（病理学与病理生理学专业论文）uuo模型大鼠肾间质纤维化相关炎症因子抗体芯片分析.pdf

r 一i i ii ii ii ! ii ii ii ii iiii y 18 8 9 0 9 0u u o 模型大鼠肾间质纤维化相关炎症因子抗体芯片分析摘要目的：采用抗体芯片技术检测在大鼠肾间质纤维化形成过程中肾组织炎症因子的整体变化情况，以筛选出更多可能与肾间质纤维化进程相关的炎症因子，并通过进一步研究，深入了解这些炎症因子的作用，有助于阐明肾间质纤维化的机制，进而为临床防治慢性肾病提供新的方向。方法：将5 0 只清洁级s d 雄性大鼠随机分为假手术组( s o r )和单侧输尿管结扎组( u u o ) 。随机选取各组中的5 只大鼠分别于单侧输尿管结扎术后第5 天、7 天、1 1 天、1 4 天和2 l 天处死，取血5m l监测肾功能的变化，收集患侧肾组织观察梗阻肾的病理学改变。以此确定肾间质纤维化过程中肾脏改变最具代表性的时间点，再将该时间点的肾脏组织做细胞因子抗体芯片检测，观察1 9 种炎症因子在肾间质纤维化进程中的动态变化。在此基础上，选用辛伐他汀进行药物干预，观察辛伐他汀对f r a c t a l k i n e 及受体c x 3 c r l 的影响。将1 5 只s d 雄性大鼠随机分成3 组：s o r 组、u u o 组、治疗组( u u o + 辛伐他汀组) ，每天给予辛伐他汀( 5 m g d ) 灌胃，假手术组、u u o 组和治疗组均在术后第1 4 天处死后取左侧肾脏，观察梗阻肾的病理学变化。结果：与假手术组相比，u u o 组术后第5 天，肾脏组织出现早期纤维化的病理改变。随着梗阻时间延长，患侧肾功能逐渐减退，小管间质纤维化程度进行性加重，于术后第1 4 天，病变最典型。利用抗体芯片技术检测各组肾组织中1 9 种炎症因子的变化情况，有1 7 种炎症因子不同程度出现增高或降低，其中f r a c t a l k i n e 、g m c s f 、i l 1 a 、i l 1 p 、i l 6 、i f n 吖、l i x 、l e p t i n 、m c p 1 、m i p 3 a 、t i m p 1 和n 婚0 【共1 2 种炎症因子随肾间质纤维化程度加重呈增高的趋势，尤以m c p 1 、f r a c t a l k i n e 和t i m p 1 增高最为明显( p o 0 5 ) ；i l - 4 和i l 1 0 表现为下降趋势( p o 0 5 ) ；v e g f 、c i n c 2 和c c 3 表现为先升高后降低的变化趋势( p o 0 5 ) ；c n t f 和 3 - n g f 这2 种炎症因子无明显变化。用辛伐他汀治疗后第1 4 天，与假手术组相比，模型组和治疗组肾组织纤维化明显，治疗组的肾间质纤维化程度轻于模型组。结论：单侧输尿管结扎可以迅速建立理想的肾脏细胞转分化和肾间质纤维化大鼠模型，且肾间质纤维化程度随肾功能的减退进行性加重。抗体芯片检测结果以m c p 1 、f r a c t a l k i n e 和t i m p 1 变化最为明显，说明这三种炎症因子在肾间质纤维化进程中发挥的促纤维化作用最大。f r a c t a l k i n e作为我们筛选出的重要细胞因子之一，其机制和作用尚未被完全研究清楚，而辛伐他汀可能通过抑制f r a c t a l k i n e 及其受体c x 3 c r l 的表达，延缓肾间质纤维化的进展。关键词：抗体芯片；炎症因子；肾间质纤维化；单侧输尿管结扎a n t i b o d yc h i p sa n a l y s i so fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i sr e l a t e di n f l a m m a t o r yf a c t o r si nr a t sw i t hu n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o na b s t r a c t ：0 b je c t i v e ：a n t i b o d ya r r a yt e c h n o l o g yw a sa p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no fo v e r a l lc h a n g e so fi n f l a m m a t o r yf a c t o r si nr e n a lt i s s u e sw h e nr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i sw a sf o r m e di nr a t s ，s ot h a tm o r ei n f l a m m a t o r yf a c t o r sr e l a t e dt ot h i sp r o g r e s s i o nw a ss e l e c t e d a f t e rt h ef u r t h e rr e s e a r c h ，t h er o l eo fi n f l a m m a t o r yf a c t o r sw a sc o m p r e h e n d e di nd e p t h t h u s ，i tw a sh e l p f u lt oc l a r i f yt h em e c h a n i s mo fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i sa n dt h e nan e wr e s e a r c hd i r e c t i o no ft h ec l i n i c a lp r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fc h r o n i ck i d n e yd i s e a s e sw a sp r o v i d e d m e t h o d s ：5 0c ls dm a l er a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t os h a mo p e r a t i o ng r o u p ( s o r ) a n du n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o ng r o u p ( t m o ) 5r a t so fe a c hg r o u pw e r er a n d o m i z e dt ob ek i l l e do nt h e5 m ，7 m ，11m ，14 小a n d21 或d a ya f t e rt h eo p e r a t i o no fu n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o n ；5m lo fb l o o dw a ss a m p l e dt om o n i t o rt h ec h a n g e so fr e n a lf u n c t i o n ，a n dt h er e n a lt i s s u e sw e r ec o l l e c t e do nt h es i d eo ft h ea f f l i c t e dp a r tt oo b s e r v et h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so ft h eo b s t r u c t i v ek i d n e y s h e r eb yt h em o s tr e p r e s e n t a t i v et i m ep o i n tw a sd e t e r m i n e di nt h ep r o g r e s s i o no fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ，a n dn e x tt h er e n a lt i s s u e sa tt h ea b o v e m e n t i o n e dt i m ew e r et e s t e dw i t ht h et e c h n o l o g yo fa n t i b o d ya r r a yo fc y t o k i n e s ，a n dt h ed y n a m i cc h a n g e so ft h ep r o c e s s i o no fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i so f19k i n d so fi n f l a m m a t o r yc y t o k i n e sw e r eo b s e r v e d o nt h i s3b a s i s ，s i m v a s t a t i nw a sc h o s e nt ob e g i nad r u gi n t e r v e n t i o na n di t si m p a c t so nf r a c t a l k i n ea n dr e c e p t o rc x 3 c r lw e r eo b s e r v e d 15s dm a l er a t sw e r er a n d o m i z e di n t o3g r o u p s ：s h a mo p e r m i o ng r o u p ( s o r ) ，u u og r o u p ，a n do p e r a t i o ng r o u p ( o p e r m i o np l u ss i m v a s t a t i ng r o u p ) a l lo ft h e s e3g r o u p sw e r eg i v e ns i m v a s t a t i nf o rad a i l yi n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o n t h es o ra n dt h eu u og r o u p sw e r eb o t hs l a u g h t e r e da n dt h e i rl e f tk i d n e y sw e r ec o l l e c t e do nt h e14 md a ya f t e ro p e r a t i o ni no r d e rt oo b s e r v et h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fo b s t r u c t i v ek i d n e y s r e s u l t s ：c o m p a r e dw i t ht h a to ft h es o rg r o u p ，t h ep a t h o l o g i c a lc h a n g eo fe a r l yf i b r o s i si nk i d n e y sw a sf i r s to b s e r v e di nt h eu u og r o u po nt h e5 md a ya f t e ro p e r a t i o n w i t ht h et i m eo fo b s t r u c t i o n ，g r a d u a lh y p o f u n c t i o nw a ss h o w ni nk i d n e y sn e a rt h ea f f l i c t e dp a r t ；t h ep r o g r e s s i v ed e t e r i o r a t i o no ft u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i sw a so b s e r v e da n dt h em o s tt y p i c a lp a t h o l o g yc a m eo u to nt h e14 md a ya f t e ro p e r m i o n a n t i b o d ya r r a yt e c h n o l o g yw a sa p p l i e dt ot e s tt h ec h a n g e si nt h e19k i n d so fi n f l a m m a t o r yf a c t o r si nt h er e n a lt i s s u e si ne a c hg r o u p ；t h e r ew a se i t h e ra ni n c r e a s eo rad e c r e a s ei nt h e17k i n d s ，a m o n gw h i c h12k i n d si n c l u d i n gf r a c t a l k i n e ，g m - c s f ,i l 一1q ，i l - 1p ，i l 一6 ，i f n - 丫，l i x ，l e p t i n ，m c p - 1 ，m i p - 3a ，t i m p 一1a n dt n f ad i s p l a y e dat e n d e n c yo fi n c r e a s ew i t ht h ei n t e n s i t yo fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ，s h o w i n ga ne s p e c i a l l yr e m a r k a b l ei n c r e a s ei nm c p 一1 、f r a c t a l k i n ea n dt i m p 一1 ( p o 0 5 ) ；i l 一4a n di l - 10d e m o n s t r a t e dat r e n do fd e c l i n e ( p o 0 5 ) ：v e g f 、c i n c 一2a n dc i n c 一3s h o w e dat r e n do ff i r s t4r i s i n ga n dt h e nf a l l i n g ( p o 0 5 ) ，w h i l eb o t hc n t fa n d1 3 - n g fh a dn o te v i d e n tc h a n g e a f t e r14d a y so ft r e a t m e n tw i t hs i m v a s t a t i n ，c o m p a r e dw i t ht h es o rg r o u p ，t h eu u og r o u pa n do p e r a t i o ng r o u pd e m o n s t r a t e da na p p a r e n tr e n a lf i b r o s i s ，t h ed e g r e eo ft h el a t t e rw a sm i l d e rt h a nt h a to ft h ef o r m e rg r o u p c o n c l u s i o n ：u n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o nc a nr a p i d l ye s t a b l i s ha ni d e a lm o d e lf o r t h et r a n s d i f f e r e n t i a t i o no fk i d n e yc e l l sa sw e l la sr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s i nr a t s ，a n dt h ed e g r e eo fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i sp r o g r e s s i v e l ya g g r a v a t e sw i t ht h ed e c l i n eo fr e n a lh y p o f u n c t i o n w i t ht h ea n t i b o d ya r r a yt e c h n o l o g y , t h em o s te v i d e n tr e s u l t ss h o w e di nm c p - 1 ，f r a c t a l k i n ea n dt i m p 一1 ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h e s e3k i n d so fi n f l a m m a t o r yc y t o k i n e sh a dt h es t r o n g e s ti n c r e a s e df i b r o g e n i ce f f e c t so nt h ep r o g r e s so fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s t h em e c h a n i s ma n de f f e c to ff r a c t a l k i n e ，a so n eo ft h em o s ts i g n i f i c a n tc y t o k i n e s ，h a v en o tb e e nd i s c o v e r e dc o m p l e t e l y , w h i l es i m v a s t a t i nm a yd e l a yt h ep r o g r e s so fr e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i sb yi n h i b i t i n gf r a c t a l k i n ea n dt h ee x p r e s s i o no fi t sr e c e p t o rc x 3 c r l k e yw o r d s ：a n t i b o d ym i c r o a r r a y ；i n f l a m m a t o r yf a c t o r s ；r e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ；u n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o n51 l - j l -月i j吾慢性肾病患病率高、防治率低，已成为继心脑血管病、糖尿病、肿瘤之后的一个威胁人类健康重要疾病。据调查显示，从2 0 0 8 年至2 0 1 0 年美国慢性肾病的年发病率从3 3 8 上升到3 6 t 。目前，慢性肾病的患病率和发病率仍在不断上升。慢性肾病的肾脏病理改变是肾小球滤过膜完整性受损、通透性增高，或肾小管扩张、消失等多种因素共同参与的结果，但是肾间质纤维化是所有慢性肾病进展过程中的共同通路，肾病的类型不同，纤维化程度也不同，临床表现也有差别。肾间质纤维化以肾间质炎症细胞浸润，成纤维细胞增殖、转化，导致基质蛋白合成增多，同时基质降解受抑制造成细胞外基质大量堆积，最终导致的肾小球硬化，小管上皮细胞转分化，伴有肾小管萎缩或扩张变形为特征2 1 。可见，炎性反应是肾间质纤维化( r e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ，r j f ) 的启动因素，炎症细胞在间质浸润并激活趋化因子是r i f 的关键环节。近年的研究提示，肾脏在各种损害性因素( 如高血压、高血糖、高血脂、免疫反应等)作用下，肾脏局部会产生的致炎因子( 如：m c p 1 、t n f a 、i l 2 、i l 8 、r a n t e s 、o s t e o p o n t i n 等) 和致纤维化因子( 如a n g l i 、t g f p 、p d g f 、c t g f 、i c a m 、v c a m 等) 【3 ，4 ，5 ，6 1 ，致炎和致纤维化因子的有无、量的多少以及量的变化都可能影响肾脏疾病发生、发展和转归。这些细胞因子在体内形成了一个复杂的网络，通过交互对话( c r o s st a l k ) 等相互影响，进而活化肾脏固有细胞，影响细胞外基质的产生和降解，最终导致胞外基质成份的过度堆积和肾脏固有结构的消失以及肾功能的下降同。以往的对慢性肾病的研究都是针对少数几个细胞因子进行，而且目前对细胞因子检测所采用的方法大多是生物学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法，不论哪种方法都费时、费力，且难以准确定量，检测效率相对比较低；另一方面，由于在肾脏疾病进展过程中并不是单一细胞因子的变化，而是多种细胞因子这通过合成和分泌的相互调节、受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响而组成的细胞因子网络。炎症因子只是细胞因子中的一部分，很多炎症因子通过这个网络关系彼此相互调节，在肾损伤的各个阶段发挥着不同的作用，共同参与了肾纤维化的过程。显然，由于涉及的炎症因子数量较大，对于单一炎症因子的研究不能从整体上把握这些因子之间的相互联系，因此，众多科学研究者开始着眼于对炎症因子及其在肾间质纤维化进程中作用的研究。所以，我们选择高通量的抗体芯片作为肾间质纤维化机制的研究手段。细胞因子抗体芯片，又称为抗体微阵列( a n t i b o d ym i c r o a r r a y ，a b m ) ，近年发展起来的检测蛋白质相互关系的一项新兴的技术 8 1 ，不仅可以同步检测炎症因子的表达水平，反映不同炎症因子在同一疾病中的相互关系，它还可以作为基因芯片的补充，用于研究细胞因子和基因表达之间的关系，具有微型化、集成化、高通量化的特剧9 】。由于抗原与抗体阵列芯片探针结合的特异性高、亲和力强，且在同一系统中集分离、纯化、鉴定和检测为一体，使其与传统的蛋白质检测方法相比较，敏感度更高、准确性更好；另一方面，抗体芯片作为一种定量分析的工具，可以快速、高通量地定量检测样品中大量炎症因子的表达水平，平行性完成样品的检测，并分析样品之间不同炎症因子的相对表达丰度，这完全可以克服之前对单一炎症因子研究的不足；此外，抗体芯片的检测还可作为炎症因子筛选的途径，如果有相关阳性指标，我们将进一步深入研究。本研究旨在利用蛋白芯片技术观察相关炎症因子的变化情况，一方面可以平行性观察不同炎症因子在同一时间点的相互联系，另一方面可以从整体的角度观察某一种炎症因子在肾间质纤维化进程中的动态变化，以筛选出更多可能与肾间质纤维化进程相关的炎症因子，并通过进一步研究，深入了解这些炎症因子的作用，有助于阐明肾间质纤维化的机制，进而为临床防治慢性肾病提供新的方向。材料与方法l实验材料1 1 实验动物清洁级s d 雄性大鼠5 0 只，8 周龄，体重1 8 0 - - 一2 0 0 9 ( 由泸州医学院医学实验动物中心提供) 。分笼喂养于光照黑暗为1 2 1 2 h 的恒温环境，每笼5 只，自由摄食和饮水。2 主要实验试剂2 1 血肌酐测定试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ，试剂组成：1 0l a m o l l 肌酐标准品应用液，钨酸蛋白沉淀剂，苦味酸溶液，o 7 5m o l l 氢氧化钠。2 2 血尿素氮测试盒( 南京建成生物工程研究所) ，试剂组成：lg l的肟溶液，酸溶液，1 0m m o l l 尿素氮标准液。2 3 仅一s m a 鼠抗体( s a n t ac r u z 公司)2 4 生物素标记羊抗兔i g g ( 北京中杉金桥生物技术有限公司)2 5d a b 显色试剂盒( 北京中杉金桥生物技术有限公司)2 6b c a 蛋白浓度测定试剂盒( 增强型，碧云天生物技术研究所) ：试剂盒包括b c a 试剂a 1 0 0m l ，b c a 试剂b3m l ，b s a 标准蛋白11 1 1 1 。2 7r i p a 裂解液( 强) 试剂盒( p 0 0 1 3 b ，碧云天生物技术研究所) ，主要成分：5 0 mt r i s ( p h 7 4 ) ，1 5 0 mn a c l ，1 t r i t o n x 1 0 0 ，1 s o d i u md e o x y c h o l a t e ，1 s d s ，s o d i u mo r t h o v a n a d a t e ，e d t a ，蛋白酶抑制剂笙寸o2 8 大鼠细胞因子抗体芯片试剂盒( gs e r i e s ，美国r a y b i o t e c h 公司) ，包括：8 孔孵育板，r a y b i o t e c h 细胞因子芯片，生物素标记抗体，1 5 0 0 x链霉素化荧光染料( 1 山) ，标记生物素抗体，2 x 封闭液b s a ( 1 0m 1 ) ，2 0 x 洗液i ( 3 0m 1 ) ，2 0 x 洗液i i ( 3 0m 1 ) 。2 9p b s 缓冲液：n a c l8 0g ，k c l0 2g ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 9g ，k h 2 p 0 4o 2 4g ，加双蒸水定容1 0 0 0m l ，p h7 2 - - - 7 4 ，高压蒸汽灭菌，4 保存。3 主要实验仪器3 1 光学显微镜( o l y m p u s 公司产品)3 2 微量移液器及相应t i p - 1 0l a l 、2 0p l 、1 0 0 山、1 0 0 0 “l3 34 0 恒温超级离心机( d 3 7 5 2 0 型，美国科俊仪器公司)3 4 低速自动平衡离心机( 长沙湘仪离心机仪器有限公司)3 5 电子天平( 上海上平仪器有限公司)3 6 全光普分光光度仪( 美国t h e r m o 公司)3 7 超低温冷冻冰箱( 美国a s h e v i l l e 公司)3 84 、2 0 。c 恒温冰箱( 海尔)3 9 平衡脱色摇床( t s i 型，上海亚荣兴化仪器厂)3 1 0 快速混匀器( 新康医疗器械有限公司)3 1 1 电热恒温鼓风干燥箱( 天津世泰斯特仪器有限公司)3 1 2g e n ep i x 基因表达谱芯片扫描仪( 美国r a y b i o t e c h 公司)3 1 3 图像分析软件：s c a n a l y z e 软件( 美国r a y b i o t e c h 公司)3 1 4 图像分析软件：i m a g e p r op l u s6 04实验方法4 1 建立模型将5 0 只大鼠随机分成假手术组和模型组，每组5 只，采用单侧输尿管结扎( u n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o n ，u u o ) 复制肾间质纤维化模型。以1 的戊巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择腹正中线切口，依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，分别在左侧输尿管近肾盂处和输尿管上1 3 处用1 号丝线两次结扎，剪断输尿管，然后逐层连续缝合皮肤。假手术组( s h a mo p e r a t i o n a lr a t s ，s o r 组) 手术方式同u u o 组，进腹腔后仅将输尿管游离但不结扎离断。随机选取每组中的5 只大鼠分别于术后第5 天、7 天、1 l 天、1 4 天和2 1 天处死。4 2 固定及取材麻醉后麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择腹旁正中切口，依次切开皮肤、腹直肌前后鞘至腹腔，经腹主动脉穿刺取血5m l 至抗凝管颠倒混匀，处死大鼠，立即取下左侧肾脏，部分组织置于4 中性甲醛中固定，用作病理切片和免疫组化实验；部分组织置于液氮中速冻，然后移至7 0 冰箱保存，用于抗体芯片检测。4 3 血肌酐浓度测定将抗凝管中的血液置自动平衡离心机中离心，3 0 0 0r p m 转速下离心1 0m i n 。取上清( 血浆成分) 0 2m l ，加入钨酸蛋白沉淀剂2m l ，充分混匀，3 0 0 0r p m 转速下离心1 0m i n 。取上清( 血浆蛋白滤液) 1 6m l ，加入测定管中。取1 6m l l 0l x m o l l 肌酐标准品应用液加入标准管，取等量蒸馏水加入空白管。于各管中均加入o 5m l 苦味酸溶液和o 5m lo 7 5m o l l 氢氧化钠充分混匀，3 7 水浴1 0m i n ，取出后流水冷却。测各管吸光度值：用波长5 1 0n m ，1c m 光径玻璃比色皿，空白管调零，测o d 值。通过计算公式得出各组大鼠血肌酐：血浆肌酐浓度测定管吸光度一空白管吸光度( g m o l l )标准管吸光度一空白管吸光度一标准管浓度，n( 1 0p m o l l ) n 】：样品测试管测试前稀释的倍数( 0 2 m l 样品加蛋白沉淀剂2 m l 则稀释11 倍)4 4 血尿素氮浓度测定将酸溶液4 0m l ，加蒸馏水8 0m l 配成酸应用液，备用。取血浆o 0 2m l ，加入测定管中。取o 0 2m l1 0m m o l l 尿素氮标准液加入标准管，取等量蒸馏水加入空白管。于各管中均加入1m ll g l 肟溶液和1m l 酸应用液。充分混匀，置沸水中水浴1 5m i n ，取出后立即用自来水冷却。测各管吸光度值：用波长5 2 0n m ，1c m 光径玻璃比色皿，空白管调零，测o d 值。计算公式：血浆尿素氮浓度测定管o d 值一空白管o d 值标准管浓度( m m o l l )标准管o d 值一空白管o d 值( 1 0 m m o l l )【n 】：为样本测试前的稀释倍数4 5h e 染色并对肾小管间质损伤评分4 5 1h e 染色取肾组织块，经固定后，脱水，常规石蜡包埋，4l a m 切片。二甲苯脱蜡，经各级浓度梯度乙醇至水洗：二甲苯( i ) 5m i n _ 二甲苯( i i ) 5m i n - - 0 1 0 0 乙醇2m i n - - - 0 5 的乙醇lm i n - - - ，8 0 乙醇1m i n _ 7 5 乙醇1m i n 一蒸馏水洗2m i n 。苏木素染色5m i n ，流水冲洗。1 盐酸乙醇分化3 0s 。蓝化：置于碳酸锂饱和液中2 0s 后，流水冲洗。o 5 伊红染色3m i n 。常规脱水：7 5 乙醇_ 8 0 乙醇_ 9 5 乙醇一1 0 0 乙醇( i ) 一1 0 0乙醇( i i ) 。透明，封片：二甲苯( i ) _ 二甲苯( i i ) 一中性树胶封固。4 5 2 肾小管间质损伤评分左肾组织常规作h e 染色观察肾小管间质的病理变化，参考r a d f o r d 等【1 0 1 方法，每张标本随机选取不含肾小球的10个不重复视野( x 2 0 0 ) ，将肾小管间质病变由8 个参数判定( 肾小管上皮细胞空泡变性、坏死：肾小管扩张；小管萎缩；红细胞管型；蛋白管型；间质水肿；间质细胞浸润；间质纤维化程度) ，每个参数按o 3 分评定( o = 正常；l = 轻度受损，病变范围 5 0 ) ，每个样本小管间质的评分为0 - - 一2 4 分【1 l 】。4 6m a s s o n 染色并测定肾间质相对面积4 6 1m a s s o n 染色石蜡切片常规脱蜡至水洗。m a s s o n 复合染色液5m i n 。o 2 醋酸水溶液稍洗。5 磷钨酸液5m i n 。o 2 醋酸水溶液洗2 次。o 1 亮绿液染色1 0m i n 。o 2 醋酸水溶液洗2 次。无水酒精冲洗脱水，透明，封固。4 6 2 测定肾间质相对面积采mm i z u g u c h i 等【1 2 1 描述的方法，将m a s s o n 染色的每例切片选取l o 个不重复的2 0 0 倍视野，以绿色胶原沉积为阳性信号，运用图像分析软件i m a g e p r op l u s6 0 计算绿染面积占整个视野的百分比，从而得出肾间质胶原面积与视野内肾小管间质总面积( 去除肾小管管腔) 的比值，取其平均值为每例切片的肾间质相对面积13 1 。4 7 免疫组织化学染色并观察( i t 平滑肌肌动蛋白表达4 7 1 肾小管间质0 【s m a 免疫组化染色4 岬厚石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。阻断灭活内源性过氧化物酶：3 h 2 0 2 3 7 。c 孵育1 0m i n ，p b s 冲洗3 次，每次5m i n 。抗原修复：置于o 0 1m m o l l 枸橼酸缓冲液( p h 6 o ) 中煮沸至9 5 左右，1 5m i n 。待自然冷却2 0m i n 后，用冷水冲洗加快冷却至室温，p b s 冲洗3 次，每次5m i n 。正常山羊血清工作液封闭，室温2 0m i n 后倾去工作液。加一抗：滴加a s m a 鼠抗体5 0g l ，4 。c 冰箱孵育过夜。用p b s 缓冲液代替一抗作阴性对照。3 7 。c 复温4 5m i n ，p b s 冲洗3 次，每次5m i n 。加二抗：滴加生物素标记的羊抗兔i g g 5 0g l ，3 7 。c 孵育3 0m i n ，p b s液冲洗3 次，每次5m i n 。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，3 7 。c 孵育3 0m i n ，p b s 液冲洗3 次，每次5m i n 。d a b h 2 0 2 显色：滴加d a b 显色液，室温下反应5 1 0m i n ，镜下观察并终止显色反应，p b s 缓冲液冲洗1 0m i n 。苏木素复染：滴加苏木素染液，2m i n 后倾去多余染液。l 盐酸酒精分化，自来水冲洗1 0m i n 。常规脱水、透明、封片。4 7 2 观察平滑肌动蛋白表达情况对0 【s m a 免疫组化染色肾组织切片进行半定量分析，具体步骤如下：运用图像分析软件i m a g e p r op l u s6 0 在同一条件下对每张标本不含肾小球和血管的肾小管间质区域随机选取1 0 个不重叠的2 0 0 倍视野，将光镜下以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性信号。阳性面积测定在每张不包含肾小球计算每个视野内阳性染色区域的面积密度，以均值作为该标本的最后结果，最后进行组间比较。4 8 统计分析用s p s s l 7 0f o rw i n d o w s 统计软件进行相关统计学分析。计量资料用均数4 - 标准差( i s ) 表示，两个样本均数比较用t 检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析( o n e - w a ya n o v a ) 、q 检验，仅s m a表达与肾小管间质损伤评分、肾间质相对面积之间的关系判断采用p e a r s o n 相关分析，以p 0 0 5 为有统计学差异。并以此确定肾间质纤维化过程中肾脏改变最具代表性的时间点，再将该时间点的肾脏做蛋白芯片检测。4 9 组织裂解选取假手术组、u u o 模型组术后7 天、1 4 天各5 只大鼠的左侧部分肾组织，通过组织裂解液裂解肾组织。把组织剪切成细小碎片、在液氮条件下将组织研磨后分装。溶解r i p a 裂解液、混匀，取适当量的裂解液，在使用前加入蛋白酶抑制剂，使p m s f 的最终浓度为1m m o l l 。按照每4 0 0g l 组织匀浆加入8 0 0 山裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，并放置4 。c 恒温冰箱保存，过夜，直至充分裂解。充分裂解后，于4 。c 恒温离心机中1 0 0 0 0 1 4 0 0 0g 下离心3 - 4m i n ，取上清。4 1 0b c a 蛋白质定量配置b c a 工作液。每孔需配置2 0 0g l 的b c a 工作液。以5 0 体积b c a 剂a 加1 体积b c a 试剂b ( 试剂a ：试剂b = 5 0 ：1 ) 的比例混合以配置b c a 工作液。如l o 个孔的实验需要用2n l l 试剂a 混合4 0 山试剂b 。取o 8m l 蛋白标准配制液加入到蛋白标准( 2 0m g b s a ) ，充分溶解后配制成2 5m g m l 的蛋白标准溶液，于一2 0 。c 冻存。取2 山浓度为2 5m g m l 的蛋白标准溶液，加入9 8 山稀释液配制成最终浓度为o 5m g m l 的蛋白标准。将标准品按0 、1 、2 、4 、8 、1 2 、1 6 、2 0 山加到9 6 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液( p b s 液) 补足到2 0 山。加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，加标准品稀释液( p b s )到2 0 山。每孔加入2 0 0 山的b c a 工作液，震板3 0s 以彻底混合均匀。盖好微孔板，3 7 0 c 孵育3 0m i n 。冷却至室温。将全波长分光光度仪调至测定波长5 4 0 - - 5 9 5n l t l 之间，5 6 2n n l 波长最佳，检测各孔吸收值。测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值。以校正过的b s a 标准蛋白浓度( 1 t g m 1 ) 为横坐标，以吸光值为纵坐标，做图绘制标准曲线，使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。4 1 1 抗体蛋白芯片检测4 1 1 1 原理：大量不同的抗体按照预定的顺序排列并固定在固体支持物上且保留其抗原结合能力，芯片与蛋白质样品一起孵育，在孵育过程中芯片上的抗体识别并捕捉抗原，然后，加入检测抗体识别目标抗原上不同表位。通过化学发光方法对信号进行检测。本研究中所应用的芯片是双抗体夹心免疫测定技术、微阵列技术、以及化学发光技术的有机结合。工作原理如下( 图1 ) 所示：a r r a ys u p p o r tc o c l 【| a f lo fb l o l m u l a b e l e d s n e p t a v i d i ny 八，- 一1 i r b v二_天丈文式、蹄唱i 州n c t u h b a t i 1 o n o fs a m p l e a la y e da n t i b o d y 11 t h1 1s u p p o r t sf1 - 2h r si n c u b a h o nw i t hi a b e l e d - s t r e p t a i d l nd e t e c t t 0 1 1o fs i g n a l sd a t aa n a b 侮ha n dg r a p h图l 抗体芯片的工作原理示意图f i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fa n t i b o d yc h i pw o r k4 11 2 操作步骤：打开盒子内的载玻片，取出，自然风干2h 备用。组装：按图2 所示步骤，将8 孔孵育板和r a y b i o t e c h 细胞因子芯片组装固定，形成孵育槽。封闭：用去离子水按1 ：1 比例将2 倍浓度的封闭液稀释为1 倍浓度( i x ) 的封闭液。向相对应的反应孔中各加入l o op l1 x 封闭液，室温1 8粼孥毕甲一一下震动孵育3 0r a i n 。加样：去除封闭液，向各孔中加入1 0 0p l 的待测样本( 如图3 ) ，用薄膜覆盖整，在室温下轻轻的震动孵育2h 。c x e 4 r u l l yp l a c es l i d ea tb o t t o mo f t h ec h a m b e ra ss h o w n t h es l i d ew i l ia d h e r es o m e w h a tt oot h eb o t t o m w a r n i n g ：t h es l i d ei sf r a g i l e , s od on o ta p p l ym o r et h a ng e n t l ef o r e et ot h ea p p a r a t u 23w h i l eg e n t l yh o l d i n gc h a m b e ra n ds l i d e , p l a c es i d eo nc h a m b e ra ss h o w n b e g i n n i n gw i t hb o t t o mf l a pf i r s t t h e np r e s st h et o po f t h es i d ei n t og r o v eo f tc h a m b e r , a n dt h e na p p l ye v e n , g e n t l ep r e s s u r ef r o mo n e e n dt ot h eo t h e r r e p e a tt h i sp r o c e d u r ew i t ht h eo t h e rs i d e 图2 将孵育板和细胞因子芯片组装过程示意图f i g 2a s s e m b l et h eg l 瓣c h i pi n t oi n c u b a t i o nc h a m b e r a n di n c u b a t i o nf r a m e图3 加样f i g 3a d de a c hs a m p l et oa r r a y e d 粕t i b o d ys u p p o r t s1 9洗涤：将2 0 倍浓度的洗液i 用蒸馏水稀释成1 倍浓度( 1 x ) 的洗液i 待用。去除样品溶液，用1 5 0g l1 x 洗液i 在室温下温和振动洗涤3 次，每次2m i n 。完全移出洗液i ，将芯片同孵育板一同放入盛有1 x 洗液i 的玻璃杯中，室温下震动洗涤2 次，每次1 0m i n 。移出各孔中的洗液i ，将芯片移入盛有1 x 洗液i i 的玻璃杯中，室温下震动洗涤2 次，每次5m i n 。准备一抗工作液：于4 恒温离心机中10 0 0 0g 下离心3m i n ，加入3 0 0l a l l x 封闭液至生物素标记抗体管中，吹打混匀。加一抗：于各反应孔中加入7 0 肛l 一抗工作液，4 。c 温育过夜。洗涤：操作同上述步骤5 、7 。稀释链霉素化荧光染料：将染料试剂盒轻微离心，加入1 5 皿1 x封闭缓冲液，将其稀释成1 倍浓度的荧光染料。加荧光染料：每个反应孔中各加入7 0i l l1 5 0 0 倍稀释的h r p 标记的抗链霉生物素抗体，暗室里室温下轻微震荡孵育2h 。避光洗涤：操作同上述步骤5 、7 。将芯片从孵育槽中卸下，并放入专用离心管中，加入3 0 砌洗液i ，室温下温和震荡洗涤两次，每次1 0m i