（模式识别与智能系统专业论文）皮升级定量注射系统研制.pdf

中图分类号： u d c ： 工5 o2 3 学校代码： 1 0 0 5 5 密级：公开 彘蕊犬淫 硕士学位论文 皮升级定量注射系统研制 t h ei m p l e m e n t a t i o no fp i c o l i t e r ss c a l eq u a n t i t a t i v ei n j e c t i o n s y s t e m 论文作者韭瞪照 申请学位王堂亟 学科专业槿式迟型量塑能丕统 答辩委员会主席 指导教师型堑麴援 培养单位筐星这盔型堂堂院 研究方向丝递佳扭墨厶 评阅人 南开大学研究生院 二。一。年五月 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文 ( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和 中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 l i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答 辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：i 匿蹬鸱 2 0 年月 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目皮升级定量注射系统研制 姓名张鹏鹏学号 2 1 2 0 0 7 0 2 7 9 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 7 日 论文类别博士口学历硕士硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所信息技术科学学院专业模式识别与智能系统 联系电话 2 3 5 0 8 2 9 6e m a i l z h a n g p p r o b o t n a n k a i e d u c n 通信地址( 邮编) ：天津市南开区卫津路9 4 号南开大学伯苓楼机器人所 备注：是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究 成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已 公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 丞鹏鹏2 0 1 0 年5 月3 1 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部 门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月 日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制- k2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 微注射技术是生物工程研究的重要手段，随着细胞微注射技术广泛应用，对 微注射量的可控性和精确性提出了较高的要求。本文以实现皮升级自动定量注 射为目的，提出了一种基于注射针管平衡压模型的定量注射方法，并完成注射 器的软硬件的研制，注射过程中采用缓慢变化压强曲线来实现定量注射，其注 射量精度可以达到皮升级。本文以针管微流体理论分析、系统构建和注射实验 验证为主线展开。 首先，针对基于皮升级定量注射需求，在对针管微流体进行动力学特性分析 的基础上，建立注射液面在平衡状态下的受力函数，通过理论分析和实验数据 验证了平衡压模型定量注射方法的可行性。 其次，根据微注射系统定量注射的性能要求进行系统构建，完成硬件平台设 计及控制方法实现。与通用微注射器不同的是，注射过程中采用缓慢变化压强 曲线( 线性压强模型、正弦压强模型及线性电机转角) 实现了皮升级定量注射 方法和基于液面位置的注射方法。 第三，在对注射临界喷射状态理论分析和实验验证的基础上，对常用的注射 实验环境进行了改进，通过基于液面位置的注射实验验证了这种注射方法的有 效性；并采用该方法完成了羊卵母细胞细胞质的抽取实验，达到了很好的效果； 皮升级定量注射实验部分通过建立针管的平衡压模型实现了皮升级定量注射， 并分析注射量精度影响因素，实验结果表明1 0 皮升以下的定量注射在合适的起 始液面位置其误差可以控制在1 皮升以内，定量注射的最小分辨率可以达到1 皮升以下。 关键词：定量注射平衡压模型表面张力p l 级 ab s t r a c t m i c r o i n j e c t i o nt e c h n i q u ei sa ni m p o r t a n tr e s e a r c hs u b j e c to f b i o l o g i c a l e n g i n e e r i n g , 而mt h ew i d e l ya p p l i c a t i o no fc e l lm i c r o i n j e c t i o nt e c h n i q u e ，t h e c o n t r o l l a b i l i t ya n da c c u r a c yo fm i c r o i n j e e t i o nv o l u m ep r e s e n t sah i g h e rr e q u i r e m e n t s t oa c h i e v ep i c o l i t e r ss e a m ，t h i sd i s s e r t a t i o np u t sf o r w a r dam i c r o i n j e c t i o nm e t h o d b a s e do ne q u i l i b r i u mp r e s s u r em o d e lo ft h eg l a s sm i c r o p i p a e c o m p a r e dw i t ht h e g e n e r a lm i c r o i n j e c t i o nc o n t r o l l e r ，t h ei n j e c t i o np r e s s u r et a k e ss l o w l yc h a n g ec u r v e i n s t e a do fp u l s ec u r v et oa c h i e v et h eq u a n t i t a t i v ei n j e c t i o n ，t h e i n j e c t i o nv o l u m e p r e c i s i o nr e a c h e sp i c o l i t e r ss c a l e t h et h e o r ya n a l y s i sa n dt h es y s t e mi m p l e m e n t a t i o n a n di n j e c t i o ne x p e r i m e n t si st h ep r i m a r yl i n eo f t h i sd i s s e r t a t i o n b a s e do n p i c o l i t e r s s c a l e d q u a n t i t a t i v ei n j e c t i o nd e m a n d ，t h ed y n a m i c c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o p i p e t t ea n a l y s i sa n dt h ef o r c ea n a l y s i sf u n c t i o no fl i q u i e d u n d e re q u i l i b r i u mp r e s s u r ew a se s t a b l i s h e di nt h i s d i s s e r t a t i o n t h r o u g ht h e o r e t i c a l a n a l y s i sa n de x p e r i m e n t a ld a t a ，t h eq u a n t i t a t i v ei n j e c t i o nm e t h o do fe q u i l i b r i u m p r e s s u r em o d e lh a sb e e nv e r i f i e dt h a tt h em e t h o di sf e a s i b l ea n de f f e c t i v e t h ed i s s e r t a t i o nc o m p l e t e dt h em i c r o i n j e c t i o ns y s t e md e s i g no ft h eh a r d w a r e p l a t f o r ma n dt h ec o n t r o lm e t h o dt oa c h i e v et h eq u a n t i t a t i v ei n j e c t i o n t h ei n j e c t i o n p r e s s u r et a k e ss l o w l yc h a n g ec u r v e ( t r i a n g l em o d e l ，s i n u s o i d a la n dt r a p e z o i d a lm o t o r r o t a t i o nm o d e l ) i nt h ei n j e c t i o np r o c e s s i nt h ee x p e r i m e n tp a r t , i a j e c t i o ne n v i r o n m e n th a db e e nc h a n g e dt oa v o i dt h e i n f l u e n c eo fs u r f a c et e n s i o n t h ed i s s e r t a t i o nc o m p l e t e dt h es h e e po o c y t cc y t o p l a s m e x t r a c t i o ne x p e r i m e n tu s i n gt h ei n j e c t i o nm e t h o do fs u r f a c el o c a t i o n ，g e tg o o dr e s u l t s h a db e e no b t a i n e d t h r o u g ht h eq u a n t i t a t i v ei n j e c t i o ne x p e r i m e n t ，t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ee r r o ro fi 坷e c f i o nv o l u m ei sl e s st h a n1 p i c o l i t e r sa n dt h e r e s o l u t i o ni sl e s st h a n1p i c o l i t e r s k e y w o r d ：q u a n t i t a t i v ei n j e c t i o n ，e q u i l i b r i u mp r e s s u r em o d e l ，s u r f a c et e n s i o n ， p i c o l i t e r s i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 1 i 第一章绪论1 第一节微注射技术概述1 第二节微注射技术研究现状3 第三节论文主要研究内容。6 1 3 1 论文研究内容。6 1 3 2 论文章节安排7 第二章注射针管微流量建模研究。9 第一节微流体动力学特性研究9 2 1 1 微流体主要影响因素9 2 1 2 针管微流体动力学特性分析1 1 第二节脉冲压强注射模型的不足1 5 第三节基于平衡压模型的定量注射方法一1 6 第三章皮升级定量注射系统硬件平台设计2 0 第一节微注射系统整体结构介绍2 0 第二节微注射系统气路结构2 1 3 2 1 微注射系统气路结构2 l 3 2 2 微注射系统气路工作原理2 2 第三节微注射系统硬件平台设计2 3 3 3 1 微注射系统硬件整体方案设计2 3 3 3 2 微注射器主控电路设计2 5 i i i 目录 3 3 3微注射器外围电路设计2 8 3 3 4 压强调节阀控制驱动电路3 l 第四章皮升级定量注射控制方法软件设计3 2 第一节微注射系统软件方案设计3 2 第二节皮升级注射控制方法3 3 4 2 1 基于液面位置的注射方法3 3 4 2 2 皮升级定量注射控制方法3 8 第三节微注射系统下位机软件设计4 l 4 3 1 微注射控制板主控程序设计4l 4 3 2u s b 程序设计4 6 4 3 3步进电机细分控制程序：。：j ：4 8 第五章皮升级定量注射系统实验研究。5 0 第一节注射实验条件改进5 1 5 1 1 空气环境中针管临界喷射状态分析5 l 5 1 2临界喷射状态实验验证5 2 5 1 3 实验条件改进5 7 第二节基于液面位置注射实验研究6 0 第三节皮升级定量微注射实验研究6 3 5 3 1 皮升级定量注射实验设计6 3 5 3 2 针管平衡压建模6 4 5 3 3 注射量精度实验分析6 5 5 3 4 注射量误差分析7 0 第四节羊卵母细胞细胞质抽取实验7 0 第六章结论与展望7 3 第一节结论7 3 第二节展望7 4 i v 7 5 致谢7 7 v 第一章绪论 第一节微注射技术概述 细胞微注射技术在细胞工程中，是一种外源物质导入细胞的方式，外源物质 导入细胞的方式还包括基因枪、精子介导、电击穿和电融合等，其中细胞微注 射是最先获得转基因动物的实验手段，具有较高的整合率、外源基因长度不受 限制、不含载体d n a 片段等优点，是细胞工程中最常见、应用最有效的细胞外 源物质导入技术【i j 。 细胞微注射技术，有些文献也称为细胞显微注射或显微注射，狭义上是指即 通过一定方式，利用微管或者微针将外源基因物质导入待注射细胞内部的过程。 广义上理解，细胞微注射即在高倍显微镜视野内，利用微操作机器人固定待注 射细胞及调整其注射姿态，将微注射针刺入细胞内部特定注射位置，注入适量 的外源基因物质，并培育出带有外源基因特征生物个体的综合性技术【2 j 。 微注射最早应用于将被注射物质包被于玻璃注射针头，并将其植入动植物细 胞中( b a r k e r1 9 1 1 ) 。随着生物技术的快速发展和生物操作设备的改进，细胞微 注射已经成为现代生物和医学研究的重要手段，尤其是在生物克隆和转基因实 验中，已经成为应用最广泛和最有效的方法。目前，定量微注射常用方法有如 下几种【3 】： 1 ) 包被针尖法 包被针尖法是指将针尖浸入到将要导入到细胞的物质溶液中，然后将浸蘸有 样品液体的微注射针刺入细胞，让样品液留在细胞质中。这种方法快速简单， 但对实际上要导入细胞中的样品量难以控制。 2 ) 被动注射法 在被动注射方法中，首先让微针中充满注射溶液，溶液的吸入是通过虹吸作 用来完成的，即将针管末端插入待注射溶液中使其针头充满溶液。然后将微针 刺入细胞中，样品被动流入细胞中。这种方法克服了包被针尖方法的一些缺点， 另外导入到细胞中的物质浓度是已知的，但注射量难以控制，这是由于注射时 间、位置以及导入样品进入细胞的速度是无法精确控制的。 第一章绪论 3 ) 直接压力法 直接压力法微注射是应用比较广泛的一种注射方法，它对大量的特异分子如 细胞骨架蛋白质是很有效的睁”，这种方法有两种不同的方式：一是恒定流动显 微注射方式，是将相对恒定量的物质导入到生长在玻璃器皿的细胞中，注射物 质的量主要取决于注射液中样品浓度、针尖刺入速度和针尖在细胞中停留的时 间。由于精确测定样品溶液流过针尖速度比较困难，因此想精确测定注射到细 胞的样品量是不可能的。第二种方式是脉冲流动微注射方式是当前应用最为广 泛的微量注射方法，其主要原理是通过压力控制装置导入可控脉冲气流来驱动 样品溶液注射到细胞中，施加在针管中样品溶液的脉冲气流的的压强和时间是 可控的，因此可以实现定量注射。 4 ) m e m s 微流体器件 除了上面几种微注射方法外，目前随着m e m s 技术的快速发展，利用硅的 光刻技术制造的如微泵、微阀等微流体器件组成的微流体系统实现了细胞微注 射，m e m s 微流体器件注射精度较高，但在针尖内孔直径在4 u m 以下时，微泵 产生不了足够的压力使样品溶液超越针尖的临界喷射状态，因此不能很好的适 应各类细胞注射需要，同时m e m s 器件成本较高，不能达到产业化要求1 6 j 。 图1 1 为细胞核质体注射到牛去核卵细胞中的过程，图a 注射前实验准备， 固定细胞及调整好注射姿态；图b 将注射针刺入卵细胞；图c 将体细胞核注射 到卵母细胞体内；图d 将注射针快速抽出。 图1 1 细胞核质体注射到牛去核卵细胞过程7 】 微注射技术是生物工程学科重要的研究手段，尤其在细胞核移植、胚胎工程、 染色体和转基因工程中有着广泛的应用，可以说，微注射技术在一定程度上影 2 技术广泛应用，也对实验设备的 难易操作程度以及微注射量控制精度等问题提出了较高要求。在细胞微注射中， 注射的量一般不超过细胞总体积的2 0 ，这就对微注射量的可控性和定量注射 的精确性提出了较高的要求瞵j 。 在细胞微注射操作过程中，对细胞会造成两方面的影响例：其一，注射针尖 会对细胞组织造成机械损伤；其二，微注射的剂量是否在细胞容忍的范围内。 第一个方面的影响取决于微注射针尖直径和注射时间，第二方面影响取决于注 射剂量体积的控制精度。e r n s t 等 1 0 1 曾使用1 - 4 u m 注射针对4 3 6 枚兔受精卵进行 微注射，产仔率仅为1 1 。中山医科大学实验动物中心的李智等【9 j 通过实验发现， 用0 5 u m 1 0 u m 微注射针向受精卵雄原核内注射1 - 4 p l 的溶液时，受精卵发育 8 1 6 细胞期的比率与对照组相近，之间没有明显差异性，且注射胚胎发育速度 与正常对照组基本同步，而是用相同规格的微注射针注射超过8 p l 和1 0 p l 剂量 后，细胞发育明显降低，特别是注射1 0 p l 后，所有注射胚胎在1 小时内死亡。 上述结果说明，当使用针尖直径在几微米级别的注射针注射时，注射针对细胞 的机构性损伤是有限的，基本上不影响细胞早期发育，而合适的注射剂量也不 会影响细胞的正常发育，此时导致细胞损伤和影响细胞发育的主要因素是微注 射剂量的大小。细胞本身是很脆弱的个体，当微注射剂量过小时，达不到目的， 注射剂量过大又容易超过细胞自身容忍量而使其胀破死亡。因此可以看出定量 微注射技术对于生物工程上的操作至关重要，也有较高的研究价值。 另外由于微注射操作对象是活的生物细胞，并且整个操作过程是在液体环境 下完成的，微注射操作容易受操作者熟练程度和周围环境的条件的影响，加大 了定量微注射的难度。 第二节微注射技术研究现状 关于微注射技术，从上世纪8 0 年代，国外科研机构就展开了细胞注射及其 相关技术等方面的研究工作，微注射技术通常和微操作平台结合起来，并充分 利用显微图像处理、智能控制和微细加工等技术，研制出能够完成细胞注射的 微操作平台【l l - 挖l 。这些用于完成细胞微注射的操作平台结构大致类似，在倒置显 微镜上安装两套机械式微调驱动机构，用来移动定位吸持针和注射针，操作者 可以通过显微镜上的目镜进行观察，也可通过安装在显微镜上的高分辨率摄像 3 第一章绪论 头采集细胞及注射针的图像，来控制完成注射。目前，微注射装置已经商品化， 像美国的s u t t e r 公司、德国e p p e n d o r f 和日本的成茂公司在细胞微注射领域都占 有较高的市场份额。 x e n o w o r k s 数字注射器是美国s u t t e r 公司最新型微注射器【1 3 】，如图1 2 所示， 该型微注射器跟目前主流微注射驱动方式一样，也是采用脉冲气压来驱动注射， 其结构简单，操作方便，具有两路独立气路通道，一路用作细胞吸持，另外一 路用作细胞注射驱动。具有两种注射模式，连续注射模式和脉冲型注射模式， 同时也具有远程操作界面。 图1 2x e n o w o r k s 数字微注射器 加拿大多伦多大学h a i b oh u a n g ，d o n gs u n 和j a m e sk m i l l s 开发了自动化微注 射系统【1 4 - 1 5 】，该系统将细胞放置在如图1 3 所示的细胞固定装置上，在微注射针 上安装聚偏氟乙烯微力传感器测量实时注射压力，并通过计算可实时控制注射 针深度方向的运动模式，该自动化微注射系统可以实现细胞注射的自动化，但 需要每次将待注射细胞放置在细胞固定装置的凹槽中，此外对不规则的贴壁细 胞操作不适用。 4 第一章绪论 图1 3 细胞固定装置 1 4 】 从九十年代开始，在国家8 6 3 计划和国家自然科学基金资助下，国内科研机 构开展了细胞注射和微操作技术研究工作，南开大学、北京航空航天大学、南 京理工大学、哈尔滨工业大学、中科院、广东工业大学等单位研制开发了用于 细胞操作或细胞注射的微操作机器人系统，并取得了不同程度进展。 南京理工大学微系统实验室研制了基于微流体数字化技术的微量注射器1 1 6 j ， 采用压电陶瓷的微位移特性和压电陶瓷可产生较大推力的特性，通过装有液体 的注射针容积的微小改变来实现微注射操作，注射量通过施加在压电陶瓷上的 电压进行控制，注射器结构图如图1 4 所示。 i 琏接轩2 晦瓷微位移嚣a3 过渡块4 调嬷螺控5 鹳瓷徽位移嚣b6 筒体 螺帽3 淬火钢球9 搏住缚膜l o 密封刚l i 腔体1 2 旋樱i ，i l l 融投i 匀缱 l 幸积封矮1 5 摊橱1 6 玻璃锻舒1 7 紧定螺钉 图1 4 注射器结构简图【1 6 】 南开大学机器人与信息自动化研究所于1 9 9 6 年开发出我国第一台微操作机 器人样机，该系统将显微视觉技术、高精度位移控制、多自由度轨迹规划等技 5 第一章绪论 术进行了集成，利用此样机成功完成了大豆染色体的切割。近几年，在第一台 样机的基础上，经过结构及系统的改进，又相继完成了n k t ym r 系列样机， 如图1 5 所示，并且成功完成了牛肺细胞( 贴壁细胞) 转基因注射实验。 图1 5 微操作机器人系统 本文设计的微注射系统，其实验操作都是在该微操作机器人上完成的，利用 微操作机器人左右臂完成注射前的细胞定位及注射针定位，另外利用微操作机 器人上的显微镜及c c d 系统完成注射过程中的录像，以便分析注射过程中针管 参数及针管流量等。 1 3 1 论文研究内容 第三节论文主要研究内容 目前常用的微注射器大多采用脉冲型压强气体驱动液体进行注射，这种脉冲 压强注射方法有两个方面的不足，一是注射量很难精确控制，定量注射重复性 较差。二是注射过程中并没有考虑注射液面所在位置对注射量的影响，不同注 射液面位置施加同样压强和时间会造成注射量相差很大。 基于通用微注射器定量注射的不足， 1 ) 对微注射针进行动力学特性分析， 6 本文主要研究内容有以下四个方面： 根据哈根泊肃叶公式，建立针管微流 第一章绪论 体动力学模型，并提出基于平衡压模型的定量注射方法及实现定量注射方法所 需要注射器性能指标。 2 ) 根据定量注射的性能指标完成微注射系统硬件平台设计，硬件部分包括主 控电路板和电机控制板两部分。 3 ) 基于平衡压模型，设计两种微注射方法，一是基于液面位置的注射方法， 这种方法是从当前液面位置缓慢增加压强驱动液面缓慢前移，当移动到合适位 置后，操作者停止压强变化使压强保持在当前平衡压，以使液面停止合适位置； 二是定量注射方法，微注射器根据注射量及当前液面位置，通过平衡压模型控 制注射压强缓慢增加使液面移动到合适位置，以达到定量注射目的。 4 ) 注射实验分为四部分内容，一是对常用的注射实验条件进行改进，验证空 气环境下针管末端表面张力的存在并提出相应改进方法；二是基于液面位置注 射方法实验验证；三是定量注射实验，建立针管平衡压模型，并分析注射量控 制精度及相应的影响因素；四是羊卵母细胞细胞质抽取实验，利用平衡压模型， 控制注射压强从较大数值缓慢减小，以完成细胞质抽取实验。 1 3 2 论文章节安排 本文以皮升级定量注射器的设计为主线，从注射针管微流体建模、硬件平台 设计、控制方法设计及软件实现到注射实验研究为论文整个流程，论文各章节 结构如图1 6 所示。 7 第一章绪论 图1 6 论文章节结构 控枣哮器 论文的章节安排如下： 第一章介绍微注射技术及定量注射的研究意义，从而引出本文主要解决的问 题和论文研究内容。 第二章通过注射过程中微流体动力学分析及哈根泊肃叶方程，建立注射针 管动力学模型，并基于脉冲型压强微注射器定量注射的不足，提出基于平衡压 模型的定量注射方法，并通过表面张力分析这种注射方法的可行性。 第三章根据定量注射的性能指标完成硬件整体方案设计，并介绍了气路结构 设计及硬件平台各模块的设计。 第四章详细分析了两种注射的控制方法及软件实现。 第五章为注射实验研究，实验分为4 个方面内容，一是对常用的注射环境进 行改进，对注射过程中针管末端表面张力进行了理论分析及实验验证；二是基 于液面位置的注射实验；三是针管平衡压模型求解实验及定量注射实验；四是 羊卵母细胞细胞质抽取实验。 第六章对本文工作进行总结，并提出进一步研究工作的设想。 8 笙三兰鲨塾竺笪垡鎏最建模研究 第二章注射针管微流体建模研究 第一节微流体动力学特性研究 2 1 1 微流体主要影响因素 微流体系统与宏观系统流动行为的差别主要表现在微尺度效应和介质连续 性假设，针管末端特征尺寸在微米级别，根据k n u d s e n 系数，针管内的微流体 属于连续介质范畴，所以针管微流体的主要影响因素是微尺度效应，不考虑这 里介质连续性假设。微尺度效应主要表现在两个方面【r 卜1 8 j ，一是当微流体流动 的特征尺度在微米数量级时，支配流体流动的各种作用力发生了变化，例如在 宏观系统中经常被忽略的表面作用力成为了微流体主要支配力，所以传统宏观 流体的研究方程在微流体流动中可能不再适用。二是微尺度范围内的管道表面 积与体积之比极大，因此使得微流体与宏观流体有很多不同的性质和表现，这 些被称作表面现象。在表面现象中，表面张力是影响比较大的一种力。 微注射针流体模型主要考虑的影响因素包括以下三个方面，表面张力、边界 层流及粘滞力。对于微流体主要影响因素的研究主要是在建立微注射针管流体 模型时将其主要影响因素考虑其中，消除这些影响因素或者修正常规宏观模型。 例如，表面张力是由液面水分子与周围气体分子吸引作用产生，由于针管末端 是在空气中的，这样微注射过程中，表面张力会产生很大影响，为了消除针管 末端表面张力对微注射的影响，改进注射实验测试条件，将实验在水中进行操 作，这样就大大减小了表面张力的影响，同时也使微注射环境更加接近真实细 胞注射环境。 1 ) 表面张力 当微流体的特征尺寸由宏观数量级别减d , n 微米数量级别，其表面积和体积 也随之减小，但表面积和体积衰减速率不同，即表面积与体积之比要远远大于 宏观情况下，当注射针管的直径较大时，液体的重力远远大于表面张力，所以 在分析受力平衡时，可以忽略表面张力的大小。但是当注射针管的直径只有微 米级时，表面张力的大小就不可以忽略。 9 第二章注射针管微流量建模研究 表面张力是由于液体表面水分子受到周围气体分子的吸引作用，向内部收缩 而产生的。表面张力的大小通常采用表面张力系数盯表示。表面张力在微米尺 度下的影响要远大于宏观情况下，以直圆管为例，圆管所产生的压力差为 p = 2 c r c o s 0 ，式中仃为水表面张力系数7 3 奉1 0 - 2 n m ，矽为液面与管壁形 成的角度，r 为圆管半径。当乡取o 度时，图2 1 为圆管径向压力与圆管直径的 关系，从图中可以看出当管径越小时，表面张力所产生的压力差越大【1 9 1 。 譬径a h , m 图2 1 压力差与管径关系【1 9 】 2 ) 边界层流 边界层流是由流动液体与管壁之间粘着力引起的。在宏观流体中，边界层引 起的流动对整个通道的总流动贡献很小，但是随着管道直径的减小，边界层流 的作用变的显著起来。当通道尺寸减小到微米数量级别时，边界层的厚度( 几 百纳米) 相对于通道直径已不可忽视 2 0 1 。 考虑到边界层的诱导效应和粘滞效应，微流道中半径为r 的流管处的流速可 以表示为： v ：孚( 尺2 1 2 ) ( 2 1 ) 4 t r 式中：r 代表管道半径尺寸，弋表液体黏性，p 代表液体两端的压力差，l 代 表所研究的流管的长度，r 代表所研究的流管的半径。 由上式可以看出液体的流动速度不仅与所施加的力有关，而且与管道尺寸有 关。在微量注射中，注射针管内的液体在注射压力的作用下，并不是以相同的 1 0 缄 鲰 鼽 椎 襁 锨 3 ) 粘滞力 雷诺数r e 用来描述流体流动状态的一个无量纲数，其值为惯性力和粘滞力 的比值：r e = p v d 1 ，式中：p 为密度，v 为流体速度，d 为特征长度，矽为黏 度系数。 雷诺数与特征长度d 成正比，因而在微尺度下，其数值都很小，也就是说微 尺度下的液体流动全部为层流，不存在湍流或紊流，而且，液体内部黏性力和 流体与外部接触界面上的作用力起主要作用。当表面张力和粘滞力的共同作用 与惯性力相比较足够大的时候，流体流动速度就会被衰减。在微注射中，由于 注射针管的直径只有微米级，液体内部相互作用的粘滞力与惯性力相比，其影 响不可以忽略，所以粘滞力也是微注射流体力学分析中不可忽略的因素。 2 1 2 针管微流体动力学特性分析 对于微流体的动力学研究，一些学者在常规宏观流体动力学的基础上根据微 流体诸多特性提出了修正模型，也有部分学者从实验数据出发建立相应的动力 学模型，但由于微流体运动非常复杂涉及到很多微尺寸效应，再加上微流体实 验设计、实验设备测量统计上存在很多方法上和精度上的问题，这就造成很多 实验结果问有很多矛盾，甚至是自相矛盾【2 1 - 2 2 1 。但是文献【2 3 1 中也指出不能因为 微流体实验中的特征参数与宏观下常规值的差异而一定怀疑宏观下微流体动力 学模型及修正模型在微流体动力学分析中的适用性。目前，关于微流体各项特 征参数还没有完全一致的量化结论1 2 4 j 。 2 1 2 1 微流体动力学建模方法 微流体动力学建模通常有两种途径，一种是将微流体视作连续介质模型，采 用宏观流体动力学的分析方法，根据质量守恒、动量守恒和能量守恒等定律建 立微流体动力学基本方程，这些方程的变量是流场中每一空间和时间点的速度、 密度及压力，这些方程通常都是非线性偏微分方程，如e u l c r 方程、n s 方程和 b u r n e t t 方程等【2 5 1 。第二种途径是采用分子集合模型，当微尺度足够小时，将微 流体直观的当做液体分子集合，通常采用确定性方法、统计学方法及场论方法 进行建模分析。此外，近几年介观模拟方法在微流体分析中也得到的一定的应 11 第二章注射针管微流量建模研究 用，这种介观模拟方法是介于连续介质模型和基于分子集合模型之间的一种建 模方法，目前广泛应用的格子气自动机、耗散粒子动力学以及介观动力学而等 粗粒化模拟方法在介观模拟方面更具有优势。 微流体动力学采用哪种途径进行建模取决于k n u d s e n 系数，k n u d s e n 系数是 指流体分子运动的平均自由程旯与流体流动的特征尺寸l ( 如管道直径，边界层 厚度、飞行体直径或长度) 之比【2 6 】。一般来说，在流体分析，一般认为当k n u d s e n 系数小于0 0 1 时，连续介质理论成立，可将流体当做连续介质模型进行分析， 在微注射中，水分子的自由程0 2 5 n m ，针管末端直径在微米级范畴，所以k n u d s e n 系数要远小于o 0 1 ，所以在针管微流体分析中可采用连续介质模型。在2 1 2 2 节先给出不可压缩圆管的哈根泊肃叶方程，在2 1 2 3 节由哈根泊肃叶方程推出 针管的流量方程。 2 1 2 2 哈根泊肃叶( h a g e n p o i s e u i l l e ) 方程 哈根泊肃叶流动是指由压强梯度驱动圆管的不可压缩粘性流体的流动，在 本文中，假定圆管内是充分发展的层流，且只是一维流动，即轴向流动。在等 径圆管层流流动中，在圆管轴线中心取一微小圆柱体作为研究对象，如图2 2 所 示，圆柱体轴与圆管轴线重合，圆管半径为r ，小圆柱体半径为r ，长度为l 。 图2 2 圆管流体受力分析 下面分析这个小圆柱体的受力情况，假定当微小圆柱体做是定常匀速流动， 在圆柱体两侧面受到的压强分别为p l 和p 2 ，对小圆柱体做受力分析，可得 万，2 ( a p 2 ) - 2 z ：r l r = 0 ( 2 2 ) 式中f 为层流摩擦系数，u 为流速，根据牛顿内摩擦定律有公式( 2 3 ) 1 9 究 ( 2 3 ) 石d u = 一壶( a p 2 一) ，= 一鱼2 1 t l ， ( 2 4 ) 万一瓦【a 一，一二厂 u 一 1 ) 速度分布 对公式( 2 4 ) 进行积分，可得到甜= 一尘4 u 生l ，2 + c ，常数c = 差r 2 ，由此可推出 圆管截面上各点的速度分布，见式( 2 5 ) 甜：鱼( r z 一，2 ) ( 2 5 ) 4 , u l 、 7 圆管上速度分布如图2 3 所示，圆管截面中心速度最快，随着离轴心距离增大， 其诔度递减。 图2 3 流体速度分布 2 ) 流量计算 在圆管截面任意一r 处，取一宽度为d r 的圆环，如图2 4 所示，当d r 足够 小时，可以认为圆环上各点速度相等，根据速度分布公式，可以得到微圆坏面 积d a 上的微小流量有式( 2 6 ) 砌= u d a = u 2 ，r r d r ( 2 6 ) 在整个截面上进行积分，得到流量公式为 13 第二章注射针管微流量建模研究 g = 亿= r 老( 尺2 _ r 2 坳砌= 羞卸 ( 2 7 ) 图2 4 截面流量求解 公式( 2 7 ) 就是著名的哈根泊肃叶( h a g e n - p o i s e u i l l e ) 公式，从公式中可以看 出，管道层流的体积流量与管道两侧压强压差和管道半径的四次方成正比，与 管道中液体长度l 成反比。 2 1 2 3 针管微流体动力学模型 本小节将哈根泊肃叶公式引入微注射针管流体分析中进行分析和推导，得 到微注射针体积流量公式。微注射针形状圆台，如图2 5 所示。 图2 5 微注射针模型 由于针管直径r 不是常数，将圆管体积流量公式中的r 替换为1 7 ，同时压力 梯度卸来等表示【2 4 1 ，其将公式尘d = t a n 伊( 軎) 带入，可得 1 4 第二章注射针管微流量建模研究 。万，4t a l l 伊d p g 2 1 函广石 ( 2 8 ) 午r z 一g r 4t a n 咖尝r l g 眨9 ， 则微针管体积流量公式为 g2码3ntan以pap眨1 0 )g2 t t( 2 8 三( 去一去) 公式( 2 1 0 ) 为微针管体积流量公式，但在求解过程中做了多次近似求解，并忽略 了很多微米尺度下影响因素，所以公式伫：l o ) 并不能作为定量注射的理论控制依 据，后面实验部分注射实验结果跟流量体积公式( 2 1 0 ) 也有较大差距。 第二节脉冲压强注射模型的不足 目前常用的微注射器大多采用脉冲型压强气体驱动液体进行注射，其操作过 程大致如下，首先根据注射量，大致设定好注射压强和注射时间，然后进行注 射，注射过程中驱动压强是一个恒值，注射完后关闭注射阀。这种脉冲压强注 射方法有两个方面的不足，一是注射量很难精确控制，定量注射重复性较差。 二是注射过程中并没有考虑注射液面所在位置对注射量的影响，不同注射液面 位置施加同样压强和时间会造成注射量相差很大。 由于针管形状近似圆锥，要是液面在不同位置保持平衡，需要施加的压强不 同，注射液面越是靠近针管末端，所需要保持平衡的注射压强越大。当采用脉 冲压强注射时，由于注射过程所施加的压强是恒定的，但注射出部分液体后， 液面位置会前移，此时需要保持平衡的压强要大于注射前保持平衡的压强，而 此时注射器的平衡压很难手动设置精确，所以会造成注射量的偏差。另外当注 射针管罩的注射液体较多和较少时，采用相同脉冲型压强进行注射，注射量相 差非常多，甚至会出现在针管液体较少时没有液体流出，这是因为液面在靠近 针管末端时，由于边界层流效应和粘滞力作用，所需要的驱动压强非常大。注 1 5 第二章注射针管微流量建模研究 射针管中液面所在位置是影响注射量的一个重要因素，这恰恰是脉冲型压强注 射器没有考虑的，这就使得脉冲型压强手动设置合适的平衡压非常困难，造成 注射量精度难以控制及重复性很差。 从以上原因可以看出脉冲型压强注射很难做到重复性较高的定量注射，尤其 在注射针管液体较少时，基于脉冲型压强注射的两点不足，本文提出了变化压 强注射方法，注射过程中，注射压强从当前平衡压强缓慢上升到定量注射后液 面需要保持平衡的压强，对于定量注射和基于液面位置的注射方法，压强变化 会可以采用压强线性曲线、正弦曲线和线性压强调节阀转角等方式，这就使得 注射量控制很精确，同时在不同的液面位置，注射器根据事前建立平衡压的模 型自动选择当前液面的平衡压强，这就使得保证了定量注射的重复性，使得注 射量尽量最小的受液面位置影响。 第三节基于平衡压模型的定量注射方法 平衡压是指保持液面在当前位置静止所需要的输入压强，若输入压强大于 当前位置的平衡压，注射液面会向前移动，注射针管末端会有液体流出；当输 入压强小于平衡压时，注射液面会向后移动，注射液体倒吸。 通过分析保持液面静止所需要的平衡压产生的原因及针管中液体的受力情 况，本文提出一种基于针管平衡压模型的定量注射方法。假定针管