子宫内膜癌患者FHIT、SLIT2、EDNRB基因杂合性丢失.doc

子宫内膜癌患者FHIT、SLIT2、EDNRB基因杂合性丢失【摘要】目的：探讨子宫内膜癌患者FHIT、SLIT2、EDNRB基因3个微卫星位点D3S1287、 D4S1593、D13S160杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH），以确定侯选的抑癌基因。方法：应用PCR变性 PAGE银染方法分别对35例子宫内膜癌患者癌组织及相对应的正常子宫内膜组织在FHIT、SLIT2、EDNRB基因3个微卫星位点D3S1287、D4S1593、D13S160 行LOH检测。结果：LOH总检出率为54.3%，D3S1287、D4S1593、D13S160位点分别为34.5%、20.5%、19.3%。FHIT、SLIT2、EDNRB基因的3个微卫星位点发生LOH率与子宫内膜癌手术-病理分期无明显相关性。结论：子宫内膜癌患者肿瘤组织在FHIT、SLIT2、及EDNRB基因的微卫星位点D3S1287、D4S1593、D13S160 均有LOH。FHIT、SLIT2及EDNRB基因为抑癌基因，其失活可能与子宫内膜癌的发生有关。 【关键词】 子宫内膜肿瘤 基因 FHIT 基因，SLIT2 基因，EDNRB 杂合性丢失 ABSTRACT Objective： To study the loss of heterozygosity(LOH) at FHIT, SLIT2 and EDNRB gene at microsatellite markers D3S1287, D4S1593, and D13S160 in endometrial carcinoma. Methods： Tumor tissues and relatively normal tissues of thirtyfive cases of endometrial carcinoma were examined by using PCRdenaturing PAGEsilver staining at microsatellite markers D3S1287, D4S1593, and D13S160. Results： The total LOH rate was 54.3%, and LOH rate of D3S1287, D4S1593, and D13S160 was 34.5%, 20.5%, and 19.3%, respectively. The LOH rate at FHIT, SLIT2, and EDNRB gene did not positively correlate with the stage of clinicalpathogensis in endometrial carcinoma. Conclusion： LOH exists at microsatellite markers of FHIT, SLIT2, and EDNRB gene in endometrial carcinoma, suggesting that FHIT, SLIT2, and EDNRB gene are tumor suppressor genes(TSGs) and the inactivity of TSGs maybe one of the reasons for carcinoma. KEY WORDS Endometrial neoplasms; Gene， FHIT； Gene， SLIT2； Gene， EDNRB； Loss of heterozygosity 子宫内膜癌是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一,近年其发病率呈上升趋势。研究表明，细胞癌变主要由遗传信息发生改变所致，其中抑癌基因的失活是导致实体肿瘤发生的最重要分子机制。抑癌基因的失活主要包括基因的缺失、突变、甲基化等，根据Knudson肿瘤形成的二次打击学说（twohits）1，目前对各染色体微卫星位点进行等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity LOH)的分析，已成为寻找潜在的侯选抑癌基因有效方法之一。 FHIT基因即脆弱性组氨酸三联体(fragile histidine triad)，定位于染色体3p14.2，现已在多种肿瘤中发现FHIT基因的异常，主要表现为染色体的缺失、插入、重排等2。SLIT2基因位于染色体4p15.2，研究表明，SLIT2及其受体的改变在肿瘤形成中起一定作用3。EDNRB基因即内皮素受体B(endothelin receptor B)定位于染色体13q22，它已被确认在多种肿瘤中有LOH发生4。本研究通过对35例子宫内膜癌患者癌组织及相对应的正常子宫内膜组织在FHIT、SLIT2、EDNRB基因所在的微卫星位点D3S1287、D4S1593、D13S160 进行LOH的分析，旨在探讨其作为侯选肿瘤抑癌基因在子宫内膜癌发病机制中的作用。 1 资料与方法 1.1 临床资料 选择山东大学齐鲁医院妇产科2000年1月 2003年12月收治的子宫内膜癌住院病例资料完整者共35例，均行手术治疗，所有患者术前均未行放化疗。按国际妇产科联盟（Federation Internationale de Gynecologie et d′Obstetrique FIGO）2000年标准，子宫内膜癌手术-病理分期：期24例，期6例，期 期5例。术中留取新鲜癌组织及正常内膜组织，冻存于-80?冰箱待测，对于晚期癌与正常组织不宜区分的，用术前静脉血代替。 1.2 方法 1.2.1 活检组织标本DNA抽取 将组织块剪碎、匀浆、蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，置于-20?冰箱保存。外周血标本离心后，提取白细胞部分进行DNA抽提。 1.2.2 活检组织DNA PCR扩增 从GeneBank数据库中选取3对微卫星位点D3S1287、D4S1593、D13S160 DNA序列，由TakaRa公司合成，香港中文大学病理科馈赠。各微卫星DNA标志编号、染色体定位、引物大小等信息数据详见表1。PCR反应体系为15?μl，其中DNA模板3?μl, 引物各0.75?μmol/L, 10×buffer 1.6?μl, MgCl2 1.2?mmol/L，DMSO 0.75?μl, dNTPs 100?μmol/L, TaqDNA聚含酶0.2?U。温度循环参数：94?预变性4?min后开始循环,94? 25?s,55? 45?s,72? 45?s，共30个循环，最后72?延伸10?min，4?保存。取5?μl PCR 产物在含EB的2%琼脂胶进行电泳,紫外灯下鉴定PCR扩增产物。 1.2.3 PCR扩增产物行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylanide gel eletrophoresis PAGE） 取5?μl PCR产物与3?μl上样缓冲液混匀,95?变性6?min,置于碎冰中骤冷，点样于6%变性PAG（含7?mol/L尿素），1?500?V电泳2 2.5?h。 1.2.4 凝胶银染 从电泳板上剥下凝胶，置10%乙酸脱色30?min，水洗2次，每次10?min，0.2%AgNO3（临用前加甲醛）染色30?min，加30?g Na2CO3, 200?μl硫代硫酸钠、甲醛1.5?ml显色,10%冰乙酸终止反应。 1.2.5 结果判断 当患者为某一多态性位点的杂合子时，相应正常对照组织的PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳图上表现为两条等位基因条带，可用于LOH分析。并将肿瘤细胞与相应的正常子宫内膜细胞DNA的PCR扩增产物在同一聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以便电泳图谱作LOH分析，银染显色固定后观察并用数码相机录像，以正常子宫内膜细胞DNA等位基因的条带密度为内对照，肿瘤细胞的一个等位基因的条带密度降低50%或更多，则评定为基因存在LOH（见图1）。1.3 统计学处理 采用SAS统计软件，不同基因的LOH的分布差异行χ2检验。单个微卫星DNA 位点在手术-病理分期分布差异采用四格表确切概率法检验。 2 结 果 2.1 子宫内膜癌组织FHIT、SLIT2及EDNRB基因LOH 对FHIT、SLIT2及EDNRB基因中3个微卫星位点D3S1287、D4S1593、D13S160杂合性丢失分析结果显示，35例子宫内膜癌患者癌组织中3个微卫星位点存在1个以上LOH的检出率为54.3%（19/35），有5例存在两个位点的丢失，1例存在3个位点的丢失。其中以 FHIT基因的LOH率为最高（见表2）。3个基因微卫星位点间的LOH率相比差异无统计学意义（χ2 =2.643?4,P0.05）。对相对应的正常子宫内膜组织进行的LOH检测，仅在FHIT基因D3S1287位点有2例出现LOH，在其它两个基因的两个位点均未检测到LOH。 2.2 FHIT、SLIT2及EDNRB基因LOH与子宫内膜癌手术-病理分期的关系 见表3。由表3可见，3个基因所在的微卫星位点在期与 期子宫内膜癌患者中LOH率差异无统计学意义（P0.05）。 染色体位置LOH/有效信息例数*D3S12873p14.212/35(34.5)D4S15934p15.2D13S16013q22 P 37.5(9/24) 27.2(3/11) 0.05D4S1593 25.0(6/24) 10.0(1/10) 0.05D13S160 18.2(4/22) 20.0(2/10) 0.05 3 讨 论 早在1971年，Knudson提出肿瘤形成的二次打击学说。他认为家族型肿瘤患者的一对等位基因中，其中一个基因的突变是通过胚胎遗传的，第2个基因的突变是出生后自发或由致癌因素诱导发生，该基因的2个复制片段丢失是肿瘤发生的关键环节，这种基因就是抑癌基因1。根据这一理论，通过对肿瘤细胞LOH和HD的检测分析可确定染色体上存在的抑癌基因的位点。 目前在对子宫内膜癌基因组遗传不稳定性的研究中已发现在很多条染色体臂上有LOH的发生，Toda等5对60例子宫内膜癌中于染色体1p、8p、18q、10q 和17q中检测到20例发生LOH，发生率为33.3%; Fabjani等6在29例子宫内膜癌中于染色体1p、3p、8p共检出16例发生LOH，发生率为55%。本实验35例子宫内膜癌样本中，总LOH率为54.3%，在染色体3p、4p、13q分别为34.5%,20.5%，19.3%,提示这些染色体上含有在肿瘤发生过程中起重要作用的抑癌基因。其中D3S1287位点LOH率最高，可能与FHIT基因结构上含有脆弱性位点有关，脆弱性位点的DNA序列松散，对致癌物质敏感，易于断裂，使FHIT基因易受多种环境致癌因素诱导而产生重排2。本实验在该位点有2例相对正常的组织出现LOH，可能为正常组织向肿瘤过渡时期的改变。 EDNRB基因是在13号染色体上靠近RB1基因区域正在逐渐得到大家重视的一个基因，研究发现EDNRB基因在多种肿瘤中存在LOH或REP（复制错误），Sun等7对20例肝癌和8例肝内胆管癌研究表明，在D13S160 位点50%的肝癌发生RER，13%的肝内胆管癌发生LOH。本研究显示在子宫内膜癌中EDNRB基因在此位点LOH率为19.3%，高于肝内胆管癌发生率。对LOH的发生有学者认为在癌前病变或肿瘤的早期即有很明显的表现6，也有学者认为与肿瘤的病理分级相一致，且随着LOH的发生率增加肿瘤的恶性程度增高5。Hyytinen等4对前列腺癌研究中证实在肿瘤初期及转移期发生LOH率分别为56%、71%。但本研究中发现基因的杂合性缺失率与子宫内膜癌患者的手术-病理分期无相关性，这也可能与我们研究的例数少有关。 SLIT2基因位于染色体4p15.2，这一区域的许多微卫星位点在肿瘤中已发现显示LOH，其中间皮瘤LOH率为63%，小细胞肺癌为60%8。虽然目前对Slit2基因抑制肿瘤生长的具体机制不清，但Dallol等9，10对肺癌等肿瘤等位基因缺失的研究中同时发现存在该基因的高甲基化情况，提示在肿瘤细胞中SLIT2基因可能发生失活，这一结果与Knudson对于抑癌基因失活的理论是相符的。 本研究首次在子宫内膜癌组织中对EDNRB及SLIT2基因进行LOH的研究，结果提示其在子宫内膜癌组织中均存在LOH。本研究结果表明，FHIT、SLIT2、EDNRB基因可能是子宫内膜癌发生中的抑癌基因，在肿瘤的形成过程中，可同时发生多个抑癌基因的失活，失活越多，发生肿瘤的可能性越大。目前通过检测基因组等位基因的LOH，已成为寻找潜在抑癌基因的有效方法。但对抑癌基因LOH的检测能否成为子宫内膜癌的早期基因筛查指标，还需要进行大样本量的研究。【参考文献】 1Knudson AG. Hereditary cancer: two hits revisitedJ. J Cancer Res Clin Oncol, 1996, 122(3):135140. 2Huiping C, Jonasson JG,Agnarsson, BA, et al. Analysis of the fragile histidine triad (FHIT)gene in lobular breast cancerJ. Europeon Journal of Cancer,2000, 36(12):1?5521?557. 3Dallol A, Krex D, Hesson L, et al. Frequent epigenetic in activation of the SLIT2 gene in gliomasJ. Oncogene, 2003, 22(29):4?6114?616.4Hyytinen ER, Frierson HF, Boyd JC, et al. Three distinct regions of allelic lose at 13q14, 13q2122, and 13q33 in prostate cancerJ. Genes Chromosomes Cancer, 1999, 25(2):108114.5Toda T, Oku H, Khaskhely NM, et al. Analysis of microsatellite instability and loss of heterozygosity in uterine endometrial adenocarcinomaJ. Cancer Genetics and Cytogenetics, 2001, 126(2):120127.6Fabjani G, Kucera E, Schuster E, et al. Genetic alteration in endometrial hyperplasia and cancerJ. Cancer Letters, 2002, 175(2):205211. 7Sun HK, Chun HI, Kye CK, et al. Microsatellite alterations in hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarc