（植物学专业论文）濒危植物缙云卫矛euonymus+chloranthoides的形态分化及遗传多样性研究.pdf

濒危植物绍云卫矛 西d 慢y 卅 jc h l o r a n t h o i d e sy a n g 的形态分化及遗传多样性研究 濒危植物缙云卫矛 e u o n y m u s c h l o r a n t h o i d e s y a n g 的形态分化及遗传多样性研究 学科专业 指导教师 植物学 何平教授 研究方向系统与进化植物学 研究生张桂萍 西南师范大学生命科学学院4 0 0 7 1 5 摘要 生物多样性的研究和保护是目前世界普遍关注的问题 它的研究重点之一是对珍 稀濒危物种保护生物学的研究 缙云卫矛 e u o n y m u s c h l o r a n t h o i d e sy a n g 为我国二级 保护植物 特产于重庆地区 笨文以处于濒危状态的缙云卫矛为研究对象 从物种生 物学及保护生物学的角度出发 从形态多样性和等位酶多样性二个层次水平对不同 生境下的缙云卫矛7 个居群9 1 个个体的2 4 项外部形态特征及五种等位酶 过氧化 酶p e r 细胞色素氧化酶c y t 超氧化物歧化酶s o d 酯酶e s 和淀粉酶a m y 结合数量统计方法 运用s p s s 程序 m i c r o s o re x c e l 程序及n t s y s p c 软件进行 了综合统计及多变量分析 试图通过其外部形态分化 内部遗传机制以及二者之 间的关系 进一步揭示该物种的致濒机理 为使该物种能够得以有效保护提供一 定的理论依据 盼析结果表明 就形态特征而言 方差分析 s p s s 程序 显示在所研究的2 4 个形态特征中5 1 1 7 表现出差异显著 其中4 5 8 3 表现出差异极显著 但这些差异仅在个体水平上有明显 表现 在居群水平上却表现出这些差异的无序性 在所研究的2 4 个形态特征中其差异显著程度依此表现为 营养器官的变异大于 繁殖器官的变异 营养器官中枝组性状的变异大于叶组性状的变异 繁殖器官中果柄 的变异大于种子的变异 在形态上 无论是运用s p s s 软件还是n t s y s p c 程序其聚类分析结果均与方差 分析结果基本吻合 即同一居群的个体并不是完全有序地聚在一起 而不同居群间的 个体却常常无序地归为一类 这反映出缙云卫矛在居群水平上没有明显 有规律可寻 教育部回国人员基金 濒危植物致濒机理 课题子课题 塑堡垫塑塑墨里歪堡 竺坐坚 鱼竺 堕 丝 翌 生竺堡查坌些墨垄堡兰壁丝型塞 一 的形态分化 也可以说缙云卫矛在形态上对微生境的适应性反应是较迟钝的 电泳结果的酶谱带图显示出缙云卫矛的所有居群都存在着一定数量的迁移率相 同的主要酶谱带 它们是p e rr f 0 4 0 s o dr f 0 6 1 a m yr f 0 7 4 和e sr f 0 8 1 占酶 谱带总数的2 9 7 3 表明7 个居群的缙云卫矛在遗传背景上具有一定的同源性 从所研究的五种等位酶分析可以初步显示出缙云卫矛的遗传多样性水平 即5 个酶系统共检测出酶谱带3 7 条 等位基因位点数1 8 个 其中多态位点数8 个 单态 位点数1 0 个 多态位点百分数p 4 4 4 4 平均每个位点的等位基因数a i 5 平 均期望杂台度髓 1 8 8 2 平均实际杂合度1 4 0 2 4 2 3 缙云卫矛不同居群间基因分化程度近似于其它双子叶植物的平均值 g s t 0 2 7 3 其基因分化系数g s t o 2 5 从遗传距离来看 七个居群中北温泉内的二个居 群之间基因分化程度相对较小 缙云山上的一个居群与其它居群之间的基因分化程度 相对较大 这种分化既可能是环境因子作用的结果 也可能是由于不同地域间基因流 阻断所致 在等位酶水平上 无论是二态数据矩阵还是等位基因频率的聚类分析结果均表 明 居群间的分化具有明显的规律性 即来自同一居群的个体在谱带上表现出一定的 相似性 彼此有规律地聚为一类 而来自不同居群的个体却表现出一定的趋异性 彼 此明显地划分为不同类群 特定居群具有某些特定的谱带 缙云卫矛不同居群间的分化在其外部形态与等位酶水平上所反应出的不同步现 象 究其原因推测可能是该植物对环境的反应比较迟钝 对生境的适应能力较差 形 态可塑性不强 这点可能是导致该物种濒临绝灭的原因之一 种子萌发实验表明 缙云卫矛的种子萌发力较差 说明其有性生殖能力较差 这点也可能是导致其濒危的原因之一 卜矿 关键词 濒危植物l缙云卫矛 形态分化l等位酶分析l 遗传多样性l数量分析 致濒机理 塑丝焦塑塑重墨至 垒 卫星竺坚 皇丝竺 生竺 塑塑 盟箜丝查坌些墨望笪兰竖丝堡壅 一 t h es t u d yo nm o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n t i a t i o na n d g e n e t i cd i v e r s i t y o f t h ee n d a n g e r e ds p e c i e se u o n y m u s c h l o r a n t h o i d e sy a n g m a j o r b o t a n y s p e c i a l i t y s y s t e m a t i c e v o l u t i o n a r yb o t a n y t u t o r p r o f h ep i n gg r a d u a t e z h a n gg u l p i n g a b s t r a c t t h es t u d yo nc o n s e r v a t i o no fb i o d i v e r s i t yi saw o r l d w i d ec o n c e m e dt o p i c o n eo f t h ek e y r e s e a r c hf i e l do fb i o d i v e r s i t yi st h es t u d yo nt h ec o n s e r v a t i o nb i o l o g yo ft h e r a r ea n d e n d a n g e r e ds p e c i e s o n e o fs u c hs p e c i e si s e u o n y m u sc h l o r a n t h o i d e sy a n gw h i c hi s t h e s e c o n dc l a s sp r o t e c t e de n d a n g e r e ds p e c i e sa n de n d e m i ct oc h o n g q i n g i np r e s e n tp a p e r f o l l o w i n g t h eb a s i cp r i n c i p l e so f b i o s y s t e m a t i c sa n dc o n s e r v a t i o nb i o l o g ya n d w i t l lt h e h e l po f t h es t a t i s t i c a la n a l y s i ss u c ha ss p s sa n dm u l t i v a r i a t ea n a l y s i sl i k en t s y s p c w es t u d i e dt h e d i f f e r e n t i a t i o np a t t e r n so f2 4m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n d5a l l o z y m e so f9 1i n d i v i d u a l s f r o m7p o p u l a t i o n si nt h ee n d a n g e r e ds p e c i e sec h l o r a n t h o i d e sy a n gi no r d e rt or e v e a li t s o u t e rm o r p h o l o g i cd i v e r g e n c ea n di n t e rg e n e t i cm e c h a n i s ma n dt h e i rr e l a t i o n s t os t u d yi t s e n d a n g e r e dm e c h a n i s m a n dt op r o v i d es o m et h e o r yb a s i sf o rg e n e t i cd i v e r s i t ys oa s t om a k e t h i ss p e c i e st ob ep r o t e c t e dv a l i d l y v a r i a n c e a n a l y s i s s h o w st h a tt h ed i f f e r e n c eo fm a n ys t u d i e dm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r s 51 17 i ss i g n i f i c a n ta m o n gi n d i v i d u a l s d i f f e r e n c e o f4 5 8 3 c h a r a c t e r se v e ns h o w e x t r e m e l ys i g n i f i c a n ta m o n gi n d i v i d u a l s t h e r ea r em o r em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c e sa m o n g i n d i v i d u a l s a n dl e s sd i f f e r e n c e sa m o n gp o p u l a t i o n s a m o n g t h e2 4m o r p h o l o g i cc h a r a c t e r sw e a n a l y z e d t h ev a r i a t i o no f t h ev e g e t a t i v eo r g a n s o fec h l o r a n t h o i d e si s s t r o n g e r t h a nt h a to ft h e r e p r o d u c t i v eo r g a n s a m o n g t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r so ft h e v e g e t a t i v eo r g a n s t h ev a r i a t i o ni nb r a n c hc h a r a c t e r si sm o r e s i g n i f i c a n tt h a nt h a ti nl e a v e sc h a r a c t e r s w h i l ea m o n g t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so ft h e r e p r o d u c t i v eo r g a n st h ev a r i a t i o ni nf r u i t si sm o r es i g n i f i c a n tt h a n t h a ti ns e e d s t h er e s u l tf r o mc l u s t e ra n a l y s i si sb a s i c a l l yi d e n t i c a lt ot h a to ft h ev a r i a n c ea n a l y s i s t h e i n d i v i d u a l si nt h es a m ep o p u l a t i o nn o ta l w a y sf a l lr e g u l a r l yi n t ot h es a m ec l u s t e r w h i l e t h o s eo f d i f f e r e n t p o p u l a t i o n so f t e n f a l li n t ot h es a m ec l u s t e r i r r e g u l a r l y t h ea n a l y s i so f5a u o z y m e ss h o wt h a tt h e r ea r es o m eb a n d s c a 2 9 7 3 w h i c ha r e 塑丝垫塑塑墨墨歪 垒 竺竺竺 垫竺 丝丝 整 堕堕丝查坌些墨垫堡童登堡堕塞 p e r m a n e n t t oa l lp o p u l a t i o n so fe c h o r 蔷h t h o i d e s i tp r o v e st h a tt h e 正c h l o r a n t h o i d e sp l a n t s f r o m7 p o p u l a i t o n sh a v e c e r t a i ng e n e t i ci d e n t i t yi n t e r p r e t e df r o mt h ei s o 玉y m eb a n d sa n a l y s i s w i t ht h ea n a l y s i so ft h es u d i e d5a l l o z y m e s w ec a r lg e tap r e l i m i n a r yu n d e r s t a n d i n go f t h eg e n e t i cs t r u c t u r eo ft h es p e c i e s t h ea l l o z y m eb a n d s a r e3 7w i t hl o c i1 8o fw h i c h8a r e p o l y m o r p h i ca n d1 0a r em o n o m o r p h i e t h ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cl o c i p i s4 4 4 w h i l em e a nn u m b e ro fa l l e l e sp e rl o c u s a i s1 5 t h em e a ne x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t yp e r l o c u s 皿 i s18 8 2 w h i l et h em e a n o b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t yp e rl o c u s 圮 i s2 4 2 3 t h eg e n e t i cd i v e r g e n c ew i t hb 7 o 2 5 2 a m o n gp o p u l a t i o n so f e c h l o r a n t h o i d e si sc l o s e t ot h ea v e r a g ev a l u e g s r o 2 7 3 o ft h a ti no t h e rd i c o t y l e d o n s i n t e r p r e t e df r o mt h eg e n e t i c d i s t a n c e 刚e i s 19 7 2 w e k n o wt h a tt h eg e n e t i cd i v e r g e n c e d 0 0 518 i sl o w e rb e t w e e n t h es t u d i e dp o p u l a t i o n sca n dd w h i l eh i g h e rb e t w e e nt h es t u d i e dp o p u l a t i o nga n do t h e r p o p u l a t i o n s i tm a y b et h er e s u l tf r o me n v i r o n m e n t a lf a c t o r s o rm a yb et h er e s u l tf r o mt h e i s o l a t i o no f g e n ef l o w b a s e do nt h et w o s t a t ed a t aa sw e l la st h em a t r i xo ft h ea l l e l ef e q u e n c y t h er e s u l to ft h e c l u s t e ra n a l y s e si n d i c a t et h ec l e a rd i v e r g e n c ea m o n g p o p u l a t i o n s i no t h e rw o r d s i n d i v i d u a l s f r o mt h es a l n ep o p u l a t i o na r es i m i l a ri na l l o z y m eb a n d sa n dc l u s t e rt o g e t h e rr e g u l a r l y w h i l e i n d i v i d u a l sf r o mt h ed i f f e r e n t p o p u l a t i o n s a r ed i s s i m i l a rl a r g e l yi na l l o z y m eb a n d sa n dc a nb e d i v i d e di n t od i f f e r e n tc l u s t e r sc l e a r l y t h ei n d i v i d u a l sf r o mag i v e np o p u l a t i o nh a v es o m e t m i q u ea l l o z y m e b a n d s t h ed i f f e r e n t i a t i o np a t t e r n sa m o n gp o p u l a t i o n so fec h l o r a n t h o i d e sr e f l e c t e da tt h e m o r p h o l o g i cl e v e ld i s a g r e e sw i t ht h a tr e f l e c t e da tt h ea u o z y m e l e v e l i tm a y o w n i n g t oi t s o u t e rm o r p h o i o g ys h o ww e a k a d a p t a t i o nt od i f f e r e n tm i c r o h a b i t a t s w h i l et h ed i f f c r e n t i a t i o n 0 na l l o z y m ei sm o r ea c t i v e i tm a yb eo n eo fc a u s e sw h i c hl e a dt ot h ee n d a n g e r i n go ft h i s s p e c i e s s e c o n d l y t h ep h e n o t y p i cv a r i a t i o ni sr e f l e c t e db yg e n ea n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r s i f t h ed i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nm i c r o h a b i t a t si sn o tn o t a b l e t h e r em a yb el i t t l e m o r p h o l o g i c v a r i a t i o n i na n o t h e r w o r d m o r p h o l o g i c v a r i a t i o ni sm o r ec o n s e r v a t i v et h a ng e n e t i cv a r i a t i o n t h e g e r m i n a t i o nt e s to f i t ss e e d ss h o w s t h a ts p r o u t i n g c a p a c i t yo f e c h l o r a n t h o i d e s i sr a t h e r l o w w h i c hm a y b et h es e c o n dr e a s o n sw h yt h i ss p e c i e sf a c e ss u r v i v a lp r o b l e m sa n di st e r m e d a sae n d a n g e r e d p l a n ts p e c i e s k e yw o r d s e n d a n g e r e dp l a n t e u o n y m u s c h l o r a n t h o i d e sy a n g m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n t i a t i o n a l l o z y m ea n a l y s i s g e n e t i cd i v e r s i t y n u m e r i c a la n a l y s i s e n d a n g e r i n g m e c h a n i s m 6 濒危植物缙云卫矛 勖口御 sc h l o r a n t h o i d e s 铀g 的形态分化及遗传多样性砸塞 一 前官 1 引言 生物多样性 b i o l o g i c a ld i v e r s i t y 简称b i o d i v e r s i t y 简单地说是生命有机体及 其借以存在的生态复合体的多样性和变异性 m c n e e l y 等 1 9 9 0 确切地说 是所有 生物种类 种内遗传变异和它们生存环境的总称 包括所有不同种类的动物 植 物和微生物 以及它们所拥有的基因 它们与生存环境所组成的生态系统 汪松 陈灵芝 1 9 9 0 s o l b r i g 把生物多样性简短地定义为 不同性质生命系统的不同的 不相似的属性 m a r t i n 1 9 9 6 生物多样性包括三个层次 即遗传多样性 物种 多样性及生态系统多样性 陈灵芝 1 9 9 3 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分 是物种多样性及生态系统多样性 的基础 它既是长期进化的产物 又是其生存和发展的前提 胡能书 万贤国 1 9 8 5 生物多样性归根到底是遗传多样性 也只有遗传的变异才能在时代间传递 才具有进化的意义 陈家宽 杨继 1 9 9 4 遗传变异是自然界普遍存在的生物现 象 正是这种变异导致生物在种群水平 个体水平 组织和细胞水平以及分子水 平 m o r i t z h i l l i s 1 9 9 0 等不同水平上体现出遗传多样性 由于种群是进化的基本 单位 s t e b b i n s 1 9 7 1 所以种群在自然界中特定的分布格局决定了遗传多样性不 仅包括遗传变异高低 也包括遗传变异分布格局 即种群的遗传结构 种群遗传 结构上的差异是遗传多样性的一个重要方面 遗传多样性的检测方法主要包括四 个方面 即形态多样性 染色体多样性 蛋白质多样性 和d n a 多样性 形态多 样性是检测遗传变异最古老也最简便易行的方法 尽管其结论没有分子生物学方 法精确 但也能很好地反应遗传变异的程度 而且对于理解物种的适应机制更为 直接 染色体多样性则主要是从染色体数目 组型及减数分裂时的行为进行研究 蛋白质多样性一般通过氨基酸序列和等位酶电泳两条途径进行分析 后者应用更 为广泛 d n a 多样性主要通过r p l f d n a 指纹 r a p d 和p c r 等技术进行分析 目前任何遗传多样性的检测方法都存在一定的优点和局限 所以还找不到一种完 全取代其他方法的技术 四个层次研究所提供的有价值的资料都有助于分析和认 识遗传多样性及其生物学意义 形态多样性虽然是检测遗传变异最古老 最简便易行的方法 而且其结论没 有分子生物学方法精确 但有数量统计学的辅助仍然能较好地衡量遗传变异程度 近代生物科学发展的两个显著特点就是定量化和动态化 杨持 1 9 9 6 生物统计 学是一门应用数学理论和电子计算机技术处理生物统计问题的边缘学科 它是本 世纪5 0 年代末期由英国微生物学家史尼斯 s h e a t h 和美国生物统计学家索卡尔 s o k a l 等在总结前人对定量分类方法的研究基础上创立的 数量分类学派认为 濒危植物缙云卫矛 o 哆删埘c 0 m n 曲o 抽y 帅g 的形态分化石毛垫传墨堂性塑堕 分类系统应当建立在被分类有机体的全面相似性基础上 全面相似性意味着在一 次分类中 所依据的特征越多越全面 则分类效果越好 钟扬 陈家宽 黄德世 1 9 9 0 数量分类学的优点是 其一 有综合多种来源数据的能力 这是用常规分 类学难以办到的 其次 分类过程的自动化使工作效能大为提高 褥者 由于方 法是定量的 因而能给出比由常规方法所能得到的更好的分类和检索 并且该学 科导致了若干生物学概念的重新解释 导致了新的生物学和进化问题的提出 等位酶电泳是检测蛋白质多样性的一种方法 自从m a r k e r t 和m o l l e r 于1 9 5 7 年首次提出同工酶这一概念之后 随着同工酶分离分析方法的进步 同工酶技术 很快成为在分子水平上研究生物现象的一项重要手段 胡能书 万贤国 1 9 8 5 它也是近3 0 年来现代生物进化论迅速发展的主要原因之一 王中仁 1 9 9 6 同 工酶标记受环境条件的影响不大 通常所检测的酶系统都和特定的亚细胞部位相 联系 具有重要和比较重要的代谢功能 其产生和分布都是很稳定的 避免了形 态学中出现的范围和功能相关之类的问题 因此 自从等位酶凝胶电泳被用于研 究植物天然居群的遗传变异以来 大大扩展了我们对种的遗传过程的认识 对居 群遗传学 系统和进化研究产生了巨大影响 因为它第一次用比较简单而直观的 方法识别出了大量的基因位点和每个位点的多态性 等位基因 并能把遗传变异 数量化 对遗传多样性进行研究的意义在于 1 可以揭示物种或种群的进化历史 起 源的时间 地点 方式 也能为进一步分析其进化潜力和未来的命运提供重要资 料 s o l t i s s o l t i s 1 9 9 1 尤其有助于物种濒危原因及过程的探讨 m i l l a r l i b b y 1 9 9 i 2 遗传多样性作为保护生物学研究的核心内容之一 对于保护计划的制 定是必不可少的依据 黄宏文 1 9 9 8 如对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定 都有赖于对物种遗传多样性的认识 本文从形态多样性和蛋白质多样性二个层次对缙云卫矛 ec h l o r a n t h o i d e s 在 不同生态环境下的7 个居群9 1 个个体的外部形态特征及等位酶谱带结合数量统计 方法 运用s p s s m a r i j aj n o r u s i s 卢纹岱 朱一力等 1 9 9 7 袁淑君 孟庆茂 1 9 9 5 m i c r o s o f te x c e l 统计软件及n t s y s p c 多变量分析程序 v e r s i o n1 8 r o l l 进行综合统计分析 试图揭示其外部形态分化 内部遗传机制以及二者之间的关 系 从而为进一步研究该物种的致濒机理及遗传多样性提供一定的理论依据 使 该物种能够得以有效保护 濒危植物缙云卫矛 口嚏朋蚶c h l o r a n t h o i d e sy 朋g 的形态分化及建堡墨堂壁婴壅 2 分类地位 缙云卫矛 e u o n y m u sc h l o r a n t h o i d e sy a n g 又名绿花卫矛或青对叶 隶属于卫矛 科 c e l a s t r a c e a e 卫 矛属 e u o n y m u sl i n n 卫矛亚属 s u b g e n e u o n y m u sb e c k 冬青叶组 s e c t 1 l i c i f o l i an a k a i 冬青叶系 s e r j a p o n i c ib l a k e l 为国家二级保护植物 王诗 云 1 9 9 5 据有关文献报道该物种仅发现于重庆北碚地区 张泽荣 1 9 8 8 实地考查发 现重庆统景镇东温泉公园内也有分布 3 一般特征 常绿直立灌木 高1 2 m 无毛 幼枝四方形 具显著的4 棱 淡绿色 密 被白色细小的瘤状突起 老枝淡褐色 园柱形 有时树皮剥裂 单叶对生 革质 椭园形或矩园状椭园形 长8 1 3 5 c m 宽2 5 5 c m 顶端渐尖或急骤渐尖 基部 楔形至钝形或近园形 边缘具锐尖硬锯齿 开展 骨质 上面鲜绿色 下面淡绿 色 侧脉7 9 对 纤细 上面的网状脉稍隆起 下砸显著凸起 网状脉密集 叶 柄极短或无 稀长可达l 一3m m 具细小瘸状突起 聚伞花序簇生叶腋或新枝顶 端 每花序通常具3 花 总花梗四方形 有4 棱 具淡白色细小瘤状突起 长l 一 2 5 c m 花梗长5 1 0 r a m 苞片钻形 长短不一 长1 4 5m m 花紫绿色 直径 约8 m m 5 数 花萼裂片半圆形 长约1 1 m m 宽约1 8 m m 花瓣倒卵形 基部 微爪状 长约3 m m 宽约2 m m 边缘具缺刻 雄蕊无花丝 花药黄色 花盘肉质 直径2 5 m m 子房陷于花盘内 微突起 蒴果黄绿色 近圆球形 直径约1 5 c m 5 室 每室l 颗种子 种子紫红色 近圆球形 直径约7 r a m 顶端有橙黄色假种 皮 花期8 9 月 果期1 1 月 该植物可利用根茎进行无性繁殖 缙云卫矛生长于林下 尤以竹林下居多 在所调查的7 个样地中 其中有5 个样地内的优势种为慈竹 除北温泉内的两个样地 该植物喜生于温暖潮湿的环 境 在所调查的7 个样地中 有6 个样地均位于温泉旁 其中北温泉4 个 东温 泉2 个 除此之外 笔者调查中还发现 缙云卫矛多生长在坡度较陡的l u 上 在 所调查的7 个样地中 其坡度均大于5 0 本种接近于同属的茶叶卫矛e t h e i f o l i u sw a l l 但叶片较大 椭园形或矩园状 椭园形 长8 一1 3 5 c m 宽2 5 5 c m 边缘具锐尖锯齿 聚伞花序通常具3 花 总 花梗四方形 花梗长5 1 0 m m 花紫绿色 5 数 直径约8 r a m 果实直径约1 5 c m 易于区别 9 濒危植物缙云卫矛 肌 嘎y m jc h l o r a n t h o i d e sy a n g 的形态分化及遗传多槌健研究 4 研究进展 关于卫矛属植物的研究据文献资料国内外都有一些报道 国内的例如 关于 卫矛属植物的分类学研究 顾哲明 1 9 9 1 任继文 1 9 9 6 关于卫矛属植物的解 剖学研究 高信曾 1 9 9 3 奇文清 1 9 9 4 关于卫矛属植物的生理学研究 陈钧 林 1 9 9 4 刘非燕 1 9 9 6 关于卫矛属植物的抗癌药物的研究 叶嗣颖 1 9 9 2 等 国外的例如 s t a s z k i e w i c a j e r z y 发表的 t h ev a r i a b i l i t yo f l e a v e so f e u o n y m u s e u r o p a e u sa n de u o n y m u sv e r r u c o s u s a n d t h ev a r i a b i l i t y o fs e e d so fe u o n y m u s e u r o p a e u sa n de u o n y m u sv e r r u c o s u s 19 9 7 及k i m j o o f l w a n b y o n g h e e c h o i y u ns h i k k i m 发表的 n u m e r i a lt a x o n o m yo f e u o n y m u sl i nk o r e a 1 9 9 7 等 这些研究都从 不同角度有针对性地对卫矛属的其它植物进行了分析探讨 但关于卫矛属植物缙 云卫矛的研究除邓洪平1 9 9 8 年发表的 濒危植物缙云卫矛的酯酶和超氧化物歧化 酶同工酶的变异数量分析 外 从笔者现已掌握的文献资料尚未见有其它报道 5 目的意义 缙云卫矛为濒危植物 并被列为国家二级保护植物 它的分布范围和数量已 非常有限 尤以缙云山后山更为明显 考察发现该区域仅有1 0 余株缙云卫矛 如 果适合该物种生存的非常有限的生境再度发生变化 则该物种会更加面临灭绝的 危机 为了深入研究该物种在不同生境下的形态分化 生态遗传分化及适应对策 本文对其7 个居群9 1 个个体的2 4 项外部形态特征进行了统计分析及多变量分析 并对其功能叶片进行酯酶 e s 超氧化物歧化酶 s o d 过氧化物酶 p e r 细胞色素氧化酶 c y t 和淀粉酶 a m y 的等位酶分析 根据其胶板谱带及其 r f 值 结合遗传杂合度 h e 遗传相似性系数 i 遗传距离 d 等参数 运 用数量统计方法进行聚类分析 以求揭示该物种的致濒机理 从而使该物种能更 好地得以有效的生存和发展 同时在此基础上提出相应的保护对策 为生物多样 性保护提供一定的理论依据 1 0 酶 i g 曲寸0 赫 濒危植物缙云卫矛 皿d p 榭 s c h l o r a n t h o i d e sy 锄g 的垄查坌些垦望堡童壁丝 堕 材料与方法 1 缙云卫矛的形态分化研究 1 1 野外调查及样地的确定 根据已有文献资料记载的关于缙云卫矛的地理分布概况 于1 9 9 9 年l l 一1 2 月问对缙云山及东温泉等地分别进行了实地考察 由于该物种现已处于濒危状况 现存的数量已不多 加之该物种的分布范围比较狭窄 这对样地的选取和材料的 采集带来一定难度 特别是统景东温泉和缙云山后山该种现存的数量更为稀少 因此在取材过程中样地的选取数量以及材料的选取数量只能根据具体情况而定 数量有限 经考察共确定七个样地9 1 株个体 其中北温泉公园内两个样地 每个 样地 居群 各选取1 5 株个体 北温泉公园外外山两个样地 每个样地 居群 各选取1 5 株个体 缙云山后山一个样地 该样地 居群 选取l l 株个体 统景东 温泉公园内两个样地 每个样地 居群 各选取1 0 株个体 各样地具体地点及部 分生境参数见表l 表1 七个样地的地貌特征概况 t a b l e1t h e g e n e r a lp a r a m e t e r so f 7s a m p l e dp o p u l a t i o n so f e c h l o r a n t h o i d e s b c d 北温泉公园 外山一2 北温泉公园 内一l 北温泉公园 内 0 e 东温泉公园一1 f东温泉公园 2 2 6 0 2 8 05 5 2 6 08 0 2 4 05 0 2 6 0 2 7 07 5 3 0 0 3 1 07 5 4 e 蛔慈望篓下 5 11 8 c m 岩石峭壁 5 02 5 c m灌木丛内 5 0 o c m 蕊至篓下 5 0 2 0 c m 慈鐾下 1 2 测量工具 游标卡尺 量角器 直尺 解剖镜 电子天平 海拔仪 1 3 用于数量分析的性状类型及数据 对所设的7 个样地共选取9 1 株缙云卫矛的个体 分别测其形态学数据共2 4 项 由于样本的形态学数据的测量在1 2 月一1 月中完成 其花期已过 且其果实也有部分 脱落或开裂 所以笔者在选定形态性状特征中繁殖器官的选项相对较少 尤其是花部 性状特征的缺失 这也是本实验中的一大缺憾 在所研究的2 4 项特征中叶性状组有1 2 项特征 枝性状组有6 项特征 果实和种子特征各有3 项特征 1 4 数据处理 1 4 1s p s s 程序中的单因素方差分析 1 4 2s p s s 程序中的多因素方差分析过程戋 i 4 3 聚类分析 袁淑君 1 9 9 5 卢纹岱 1 9 9 7 分别运用s p s s 程序以及n t s y s p c 程序进行聚类分析 2 缙云卫矛的等位酶分析 2 1 样品的制备 2 1 1 样品的采集 本研究在其全分布区范围内设置样地7 个 其中缙云山5 个 东温泉2 个 笔者 于1 9 9 9 年1 1 月一1 2 月间考察确定样地后 于2 0 0 0 年2 3 月间进行取样 由于缙云 卫矛可通过根状茎进行无性繁殖 属于克隆植物 故在取样中注意尽量避免对某一克 隆的重复取样 随机选取7 个居群9 1 个个体的当年生枝条的功能叶6 1 0 片叶片 不 完整或不具有相同发育阶段的叶的植株不采用 立即放入冰壶内带回实验室 若不及 时制样则须放入冰箱冷冻保存 2 1 2 样品的制各 将采回的叶片洗净 擦干 称取鲜重约4 9 并加入等量去离子水及少量石英砂进行 研磨 待样品至糊状后 经1 0 0 目尼龙纱布过滤 取滤液在t g l 高速台式离心机上以 1 5 0 0 0 r p m i n 的转速离心2 0 m i n 后 取上清液并加入等量的4 0 的蔗糖溶液及二滴l 的溴酚兰溶液 置于低温冰箱中保存备用 2 i 3 制胶分离胶及浓缩胶的制备 见表2 胡能书 1 9 8 5 21 4 进样用微量进样器每个样品槽中进样量为5 0ul 2 2 电泳及染色 2 2 1电泳 采用不连续聚丙烯酰胺小型垂直板凝胶电泳 电泳在4 冰箱中进行 开始电压为 濒危植物缙云卫矛 函 嘿胂 sc h l o r a n t h o i d e sy 阻g 的形态分化及遗传窆壁壁堑塞 1 0 0v 下电泳 2 0 3 0 m i n 后将电压升至2 0 0 一3 0 0 v 下恒压电泳 约3 6 小时 至示 踪染料溴酚兰走到距离胶末端约l c m 处停止电泳 然后剥胶 22 2 染色 具体各种酶系统的染色液的配制见表2 表2 缙云卫矛五种等位酶的制胶及染色 t a b l e 2t h e g e lp r e p a r a t i o nf o re l e c t r o p h o r e s i so f f i v ea l l o z y m e si nec h l o r a n t h o i d e sy a n g 2 3 r f 值计算及图谱绘制 2 3 1 将染色后的胶板立即摄影 同时测量其每条谱带的相对迁移位置l o l i 运用 下列公式计算出每条谱带的迁移率 r f 值 r f l i l o 式中l l 固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离 l o 固定染色前凝胶中指示剂的迁移距离 2 3 2 根据五种酶系统 9 1 个个体的r f 值绘制绘制其等位酶谱图 见附图 2 4 遗传多样性的度量 2 4 1 根据酶是基因的产物及酶谱与基因相对照原理 赖德 1 9 8 7 确定每种酶所对 应的等位基因位点数及每个位点的等位基因数 2 4 2 等位基因频率的计算 等位基因频率是进行遗传分析的原始资料 所以首先要计算出每一个居群中的每一 个酶基因位点的每一个等位基因出现的频率 百分数 按照n e i 1 9 7 3 的定义 一个 二倍体居群中的基因位点a 的指定的等位基因 i 的频率q 的计算公式为 等位基因频率 吼 2 e n 口 2 n i s l 式中 具有纯合 基因型的个体数 个体总数 n f具有纯合 基因型的个体数 濒危植物缙云卫矛 d u 榭h jc h l o r a n t h o i d c s r 蛐g 的形态分化及遗冀多样性研究 2 4 3 居群的遗传多样性水平 通过等位酶分析 对所获得的每个酶位点的等位基因组成情况和出现频率的结果进 行数理统计分析 就可以衡量居群的遗传多样性 g e n e t i cd i v e r s i t yo fp o p u l a t i o n s 或遗传 变异性 g e n e t i cv a r i a b i l i t y 常用的表示居群内变异水平或等位基因变异程度的指标主 要有 多态位点百分数尸 p e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cl o c u s 平均每个位点的等位基因 数a m e a n n u m b e ro f a l l e l e sp e rl o c u s 平均每个位点的等位基因的有效数目a m e a n e f f e c t i v en u m b e ro fa l l e l e sp e rl o c u s 平均每个位点的预期杂合度垃 m e a ne x p e c t e d h e t e r o z y g o s i t yp e rl o c u s 和平均每个位点的实际杂合度圮 m e a n o b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y p e rl o c u s n e i 1 9 7 3 等 4 根据等位基因频率 运用下列公式 计算出各项遗传杂合性指标 j 多态位点的百分数p k n 1 0 0 式中k 多态酶位点的数目 疗所测定酶位点的总数 平均每个位点的等位基因数 一 h 爿 4 n i i 式中a 第i 个位点上的等位基因数h 所测定的位点总数 平均每个位点的等位基因的有效数 一 4 1 q n 1 1 j l 式中毋第i 个位点上第 个等位基因的频率 m 测定到的等位基因的总数n 所测定的位点的总数 平均每个位点的预期杂合度 圮 nm i h 1 q n i f f i l 1 1 式中一所