显微镜下观察FJAT-9040对枯萎病病原菌菌丝生长的影响403讨论41第六章 哈茨木霉的GFP基因转导及转化子生物学特性43引言431 材料与方法431.1 试验材料431.2 试验方法442 结果与分析462.1哈茨木霉遗传转化体系的建立462.2 转gfp菌株FJAT-9295与FJAT-9040 的生物学性质的比较483. 讨论51第七章 哈茨木霉在不同土壤中定殖特性53引言531 材料与方法531.1试验材料531.2试验方法532 结果与分析532.1 哈茨木霉转化子FJAT-9295在不同类型土壤中的定殖532.2 哈茨木霉转化子FJAT-9295在有无植株的土壤中定殖随时间变化情况543 讨论55第八章 哈茨木霉对土壤微生物群落结构影响57引言571 材料与方法571.1试验材料571.2试验方法572 结果与分析582.1.1 FJAT-9295对不同土壤中脂肪酸标记总量和种类的影响583 讨论61第九章 结论与展望62致 谢68中文摘要3Abstract4第一章 综 述51.哈茨木霉在植物病害防治中的应用52哈茨木霉生防机理的研究进展62.1 抗生作用62.2 竞争作用和重寄生作用62.3 可诱导植物对病菌的抗性73哈茨木霉的生物学研究73.1营养条件73.2 培养条件84 木霉的绿色荧光蛋白标记研究94.1 绿色荧光蛋白的研究94.2 木霉的绿色荧光蛋白标记和应用95PLFA法在土壤微生物群落结构的应用10第二章 哈茨木霉的分离、筛选与鉴定120引言121 材料与方法121.1 材料121.2 方法122.结果与分析132.1 土壤标本中木霉菌的分离132.2 生防功能木霉菌初步筛选142.3 木霉菌的形态学及ITS鉴定143 讨论16第三章 哈茨木霉对不同枯萎病原菌抑制作用的测定17引言171 材料与方法171.1 试验材料171.2 试验方法172 结果与分析182.1平板对峙法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果182.2 抑菌圈法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果202.3 显微镜下观察FJAT-9040对枯萎病病原菌菌丝生长的影响213讨论22第四章 哈茨木霉的生物学特性23引言231 材料与方法231.1 试验材料231.2 试验方法232 结果与分析252.2 培养时间对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响332.3 接菌量对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响332.4 温度对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响342.5 pH值对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响342.6 哈茨木霉FJAT-9040最适抑菌条件研究353 讨论37第五章 哈茨木霉FJAT-9040转gfp基因菌株的构建39引言391 材料与方法391.1 试验材料391.2 试验方法402 结果与分析422.1哈茨木霉FJAT-9040菌株gfp基因转化422.2 转gfp菌株FJAT-9295与FJAT-9040 的生物学性质的比较453.讨论48第六章 生防菌FJAT-9295在不同土壤中定殖特性及其对土壤微生物群落结构的影响50引言501.材料与方法501.1试验材料501.2试验方法502 结果与分析512.1 FJAT-9295不同土壤类型中FJAT-9295的定殖512.2 FJAT-9295在有无植株的土壤中定殖随时间变化情况522.3 PLFAs法FJAT-9295对土壤中微生物群落结构的影响：533 讨论57结 论60参考文献611211222333445566999991010101112131313131315152122222223252727272727292930333637384040404040414143444446464618181818181818181818181818181818181818中文摘要1Abstract2第一章 综 述11.哈茨木霉在植物病害防治中的应用12哈茨木霉生防机理的研究进展22.1 抗生作用22.2 竞争作用和重寄生作用22.3 可诱导植物对病菌的抗性33哈茨木霉的生物学研究33.1营养条件33.2 培养条件44 木霉的绿色荧光蛋白标记研究54.1 绿色荧光蛋白的研究54.2 木霉的绿色荧光蛋白标记和应用65PLFA法在微生物群落结构研究中的应用6第二章 哈茨木霉的分离、筛选与鉴定7引言71 材料与方法71.1 材料71.2 方法72.结果与分析72.1 土壤标本中木霉菌的分离72.2 枯萎病生防功能木霉菌初步筛选72.3 木霉菌的形态学及ITS鉴定73 讨论7第三章 哈茨木霉的生物学特性7引言71 材料与方法71.1 试验材料71.2 试验方法72 结果与分析72.1不同营养对FJAT-9040菌丝生长和产孢量的影响72.2 培养时间对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响72.3 接种量对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响72.4 温度对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响72.5 pH值对FJAT-9040菌丝生长和产孢的影响72.6 哈茨木霉FJAT-9040最适抑菌条件研究73 讨论7第四章 哈茨木霉的脂肪酸生态学7引言71 材料与方法71.1 试验材料71.2 试验方法72 结果与分析72.1哈茨木霉脂肪酸特征指纹图谱构建72.2 营养条件对哈茨木霉菌脂肪酸的影响72.3 不同处理哈茨木霉脂肪酸生物标记的检测72. 4 不同处理间哈茨木霉脂肪酸生物标记的分布特性分析72.5 不同处理脂肪酸生物标记多样性指数比较73 讨论7第五章 哈茨木霉对镰刀菌菌的抑制作用7引言71 材料与方法71.1 试验材料71.2 试验方法72 结果与分析72.1 平板对峙法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果72.2 抑菌圈法测定FJAT-9040对枯萎病病原菌的抑制效果72.3 显微镜下观察FJAT-9040对枯萎病病原菌菌丝生长的影响73讨论7第六章 哈茨木霉的绿色荣光蛋白标记及生物学特性研究7引言71 材料与方法71.1 试验材料71.2 试验方法72 结果与分析72.1哈茨木霉FJAT-9040菌株gfp基因转化72.2 转gfp菌株FJAT-9295与FJAT-9040 的生物学性质的比较73.讨论7第七章 生防菌FJAT-9295在不同土壤中定殖特性及其对土壤微生物群落结构的影响7引言71.材料与方法71.1试验材料71.2试验方法72 结果与分析72.1 FJAT-9295不同土壤类型中FJAT-9295的定殖72.2 FJAT-9295在有无植株的土壤中定殖随时间变化情况72.3 PLFAs法FJAT-9295对土壤中微生物群落结构的影响：73 讨论7结 论7致 谢7中文摘要木霉被认为是最有希望的生物防治因子，在植物病害生物防治中扮演着重要角色。哈茨木霉则是木霉属中研究应用最多的。本文从台湾地区不同市县的13份土壤标本中分离到一株对植物枯萎病镰刀菌有较强抑制作用的木霉生防菌，经鉴定为哈茨木霉，命名为FJAT-9040。本文测定了哈茨木霉菌株FJAT-9040对四株不同寄主的枯萎病原菌的抑制作用，研究了不同碳源、氮源、碳氮比、无机盐以及不同培养条件下，如培养时间、接种菌量、初始pH值、温度等对FJAT-9040菌丝生长和产孢量的影响，探讨了FJAT-9040菌丝生长及产孢与其菌体脂肪酸种类及含量的之间的相关性，测定了哈茨木霉菌株FJAT-9040对四株不同寄主的镰刀菌的抑制作用，构建了哈茨木霉的gpf基因遗传转化体系，成功的获得了一个gfp基因标记的哈茨木霉菌株，命名为FJAT-9295，将该菌株与野生型菌株的基本生学特性和抑菌能力进行比较，研究了该菌株在不同的土壤类型中的定殖特性及其对土壤微生物群落结构的影响，结果如下：采用平板对峙法和抑菌圈法测定了哈茨木霉菌株 FJAT-9040对四株枯萎病病原菌FJAT-136、FJAT-141、FJAT-282、FJAT-370的抑制作用，对峙3d时的抑制率分别为53%、50%、60%和61%，对峙培养7 d后其抑制率均在80%-90%之间。采用抑菌圈法测得，当镰刀菌孢子浓度为107数量级时，抑菌圈直径分别为16.00 mm、 27.9 mm、16.78 mm、14.54 mm。FJAT-9040的代谢液造成了镰刀菌菌丝发生扭曲、原生质膨大、浓缩、菌丝内出现大液泡等畸形。 FJAT-9040作用的抑菌主要是通过竞争和抗生作用得已实现。FJAT-9040的最佳碳源为葡萄糖、最适氮源为牛肉浸膏，尿素显著抑制FAJT-9040的生长，培养时要避免使用。碳氮比以3:1为最好，过多的氮对菌丝生长和产孢起抑制作用。无机盐对产孢影响显著，硫酸镁最适产孢，硫酸亚铁、硫酸锰次之，经正交优化确定FJAT-9040的最适固体培养基组成合为：葡萄糖18 g、NaNO3 16.6 g、 MnSO4 1g、KH2PO4 2 g、水1000mlmL。FJAT-9040的最佳培养条件为：培养3天最利于菌丝生长，4天产孢量最大，接种量以1%为最好；初始pH值为4-6时菌丝生长好，pH值为6-8时，产孢最大； 25为最适菌丝生长温度为，最佳产孢温度为30。不同的营养条件能够引起哈茨木霉脂肪酸种类和含量的改变，但四种主要脂肪酸的含量均表现为：C18:2 6,9c/18:0 ANTE C16:0 C18:19c C18:0。不同营养条件下的哈茨木霉经聚类分析聚成五个类群，结果表明不同类群的处理之间平均脂肪酸含量、种类、及主要脂肪酸的含量差异与哈茨木霉的菌丝生长及产孢情况具有一定的相关性。C18:26,9c/18:0 ANTE脂肪酸的含量在菌丝生长和产孢的过程中起重要作用。哈茨木霉菌株 FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040对四株枯萎病病原菌FJAT-136、FJAT-141、FJAT-282、FJAT-370抑制率均在80 %- 90%之间。当镰刀菌孢子浓度为107数量级时，抑菌圈直径分别为16.00 mm、 27.9 mm、16.78 mm、14.54 mm。FJAT-9040的代谢液造成了镰刀菌菌丝发生扭曲、原生质膨大、浓缩、菌丝内出现大液泡等畸形。FJAT-9040的抑菌作用主要是通过竞争和抗生作用得已实现。通过PEG-CaCl2介导的原生质体法构建了哈茨木霉的GFP遗传转化体系，成功地将携带潮霉素B抗性基因和gfp标记基因的质粒pCT74整合到哈茨木霉的染色体上，获得一株荧光强度高，遗传稳定的转化菌株FJAT-9295，其菌丝生长的生物量和产孢量与野生型相比略有降低，抑能力略有降低，但抑菌效果仍显著。采用gpf基因标记的FAJT-9295哈茨木霉菌株研究了在不同土壤中的定殖特性，结果表明，在不同类型的土壤中的定殖情况不同，定殖难易程度依次为沙土营养土黄土茄子土。木霉定殖的前15天，在有植株的情况下定殖数量显著高于无植株的，16天后这种优势力逐渐降低。FJAT-9295土壤在土壤中，32天后趋于稳定，数量约为105数量级。PLFAs 分析结果表明：FJAT-9295能够明显地抑制土壤中细菌、真菌、放线菌的生长，从而改变土壤的微生物群落结构。， 脂肪酸生物总量随FJAT-9295数量变化而变化，FAJT-9295已经成为土壤中的优势菌。关键词：哈茨木霉、生物学特性、绿色荧光蛋白、PLFAsAbstractA bio-control strain of strong inhibition to Fusarium spp. has been isolated from 13 soil samples in different counties in Taiwan, which has been identified as Ttrichoderma harzianum,named FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040. In the assay,effect of the different source of carbon, nitrogen, carbon nitrogen ratio, inorganic salt and different culture conditions such as training time, inoculation quantity, initial pH value, temperature on hypha growth and spore germination of FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 has been studied, and the relationship between hypha growth and spore germination and the sorts and the content of fatty acid of FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 has been discussed, and the gfp gene genetic transformation system has also been constructed ,obtained a srain of trichoderma harzianum with gfp gene marked,named FJAT-9295,and the colonization character of FJAT-9295 in defferent types of soil and its effects of soil microbial community structure,the results were as follows:The best carbon source for FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 was glucose, the optimum nitrogen source for FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 was beef extract, and the best carbon nitrogen ratio was 3:1, and the best orthogonal for spores germination was magnesium sulfate.By by orthogonal test optimization ,the optimal solid medium contmpositon for FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 were: glucose 18 g, MnSO4 NaNO3 16.6 g, 1 g, KH2PO4 2 g, water 1000 mlmL. the best cultivation condition for FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 were: the most suitable cultivating time for hypha growth was 3 days,4 days was the best time for spores germination;Initial pH value for 4 to 6 was good for hypha growth, pH value for 6 to 8, spored most; 25 was the optimal temperature for hypha growth, best temperature for spores germination was 30 .The sorts and contents of fatty acids change could be changed by different nutritional conditions,but the content of four main fatty acids are shown as C18:2 6,9c/18:0 ANTE C16:0 C18:19c C18:0.By clustering analysis the different nutrient condition of T.harzianem, five groups has been classified according to the fatty acids content, which demonstrated that the hypha growth and spores germination t.harzianem, has been correlative to the sorts and content of average fatty acids, and the content of main fatty acid . The content C18:2 6,9c/18:0 ANTE played an important role in the process of hypha growth and spores germination.The inhibition rate of the t.harzianum strain FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 against fusarium strain FJAT-141, FJAT-136, FJAT-282, FJAT-370, ranged from 80 % to 90 %. When the fusarium spore concentration of 107 magnitude, the diameter of inhibition zone were 16.00 mm, 16.78 mm, 27.9 mm, 14.54 mm. respectively. The metabolic liquid of FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040 caused a series deformites such as, the hypha distortions, protoplasm inflating, protoplasm concentrating, a large vacuoles occuring within htpha. FJAT-9040 Trichoderma harzianum FJAT-9040s bacteriostatic action have achieved mainly through competition and resistance.The GFP transformation system of t.harzianum was established mediated by PEG- CaC12,throuh which we integrated the plasmid pCT74 with amphotericin B resistance genes and GFP marker genes into the chromosome of t.harzianum successfully and acquired a transform strain FJAT-9295 with stability genetic and high fluorescence intensity.Compared to the wide type, the biomass of hypha growth and spores germination,were a little lower ,and the inhibition to fusaruim also decline dslightly, but its entifungal efficaly were still significantly effective.The colonization characteristics of transformants in different soils were studied, results showed that colonization situation is different according to different types of soil,the colonization order were: sandynutritional soileggplants soil loess.15 days after colonization,the number of FJAT-9295 in plant-exsiting treatment was significantly higher than the no plant-exsiting treatment, but later this advantage has gradually reduced, the quantity of FJAT-9295 in the soil became stable about 105 quantity until 32 days.The PLFAs analysis showed that FJAT-9295 could obviously restrain bacteria, fungi, actinomyces in soil and changed the microbial community structure of the soil.Keywords: Trichoderma harzianum; biological characteristics; GFP; PLFAs第一章 综 述木霉属Trichoderma(Pers.) Fr.属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类。是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，也见于植物残体及动物粪便上，从植物根围(rhizosphere)，叶围(phyllosphere)及种子、球茎表面经常可以分离到11。木霉被认为是最有希望的生物防治因子，在植物病害生物防治中扮演着重要角色，生防潜力也日益受到重视22。据统计，在全世界25个国家以及美国43个州的有关生物防治课题中，其中大约有34是关于木霉的。而木霉属中应用最多的为哈茨木霉(Trichoderma harziauum)，常用剂型为麦麸制剂33。目前，已知木霉属的9个种中，除了哈茨木霉外，另外常见的还有4种具有生防潜力，绿木霉(T.virid)、康氏木霉(T.korangii)、钩木霉(T.hamatum)和长枝木霉(T.longibrachiatum) 44。经过多年来对木霉菌的生防应用、木霉药剂的研究发以及木霉菌生防机理的研究，无论是在温室还在在田间应用都取得了积极的成果55。国外已经有商品化的木霉制剂问世，有美国的Topshield（哈茨木霉T-22菌株）66还有以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)77，该菌株经发酵、生产、加工成的25可湿性粉剂，对番茄、黄瓜和葡萄灰霉病(Botrytis cinerea)、白粉病(Sphaero thecafuliginea)、叶霉病(Cladosporium fulvum)、菌核病(Sclerotinia sclerotiorum ) 、霜霉病(Pseudopevonospora cubensis)等多种叶部病害具有显著的防治效果。该哈茨木霉制剂已迅速抢占了欧洲和北美市场，具有极大的商业价值和前景。 随着生产力的极大提高，科学技术的不断发展，仪器与设备的更新换代，研究技术和手段地日益提高，研究平台的日趋成熟，对人们研究木霉的研究提供了极大的便利。人们已经从各个方面对木霉进行了深入的研究，生物防治并有较大的突破，现就木霉的研究应用状况略作概述。1 哈茨木霉在植物病害防治中的应用 许多研究表明，哈茨木霉对许多植物的病害防治效果显著。西班牙Monte教授88用哈茨木霉和绿色木霉制成的混合制剂TUSAL来防治甜菜和园艺作物的真菌病害，取得了明显的效果，还获得了增产。李玉芳等（2007）99采用哈茨木霉T23、T158制成的含木霉孢子1109的生防菌制剂对麦冬、丹参、川芎中药材的根腐病防治试验，结果表明，哈茨木霉T23生物制剂对麦冬、丹参、川芎等中药材的根腐病防治效果均好，以施用7.5 kg/hm2剂量效果最佳，防治根腐病的效果分别达74.5%、71.2%及70.9% ，防效显著优于4.5 kg/hm2的5O%多菌灵粉农药。王慧中等（2000）1010采用哈茨木霉孢子悬浮液制得的含有108个/g的多效有机菌肥研究其白术白绢病的防治效果，结果表明多效有机菌肥中的有益真菌哈茨木霉仍然保持其拮抗活性，其对白术白绢病的防治效果高达77.6%。魏林等（2004）1111 采用哈茨木霉T2-16发酵产物浸种处理后，豇豆幼苗枯萎病的发病率为16.7%，极显著低于清水浸种处理的发病率(63.3%)。即使在人工接种病原菌的情况下，对枯萎病的相对防效仍然达到73.62%。刘任等（2003）1212 采用哈茨木霉T2菌株培养物防治辣椒立枯病、辣椒白绢病和辣椒疫病3种土传病害，实验表明：在自然盆栽条件下，T2菌株对辣椒立枯病的防治效果较好，高达85.9%，对辣椒白绢病和疫病的防效分别为74.3%和69.4%；在田间自然条件下，对辣椒立枯病、辣椒自绢病和辣椒疫病的防治效果分别为90.0%、81.2%和68.3%。杨春林等（2008）1313通过对经哈茨木霉Th-3孢子悬浮液叶面喷施处理30d后调查发现，对照、哈茨木霉、敌克松3个处理黄瓜枯萎病的发病率分别为10.3%、3.7%、2.7%。木霉对黄瓜枯萎病的相对防效达到64.5%，略低于95%敌克松可湿性粉剂防效的74.2%。Sivan1414从田间枯萎病患病棉花植株的根际分离筛选到哈茨木霉菌株T-35，可以有效地抑制棉花枯萎病菌。在温室试验中，在每公斤土壤中含有哈茨木霉菌分生孢21062107时，可以降低土壤中棉花枯萎病菌的群体数量，从而降低枯萎病的发病率。且该菌在土壤中可以连续存活3年并且可以增殖。李敏（2009）等1515 研究发现哈茨木霉Ts1菌株和多菌灵单独处理对水稻幼苗立枯病防效分别为64.83%和74.84%。而Ts1与多菌灵复合处理能显著将Ts1菌株和多菌灵的防效提高至82.25%。王艳丽等（2000）1616测定了哈茨木霉菌株Tc3扣NF9对水稻纹枯病的防治效果，研究结果表明，哈茨木霉菌株Tc3和NF9对水稻纹枯病均具有防治效果，最高防效分别为77.56%和83.09%。2 哈茨木霉生防机理的研究进展 早在1932年，Wdindling1717就发现木霉菌可以寄生于Rhizactonia Solani, Phytophthora sp., Pythium sp.和Rhizopus sp，而表现出生防作用。据不完全资料统计，木霉至少对18个属29种病原真菌在体外或体内有拮抗作用2, 182, 18。木霉菌对植物病原真菌的生防作用包括多种机制，一般认为至少存在以下几种作用：抗生作用、竞争和重寄生作用协同作用、可诱导植物对病菌的抗性等。2.1 抗生作用 有些木霉菌在整个代谢活动中会分泌产生一些抗菌物质，这些物质在对病原微生物的抑制作用中起着主要作用。通常拮抗菌产生的抗菌物质主要有两类，一类是大分子的抗菌蛋白和一些酶类，另一类则是抗生素等小分子的多糖物质。Brukner等（1993）1919从绿色木霉(Tviride)和长枝木霉(T1ongibrachiatum)中分离提纯了一组特殊的抗菌肽，分别为trichobrachin和trichovirin，并测定了其氨基酸序列。木霉在抗生过程中分沁产生的代谢物能够分解植物病原真菌的细胞壁或分泌葡萄糖苷酶等胞外酶来降解病原菌产生的毒素5，这些现象可能与几丁质酶、-1,3葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶密切相关5, 20, 215, 20, 21。陈列忠等（2007）2222对一株枸骨内生真菌哈茨木霉T.harzianum抗菌活性成分的分离、鉴定及其抗菌生物活性进行了研究。该真菌发酵液经乙酸乙酯萃取、正相硅胶和ODS-反相色谱分离纯化得到一单端孢霉烯化合物，经红外、质谱和核磁分析，鉴定为：4-乙酰基-12,13-环氧-9-单端孢霉烯(trichodermin)，首次从哈茨木霉菌代谢产物中分离出该化合物。Trichodermin对蕃茄早疫病和黄瓜立枯病痛原菌的离体抑制活性EC50值分别为3.35和3.59 mg/L；活体测定结果表明，在100 mg/L的剂量下对两种病的保护效果分别为97.8% 和98.1%，治疗效果为96.7% 和97.3%。2.2 竞争作用和重寄生作用 哈茨木霉生长速度快、繁殖能力强、适应性广、能迅速地利用据营养抢占空间，与病原真菌通过营养和空间的争夺来实现抑菌效果2323。高克祥（2002）等2424研究哈茨术霉T88菌株和深绿木霉T95菌株对立枯丝核菌、杨树烂皮病菌、杨树水泡溃疡病菌、苹果树腐烂病菌、贝伦格葡萄座腔菌梨生专化型的抑制作用，对峙培养2d后发现木霉与病原菌接触，覆盖或侵入病菌菌落，最后木霉菌布满整个培养皿，占领全部的营养空间，并在病菌菌落上大量产孢抑制其生长。陈方新等（2005）2525室内通过对峙培养法测定了在不同的温度处理下哈茨木霉TH-1对棉疫病茵PB-1、番茄枯萎病茵TF-5、棉花枯萎病茵WF-3、西瓜枯萎病茵SF-1和水稻恶苗病茵FF-2的拮抗作用，结果表明TH-1和病原菌在25和3O黑暗条件下分别培养2d和1d后，两者的菌丝即开始接触并包围或覆盖病原菌，使病原菌不再向前扩展，而哈茨木霉菌TH-1菌丝进一步扩展侵入病原菌菌落，最终覆满全皿，并产生大量绿色分生孢子。姚彬等（2009）2626报导了哈茨木霉对番茄灰霉病、叶霉病、枯萎病及褐斑病的抑制作用，对峙培养3 d后对峙培养3 d后，哈茨木霉与各病原真菌开始相交，随后哈茨木霉不断侵占各病原真菌的生长空间，或覆盖、或侵入各病原真菌的菌落，形成包围圈，抑制各病原真菌生长。显微镜下观察发现，哈茨木霉菌缠绕在灰霉病菌的菌丝上，与枯萎和叶霉病菌的茵丝平行生长、产生附着枝结构附着于病原真菌菌丝上，穿透褐斑病菌茵丝使其菌丝发生断裂。2.3 可诱导植物对病菌的抗性木霉还可诱导植物产生抗性。国内外早期研究木霉菌生防机制时的主要集中在木霉菌本本身与病原微生物之间的相互作用，而忽视了木霉对寄主植物本身的作用。近年来，有研究表明，诱导植物抗性也是木霉菌生防的一个重要机制之一，尽管关于木霉直接诱导植物抗性的报导不多，但仍引起了人们极大的兴趣和关注。诱导抗性是指通过激活植物本身的防御系统而使植物能够抵御病虫害的过程。研究表明，木霉能直接和间接产生某些化合物，激发植物的防卫反应2727。Nzojiyobiri Jean-Berchmans等（2003）2828研究哈茨木霉NF9菌株诱导水稻幼苗对稻瘟病及白叶枯病的抗性时发现，经NF9菌株处理，接种稻瘟病菌SY1及H16孢子液，或接种白叶枯病菌CR1及CR7后，水稻幼苗均表现中抗，而未经木霉处理的对照均表现中感；而叶片中的过氧化物酶(POD)及苯丙氨酸转氨酶(PAL)活性增强，在某一时段显著高于未经木霉种子处理的对照。魏林等（2004）1111 用哈茨木霉T2-16发酵产物浸种处理后，豇豆幼苗枯萎病的发病率为1 6.7%，极显著低于清水浸种处理的发病率63.3%，即使在人工接种病原菌的情况下，对枯萎病的相对防效仍然达到73.62%；叶片中的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均增强，并在某一时段显著高于未经木霉代谢产物浸种的对照。杨勇等（2005）2929的研究表明，绿色木霉苗条TCS-1对小麦PAL、POD、PPO和几丁质酶有明显的激活作用，该菌株可使植物潜在的防御反应基因表达。此外，Bailey等（1998）3030的研究揭示了木霉菌的木聚糖酶或其它的激发子能够诱导植物的抗病性。3 哈茨木霉的生物学研究3.1 营养条件3.1.1 碳源哈茨木霉具有广泛的适应能力，能够吸收利用多种碳源进行自身的代谢活动。于晓丹等（2005）3131研究发现以蔗糖和果糖为碳源的培养基中T21的生物量显著高于以葡萄糖、麦芽糖和淀粉为碳源的培养基中的生物量，因此，他认为双糖更利于T21菌丝的生长。毛非鸿等（2007）3232报导了哈茨木霉H-13能够利用木糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖及纤维二糖生长和产孢，在8个碳源中木糖最利于菌丝生长，海藻糖最利于产孢，但不利于菌丝生长；单糖较利于菌丝生长，双糖较利于孢子生成。姚强等（2005）3333研究表明在使用21种可溶或不可溶的纤维性材料和一些糖类作为碳源的条件下进行液体培养时，哈茨木霉菌株SDU3.87在所有的简单碳源和复杂碳源的存在下都可以生长和产酶。这些碳源有纤维素CF-11、微晶纤维素、麸皮、麦草粉、淀粉、玉米粉、玉米秸秆、CMC-Na纤维二糖、木糖、菊糖、乳糖、半乳糖、棉子糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖。3.1.2 氮源 木霉菌也能够广泛地利用有机氮源和无机氮源。毛非鸿等（2007）3232认为哈茨木霉H-13能够利用硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、脲、丙氨酸、谷氨酸、硝酸钾、硝酸铵等氮源，但大多氮源菌丝生长无显著促进作用，有的甚至抑制，但有利用产孢。当木霉以碳水化合物作为碳源的时候，以氨盐形式的氮源往往优于硝酸盐类3434。于晓丹等（2005）3131研究发现酪蛋白、天冬酰胺、硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨这些不同氮源对拮抗木霉菌株T21生长的影响差异显著，生物量最高的氮源是蛋白胨；有机氮源比无机氮源更适于T21菌丝的生长。3.1.3 无机盐和微量元素磷酸盐和硫酸盐可以作为木霉生长繁殖所需必需元素磷元素和硫元素的来源，一些矿质元素如Mn、Mg、Cu、Zn、Mo、Ca、Fe、K与一些酶的活性密切相关，却在一定程度上影响着菌体的生长和代谢产物的形成。Auke等（1991）3535研究表明另T.pseudokoningii和T.longibrachiatum产生梭原素(fusigen)类型的鳌铁素，从而协助木霉从浓度很低的环境中吸收铁。Krystofova等（1995）3636研究发现钙离子能够影响木霉的菌丝生长和产孢，而木霉对钙离子的利用情况又与重金属离子有密切相关。陈小均等（2005）3737的研究表明，尿素、碳酸氢按和钙镁磷肥随着剂量越是增加，木霉菌丝生长和产孢的抑制作用就越明显；而钙、氯化钾、硫酸钾的剂量对木霉菌丝生长和产孢影