细胞与分子遗传学.doc

细胞和分子遗传学第一章 绪论1. 遗传：生物信息从上代往下代传递2. 遗传学：研究遗传规律的科学 3. 基因组Genome : 一整套染色体上的所有遗传物质4. 基因组学Genomics: 研究基因组的科学，包括研究分析核酸序列、基因成分、基因结构和基因数目.5. 细胞遗传学: 从细胞学和遗传学发展起来的交叉学科，它涉及染色体的形态、结构、数目、功能和运动等特征，以及这些特征的各种变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响，也涉及染色体外的遗传因子。以染色体遗传为研究核心。6. FISH(fluorescent in situ hybridization):荧光原位杂交7. 原位杂交：是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。8. FISH工作原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。9. FISH的应用：位点特异性探针：能与染色体的特定部位杂交；已经分离出一段基因的一小部分，若要确定这段基因位于哪个染色体，就准备这段基因的探针并观察该探针与哪个染色体杂交。整个染色体探针：能分别与染色体纵轴的不同序列杂交的很短的探针的集合。用这些探针库能画出全部染色体并产生核型谱带，再进行核型分析，用于检测染色体异常10.原位杂交的种类：GISH（Genomic in situ hybirdization)以基因组为探针（整个染色体）。FISH（Fragment in situ hybridization)以特定的基因为探针（基因片段）。mFISH (multicolor FISH)利用不同颜色的荧光素标记不同的探针。Fiber-FISH利用化学方法对染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA纤维为载体进行FISH（提高分辨率）。第二章 基因组作图与基因定位1. 结构基因组的研究策略：测序路线作图（遗传图和物理图）、测序（图谱测序和随机测序）、组装（骨架图和空隙图）。2. 为何要绘制遗传图与物理图？1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位置组装,需要图谱进行指导. 2)每次仅能读取1000bp，已知最小的细菌为580kb.3)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图. 4)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.3. 遗传图与物理图：遗传作图（Genetic mapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。物理作图（Physical mapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种（radiation hybrid）作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb)。4. 基因组测序的策略：Clone-by-clone测序（基因克隆）、鸟枪法测序（全基因组）、混合法测序。基本流程：随机酶切成小片段（不完全酶切）亚克隆（酶切片段+载体）亚克隆测序（两端测序）组装。关键：酶选择，片段大小，数量（库大小）。5. 基因组路标(landmarker)：染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标, 路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固定的, 不会更改的, 因而提供了作图的依据。6.RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）：指基因型之间限制性片段长度的差异（同种酶），这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。7. RFLP的特点：处于染色体上的位置相对固定; 同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变; 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性（双亲的性状同时在F1个体上表现出来）一个酶切位点突变，则两条同源染色体跑出的胶共有3段，下面两段相加等于上面那段.8. 如何寻找RFLP标记（即酶切位点）: 随机克隆筛选; 将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA)标记转换为RFLP标记; 从cDNA 中寻找RFLP. 计算机筛选.9. AFLP(amplified fragment length polymorphism, 放大的片段长度多态性)：这是一种筛选RFLP分子标记的方法. 先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物（补平粘性末端并额外延伸1-3个碱基）. 接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基（补平末端）, 然后向3方向延伸1-3个不同的碱基（共有41-43种不同的引物）. 选择不同的引物对扩放样品DNA（PCR）, 经聚丙烯胺凝胶电泳分离标记的（就是用那多出的1-3个碱基作为标记）PCR产物.10.SSLP（simple sequence length polymorphism，简单序列长度多态性）：可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同(导致多态性); SSLP的类型:小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长；微卫星序列(microsatellite), 重复单位较短, 在1-6个核苷酸之间。11.SSR（简单重复序列，即微卫星序列）: 其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复(CA,TG), 重复单位数目10-60个。12. 如何寻找微卫星序列标记? 1982年Hamada等首次报道microsatellite现象(PNAS, 79:6564, 1982)。1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化(Am. J. Hum. Genet., 44:388, 1989).现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个多态性(CA)n.获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII或AluI 限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标记PCR扩增样品, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分辩.13. SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)：指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。14. SNP的一些特点：理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4. 直接从STS (sequence-tagged site，序列标志位点)测序中可寻找到SNP. MIT Whitehead Institute 经分析证实, 人类基因组平均每1 kb 含有一个SNP. 估计人类基因组有300万个SNP. SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学. 编码区SNP主要分布在密码子的摇摆位置（第3个碱基），表现为沉默突变而被保留下来.15. 遗传图绘制-分子标记的等位型式及F2基因型分析，计算重组率，从而绘制遗传图（Aa/Bb，其中A/B连锁）（图-42）16. 物理图绘制：限制性作图（Restriction mapping）它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。依靠克隆的基因组作图(Clone-based mapping) 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。荧光标记原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中（小段DNA序列已知，两端设计引物，利用PCR进行扩增）。 限制性作图（Restriction mapping）：将限制性酶切位点标定在DNA分子（一般为小分子DNA）的相对位置。酶切片段电泳图；推测出限制性物理图。对于大分子DNA的研究策略与方法：1) 制备-琼脂糖包埋法 2) 酶切-稀有酶切位点限制酶 3) 分离-脉冲电泳分离 4) 克隆-载体设计 琼脂糖包埋法(知道即可)：a.分离纯化细胞核 b.将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中 c.蛋白酶消化处理细胞核。 稀有切点限制性内切酶的应用：a.什么是稀有切点内切酶： 在基因组DNA顺序中有很少可识别序列的限制酶, 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有高G/C比。 b.选用稀有切点限制酶注意事项：a) 识别位点的非特异顺序, -G ANTC- (HinfI), -GCCN4 NGCC- (BglI) b) 高等生物基因组一般A/T比较高, 应选G/C高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-(NotI) c) 基因组甲基化状态, 高等生物基因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。脉冲交变电场电泳：会跑出一段白色的轨迹，而不是一条一条的片段（因为各片段紧密相连，共同组成了连成一片的轨迹）。 克隆作图（大分子DNA的克隆）：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。克隆作图的载体与方法：大分子DNA克隆载体构建：YAC, BAC, PAC, HAC, MAC, TAC。大分子DNA克隆的作图：步移法和指纹法。YAC（酵母人工染色体）和BAC（细菌人工染色体）基因组文库的构建：1) 目标基因组大分子DNA的制备 2) 载体制备3) 载体和插入DNA的连接 4) 转化 5) 转化子鉴定染色体步移法：以A1为探针，找到B1、B2（A1两端与B1、B2分别配对），在分别以B1、B2为探针重复杂交，筛选到下一轮阳性克隆C1、C2，不断重复，建立起彼此连接的重叠群。限制性片段指纹作图原理：a.在两个重叠BAC克隆间存在相同指纹 b.重叠BAC克隆DNA凝胶电泳指纹图（重叠的片段在图上显出相同位置的条带）：BAC克隆酶切后经过琼脂糖凝胶电泳分离，染色后显示片段指纹，再经计算机识别相同的指纹区段，即重叠的BAC克隆。最后构建指纹重叠群（物理图的绘制），基因组的遗传图可与物理图整合。顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图：通过PCR或分子杂交将特定DNA 顺序定位在基因组染色体区段中。STS作图原理：将染色体DNA随机打断，两个标记所处的物理位置越近，位于同一片段的几率越高。辐射杂种作图: 辐射杂种图距单位DNA分子暴露在N拉徳(rad) X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率, 其图距单位为厘镭(centiRay, cR).17.物理图的应用图位克隆或定位克隆：该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息（遗传作图物理作图转录图基因顺序）。1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记; 2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC); 4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 5) 用获得的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆; 7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆; 8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。（百科）18. 图位克隆的步骤：1) 连锁标记的分离与克隆（筛选到）; 2) 连锁标记向靶基因位置逼近; 3) 以紧密连锁标记为探针筛选基因组(大插入片段)克隆; 4) 染色体步移, 构建覆盖靶基因位点的重叠群; 5) 以覆盖靶基因位点的DNA克隆为探针从cDNA文库筛候选基因; 6) 候选基因多态性分析; 7) 转基因验证.第三章 基因组测序与诠释1.本章内容：基因组测序的策略 基因组测序的方法 高通量自动化测序 序列组装2.基因组测序的策略：随机测序 限定测序3.随机测序（与鸟枪法类似）：基因组文库的构建 两端测序（基因组DNA部分酶切电泳分离DNA片段建库挑取克隆两端测序形成重叠群覆盖的DNA区段可得到）4.基因组测序的方法：测序的DNA多聚酶 测序标记 电泳装置 测序难点.5. 测序的DNA多聚酶：高酶活性; 无53外切核酸酶活性; 无35外切核酸酶活性。6. 链终止法测序(Sanger法)：和放射性同位素标记测序法不同以荧光颜色为标记信号,每种ddNTP各有1种代表颜色; 整个反应在一个试管中进行; 新合成的终止单链通过荧光监测仪时,可以光信号读出末端核苷酸并由电脑记录.7. 化学法测序(Maxam法)：分别修饰分别降解; 试剂含有毒性; 链终止法更易于自动化.8毛细管电泳：取代聚丙烯酰胺凝胶电泳，有96个泳道，可同时进行96次测序，每轮不到2小时，一天近千次反应9. 几种不同生物基因组的测序：1) 大肠杆菌基因组测序-图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序-鸟枪法 3) 果蝇基因组测序-鸟枪法4) 人类基因组测序-图位法和鸟枪法（鸟枪法局限：无法测到重复出现的DNA片段）5) 拟南芥基因组测序图位法 6) 水稻基因组测序-图位法和鸟枪法.10. 流感嗜血杆菌基因鸟枪法测序无需任何关于遗传图及物理图的信息。11. 用于测序的流感嗜血杆菌基因组文库构建了两套基因组文库，原因是：1) 1.6-2 kb大小插入子基因组文库. 2 kb大小插入子可减少扩增时的变异率. 此外, 2 kb大小降低了克隆片段含有完整基因的可能性, 有些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的. 2) 15-20 kb大小插入子文库, 用于支架搭建. 上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序.12. 间隙：测序后将DNA顺序进行组装，存在不连续的区段。13. 间隙的类型（名解）：1) 顺序间隙：因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序,仍存在于克隆文库中, 这类间隙称为顺序间隙。 2) 物理间隙：因克隆载体自身的限制（库中）或DNA顺序特殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未能克隆, 这类间隙称为物理间隙。14. 流感嗜血杆菌基因组测序结果（看看即可）：1) 两端测序的结果称为读序(read), 每个读序长约400bp. 2) 在DNA顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读序都必须经PhredII软件处理, 以确定给出的顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可 (calling for). 3) 流感嗜血杆菌基因组测序共组装了24304个片段,建立了140个重叠群(contig).根据某些克隆跨越不同的contig, 再合并为42个支架(scaffold). 4) 整个组装的基因组顺序存在42个物理间隙, 98个顺序间隙.基因组全长1830137bp(1.8 Mb).15. 基因组顺序组装的概念定义（名解）：1) BAC末端顺序(BAC-end sequence)：一个BAC克隆插入片段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序. 可用于确定BAC的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排列方向. 2) 重叠群(contig)：一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是草图顺序或精确顺序(finished), 包括连续的(内部无间隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序. 3) 草图顺序(draft sequence)：人类基因组测序计划定义为经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定. 4)精确顺序(finished sequence)：顺序差错率(错误碱基数)低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一般测序覆盖率在8-10个当量. 5) 支架(scaffold)：一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部含间隙或不含间隙.16. 果蝇基因组测序：第一个采取鸟枪法完成基因组测序的真核生物，基因组总长180Mb。17. 鸟枪法顺序组装流程图（看看即可）：1) 由自动测序仪记录的测序顺序经Phred Q20软件判断采用. 2) 筛查过滤重复顺序: 如rRNA基因, 转座子等。 3) 重叠顺序组装: 两段顺序重叠的认可标准为,至少40bp的重叠,差异率小于6%. 4) Unitigger(重叠单元)建立: 一组彼此重叠的DNA顺序,其中不存在争议的或不确定的重叠关系,为独立的重叠群. 5) 支架(scaffold)搭建: 由一组Unitigger相互叠合以及由BAC克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群,内部可能有间隙. 18. 定位克隆（即图位克隆，见前）：首先找到与靶基因连锁的分子标记，然后构建基因组文库。通过与靶基因连锁的分子标记筛选阳性克隆，再根据克隆插入子两端的DNA顺序查找与之连接的克隆建立重叠群，直到覆盖整个靶基因座位（染色体步移）。17. 线虫基因组测序策略：图位法18. 关于基因组测序顺序的概念（名解）：草图顺序（前有）： 1) 达到普通质量但尚未完成的基因组DNA顺序, 其精确度高于90%.所处染色体位置已知,一般长度约10kb. 2) 草图顺序可分为3个等级： Phase 0: 测序覆盖顺序一次的DNA序列; Phase 1: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向未定. Phase 2: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向已定. 完成顺序：1) 完成顺序系指已测序的, 每10000 个碱基中出现一个差错, 且内部不存在间隙的DNA顺序. 2) 完成顺序也称为Phase 3期顺序.19. 玉米基因组如何测序：1) 玉米基因组大小为2500 Mb(2.5 x 10 ), 约80% DNA顺序由逆转座子组成. 2) 虽然利用EST(expressed sequence tag)可从基因组中抽提出基因组顺序,但因表达丰度过低或组织专一性表达的原因, ESTs库会丢失50%的基因成员. 3) 绝大多数逆转座子和非基因编码区都被甲基化, 而95%的基因未甲基化. 因此采用大肠杆菌McriA和McriB系统构建玉米基因组文库, 用以富集基因顺序.20. 玉米基因组甲基化过滤测序法：1) 大肠杆菌McriA和McriB系统可以破坏入侵的含有胞嘧啶甲基化的外源DNA, 动物和植物DNA对这一系统也很敏感. 2) 用甲基化敏感的限制酶切割玉米基因组DNA, 将克隆载体转化大肠杆菌McriA和McriB系统菌系,凡是含有胞嘧啶甲基化的克隆均被淘汰, 使基因富集7倍. 3) 采用甲基化过滤法可将玉米基因组中93%的甲基化顺序除去.经过滤后有24%的顺序与基因匹配,而未过滤的仅1.4%与基因匹配.21. 基因组序列诠释：1) 基因注释 2) 基因功能预测 3) 基因功能检测 4) 功能基因组研究22. 真核生物基因的一般结构：外显子和内含子。23. 真核生物基因的组成特征：1) 外显子的组成 2) 内含子的组成 3) 碱基的分布规律24. 内含子的组成特点：1) 内含子具有前体mRNA加工的特征顺序。 2) 内含子含有高比例的三种读框的终止密码。25. 外显子的组成特点：1) CpG岛:脊椎动物 2) 摇摆密码子的使用频率或密码子偏爱 3) 5和3非翻译区(UTR)碱基比率, 水稻基因5的高GC比 4) 不含或含有较少的终止密码。26.密码子偏爱现象：不同生物表达同种氨基酸的密码子的使用频率不同。27.同源查询DNA顺序和氨基酸顺序28. 同源性,一致性和相似性：1) 同源性(homology)：基因系指起源于同一祖先但顺序已经发生变异的基因成员, 分布在不同物种间的同源基因又称直系基因(orthologous gene). 同一物种的同源基因则称水平基因(paralogous gene), 水平基因由重复后趋异产生. 2) 基因同源性只有“是”和“非”的区别, 无所谓百分比. 3) 一致性(identity)：系指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基成员, 或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成员, 可用百分比表示. 4) 相似性(similarity)：系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例. 可取代氨基酸系指具有相同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员, 它们之间的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能.（注意区别一致性和相似性）29. 基因注释的方法：1.目前基因注释的方法主要依赖于生物信息学方面的分析结论,它们包括以下自动注释内容: 1) ab inition 软件的预测, 依据基因结构的特点. 2) 同源性比较 3) 基序(motif)或功能域(domain)分析预测基因功能. 2. 基因功能的分类主要采用ONTOLOGY标准. 3. 人工注释系指人为检测评价程序自动注释的结果并根据其它数据进行分析与校正. 4. 实验注释系根据实验结果进行注释. 基因功能注释与调控顺序注释仍处于起始阶段. 30. 基因注释标准人类：Known gene: 与人类已知cDNA和蛋白质顺序同源的基因. Novel gene: 与脊椎动物cDNA或其它物种蛋白质同源的基因. Novel transcripts: 与novel 基因相似,但缺少明确的ORF. Putative gene: 有同源EST支持, 但缺少cDNA或ORF. Predicted gene: 数据库中至少有一个外显子支持, 但缺少cDNA或明确的ORF. Pseudogene(假基因): 与已知蛋白质有50%的同源性,但cDNA残缺,在其它位点存在正常的同源基因的顺序.31. 水稻注释基因类群的划分标准（3种）： Homology(同源的):与某一蛋白质氨基酸顺序完全一致或相当一致的基因,有两种水平:一致的命名(same name);可能的(putative protein)或类似的(-like protein)命名. Unknown(未知的): 具有全长cDNA或EST(覆盖几乎整个基因范围)支持但没有任何同源蛋白质记录的基因. hypothetical (假定的):由一个或几个注释软件认可的蛋白质,但缺少cDNA或EST支持的基因.32. 人类基因总数的预测有三种方法: cDNA和ESTs顺序 机算机注释 比较基因组学(保守的ORF)。33. 几种模式生物注释的基因总数：大肠杆菌(E.coli):4800 酵母(yeast): 6200 线虫(nematode): 19000 果蝇(fly): 13600 拟南芥(Arabidopsis): 25000 水稻(rice): 60000 玉米(maize):59000 (估计数) 老鼠(mouse): 30000。34. 功能域注释：1) 任何基因编码的蛋白质都由一些在高级结构水平具有特征性的功能域组成, 如信号肽, 受体区, 激酶区, DNA或RNA结合域等. 2) 功能域具有很强的保守性, 关键的氨基酸组成及其排列位置是相当衡定的,是鉴定功能域的主要标识. 3) 功能域是目前确定基因功能的主要依据之一. 4) 已由许多专门的功能域注释软件,可用于基因组顺序的注释.35. 什么是功能域 (domain)？定义1：蛋白质具有独特的三级结构和特有功能的区域。定义2：具有的独特功能的蛋白质氨基酸序列的不连续的部分。定义3：蛋白质具有三级结构的部分，在更大的蛋白质中每个功能域通过短的可弯曲的多肽片段与其他功能域链接。36. 真核生物核基因组：分子生物学的研究从单个的基因转移到整体的基因组活性研究。基因组主要的部分以染色体形式存在于细胞核中，较少的部分位于线粒体中，植物细胞还有叶绿体，也且有独立的基因组。不同真核生物核基因组均由一定数目的染色体组成，单倍体细胞所含有的全套染色体称为 染色体组。37. 染色体结构：染色体结构部件 染色体带型 人类染色体区带（带型）命名：人类染色体带型最早确定的命名方式是从着丝粒向两侧按数字编号, 短臂以p代表(p=petit),长臂以q代表。38. 核型（Karyotype）：又称染色体组型，是指用显微镜照像或描绘的方法得到的单个细胞染色体的系统排列。由体细胞中全套染色体按形态特征和大小顺序排列构成，并依次配对、分组。代表的是该个体一切细胞的染色体组成。有丝分裂中期染色体的形态较典型，所以一般分析中期染色体。主要观察染色体的长短、着丝点的位置，臂的长短、有无随体，其中以着丝点的位置最为重要。39. 染色体核型分析（Karyotyping）：是指在显微镜下对个体细胞染色体的大小,形状,数目进行检测的一种方法.根据染色体分带技术可以检测到样品细胞的染色体结构是否正常,是否发生了染色体数目的变化,结构的重排,区段缺失或重复。40. 基因组的结构成分：1) SAR和MAR 2) CpG岛 3) 等高线4) 富基因区5)“沙漠区”。41. SAR（骨架附着区，Scaffold attachment region）：与染色体骨架蛋白结合的染色体DNA顺序. 42. MAR（基质附着区，matrix attachment region）：与细胞核基质蛋白结合的染色体DNA顺序.43. MAR和SAR的特征（区别）：1) 环突的DNA基部与细胞核基质紧密结合, 将染色体DNA分成相对独立的结构区域. 2) 与细胞核基质结合的DNA顺序(基质附着区,MAR)含有较高比例的AT, 约占总DNA的10%. 3) 拓扑酶II可与MAR结合, 因此推测MAR成分与DNA复制有关. 4) MAR或SAR之间的距离平均为30 kb, 染色体DNA环突长约25-600 kb, 因此并非所有MAR或SAR均与基质或骨架结合.44. SAR和MAR的应用：由于发现许多功能基因的两侧含有SAR或MAR的结构，并证实SAR和MAR（作用）具有阻止异染色质位置效应和隔离相邻基因彼此干扰的功能，因此为了提高转基因的表达水平, 在构建表达载体时可在基因两侧安装SAR或MAR顺序, 以减少转基因沉默效应（防止被干扰）。45. 什么是CpG岛？满足CpG岛的条件为: 1） 连续200 bp的DNA顺序(已修改为500 bp); 2）C+G含量大于50%(已修改为55%); 3）观测到的CpG双碱基数目与预期的数目之比大于0.6(已修改为0.65).46. CpG岛的一般特点：1) 主要在脊椎动物中发现,其它种属基因组中也有CpG岛, 但特征不明显. 2) 绝大多数CpG岛中很少出现胞嘧啶甲基化, 因此被认为是基因转录活跃区. 3) CpG岛主要分布在基因的启动子区和第一个外显子区. 4) 绝大多数管家基因(housekeeping gene) 含有CpG岛, 是寻找基因的一个指标.47.脊椎动物中CpG岛的分布有如下特点：1）主要分布在基因的5端和第1个外显子区. 2）人类中40%的管家基因的5端均含CpG 岛. 3）双碱基-CpG-具回文结构,是甲基化酶作用的位点,可在回文对称的两个胞嘧啶5位碳原子上进行甲基化.CpG岛中-CpG-双碱基均无甲基化.48. 为何会产生CpG岛? 1) 由于细胞内胞嘧啶甲基化与脱氨基事件常常发生, 导致复制时的CA错配.在下一轮复制时原来的胞嘧啶(C)位置由胸腺嘧啶(T)取代, 即发生碱基代换. 因此基因组DNA顺序进化的总趋势是A/T 比例增加. 2) 管家基因对生物的存活极其重要, 启动子区是基因调控的主要成分, 因此很少发生可遗传的CA的突变, 保留了较平均值更高的G/C比.49. 植物基因组中的CpG岛：1) 植物基因组,主要是小型基因组(水稻和拟南芥)含有类似脊椎动物基因组中的CpG岛. 2) 水稻和拟南芥CpG岛的分布密度分别为4.7 kb和4.0 kb. 3) 水稻和拟南芥CpG岛的分布覆盖了整个基因,并非如脊椎动物那样局限于基因5端. 4) 植物除-CpG-可被甲基化外, -CpNpG-回文结构的胞嘧啶也可甲基化. 5) 植物中-CpG-在CpG岛中的比例在75-80%, 与脊椎动物类似, 单子叶高于双子叶.50. 基因组顺序组成的等高线(isochore)特点：1) 等高线(isochore)：系指基因组中具有较均一的相似比例碱基组成的连续的DNA顺序. 2) 脊椎动物基因组中等高线DNA顺序具有镶嵌分布的特征. 3) 高GC比例区总是分布在基因密集区或常染色质区, 高AT比例区大多数分布在异染色质区或贫基因区. 4) 梯度密度离心(Ag+的Cs2SO4) 可将不同碱基比例的具有均一性组成的DNA顺序分离。51. 基因组的顺序组成：1)编码顺序 2) 非编码顺序 3) 重复顺序 4) 单一顺序52. 染色体结构与交换重组频率：1) 短臂交换率大于长臂 2) 近端粒区交换率大于内部区域 3) 富基因区大于贫基因区 4) 存在重组热点 5) 女性染色体交换率大于男性 6) 染色体交换的位置大多分布在启动子区53. 基因组的基因构成：1) 蛋白质编码基因 2) 非编码RNA基因：几乎所有RNA编码基因都是多拷贝。54. 动物种属专一性基因非常之少：1) 老鼠基因组注释结果揭示,啮齿类基因中只有1%为种属专一性基因. 2) 原来以果蝇作为参照, 认为在脊椎动物中存在许多脊椎动物种属的基因, 现在在珊瑚虫基因组中已找到许多曾被认为是脊椎动物种属专一性的基因. 因此真正属于脊椎动物的基因数（专一性）比预期的少很多.55. 非编码RNA基因包括：rRNA基因 tRNA基因 snRNA基因: 小分子细胞核RNA基因，涉及前体mRNA剪接 snoRNA基因: 与rRNA剪接和修饰有关 scRNA基因: 小分子细胞质RNA基因 7S RNA: 与核糖体转移到内质网上有关 miRNA: 干扰基因表达, X染色体失活。56. 人类基因组RNA编码基因（非编码RNA基因）：1) rRNA（18S，5.8S，28S和5S ） 2) tRNA基因共48种，可解读61个氨基酸密码 3) 10种snRNA: U1，U2，U4，U4atac，U5，U6，U6atac，U7，U11和U12 4) 7SL RNA，端粒酶RNA，7SK RNA，Xist RNA等 5) 真核生物rRNA在合成之后要进行广泛的修饰，主要由小分子核仁RNA （small nucleolar RNA，snoRNA）指令修饰的位置。人类基因组草图顺序中发现69个C/D 盒 snoRNA基因，15个H/ACA snoRNA基因。 5) miRNA（生物学功能）: 参与广泛的个体发育与基因调控, miRNA来自mRNA前体, 但不编码蛋白质.57. 如何寻找（得到）miRNA基因：1) 突变体筛选与基因克隆 2) 同源基因顺序搜寻 3) 茎环顺序的分析 4) RNA结合蛋白如细菌中的RNA伴侣蛋白免疫共沉淀分离小分子RNA 5) 小分子miRNA的聚丙酰胺凝胶电泳分离。58. 几种真核类生物转录因子数目比较：拟南芥转录因子基因的数目（1500）远高于线虫（500）与果蝇（700），略底于人类（2000）。 从结构的复杂性观测，拟南芥应比果蝇简单，为何前者的转录因子数量多于后者，这与植物具有复杂的次生代谢产物有关。由于不能通过运动主动躲避环境的压力和侵害，植物只能发展丰富的次生代谢产物来适应所遭遇的生存环境。植物次生代谢产物的种类约50 000种，基因组中约25% 的基因涉及次生代谢，其中包括相当数量的转录因子。59.水稻基因组基因总数（含大量局部重复基因）：1) 水稻基因组基因的确切数目尚未确定. 2) 注释的水稻基因组基因总数(TIGR)为56 674个. 3) 经实验确证的水稻全长cDNA为28 467个,其中可能编码蛋白质的成员约21 596（已进行功能归类）. 4) 水稻基因组的转录单元约在19 000- 20 500之间,许多基因存在可变剪接.60. 细胞器基因的转移与进化：1) 细胞器基因转移到细胞核基因组中是一个至今仍在持续发生的现象. 2) 细胞器基因转移到细胞核之后,必需获得一段转移信号肽的顺序才能使其编码的蛋白质进入线粒体. 3) 在这一过程中会发生两种事件:由于未能获得转移肽顺序, 细胞核中来自线粒体编码的基因最终被丢失或突变; 当细胞核中线粒体基因获得转移肽顺序后, 留在线粒体中的拷贝就失去存在的意义, 将发生丢失或突变成为假基因.61. 高等植物线粒体基因组的结构特点：1) 结构非均一性: 线性和环状DNA共存. 2) 拷贝非均一性: 同细胞不同亚基因组DNA的拷贝数并不相同. 3) 不同种属之间线粒体基因组大小变化很大, 在1202500 kb之间. 4) 动态变化: 不同发育时期,每个细胞线粒体基因组的拷贝数不是恒定的. 5) 分子内重组: 高等植物线粒体基因组中含有大量短序列重复顺序, 它们之间的重组导致大量的DNA顺序重排, 是Mt DNA频繁突变的主要原因.62. 高等植物叶绿体基因组特点：1) 结构紧凑, 基因之间排列紧密, 很少非编码顺序. 2) 不同种属之间叶绿体基因组大小比较恒定, 约在120 kb左右. 3) 动态变化: 不同发育时期,每个细胞叶绿体基因组的拷贝数是不衡定的. 4) 有两段很长的反向重复顺序, 这一结构可有效地阻止叶绿体环状DNA的分子内重组, 这是叶绿体基因组很少发生重排的主要原因.第四章 染色质结构与基因表达1. 表观遗传学：研究在不改变DNA顺序的情况下基因表达出现可遗传变化的学科. 这种表达模式的改变可通过有丝分裂和减数分裂传递给子代. 表观遗传学是功能基因组学研究的重要领域, 是基因表达调控的重要方式之一.2. 表观遗传(epigenetic) 包括以下内容: 1) DNA的甲基化 2) 位置效应 3) 核小体和组蛋白的修饰(乙酰基化和甲基化) 4) RNAi (siRNA和miRNA) 5) 染色质的动态异染色质化(X-染色体的失活) 6) 基因组印记(genomic imprinting) 7) 等位基因的副突变及同源抑制，颠换效应。3. 位置效应：位置效应是指由于基因变换了在染色体上的位置而引起表现型改变的现象。位置效应表明基因的功能以及基因对生物表现型的影响可以在不改变遗传物质本身的情况下仅仅由于遗传物质在染色体上的位置差别而发生变化。位置效应实际上反映了基因组不同区域的特定的染色质结构。（如：-球蛋白质基因座位控制区由增强子活化）4. 花斑型位置效应：当某一基因由于染色体重排从原来的常染色质区移到异染色质区附近, 因异染色质的扩散效应, 造成基因表达的改变. 这种抑制效应的差别使基因表达受抑程度不同, 由此产生嵌合.5. 副突变 (paramutation)：最初在玉米中发现的在杂合子中某一基因影响同一座位上另一等位基因的表型. 副突变在转基因表现型中也已发现, 称为同源抑制.6. 绝缘子（insulator）：这种可以阻止邻近位置激活或失活效应的顺序现在称之为绝缘子。（染色质位置阻隔效应：使绝缘子邻近的基因互不干扰）7. 绝缘子的作用（可阻止相邻基因之间增强子的彼此干扰）：1) 真核生物增强子具有双向作用, 超长距离功能, 从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰问题. 2) 有些基因位于异染色质邻近, 会受到抑制效应的干扰.绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表达的抑制.8. 绝缘子的定向控制（问答：为什么绝缘子的效应具有方向性？即绝缘子插入到转座子不同的位置，会产生什么不同的效应？）：1) 如果插入位置在启动子的5方向，绝缘子将影响上游增强子元件的作用。 2) 如果插入位置在启动子的3方向，只影响下游增强子元件的功能。 3) 如果插入位置不在增强子与启动子之间，绝缘子对增强子无阻隔效应。9. 高等生物基因组普遍存在甲基化：1）DNA分子的化学修饰主要是甲基化，脊椎动物基因组中约60-80%双核苷酸CpG的胞嘧啶（C）被甲基化。被子植物基因组中，甲基化位置主要出现在CpG和CpNpG回文对称顺序，大约20-30%的胞嘧啶（C）被甲基化。DNA的甲基化在基因的表达调控中起重要作用。 2）基因组的甲基化模式可影响表型并能通过体细胞遗传，但不改变细胞的基因型，这种现象称为表观遗传（epigenetic）。10. 染色质结构的不可逆变化与基因沉默：在个体发育与细胞分化过程中，当某些基因已经完成预定的表达程序后必需永久性关闭。这一任务可以通过DNA甲基化促使染色质的重建完成。11. DNA甲基化抑制转座。12. 基因组印记：因为亲本来源不同而使等位基因表达模式发生改变的现象称为印记(imprinting)（例：在杂合子中,如果突变等位基因来自父亲, 表型异常.如果来自母亲,表型正常,即母源Igf2基因在子代被抑制）.它有两个特点: 1）子代的两个等位基因中有一个发生沉默（甲基化所致）, 即不表达. 2）哪一个等位基因沉默取决于亲本来源.13. DNA甲基化与基因组表达程序化：按照去甲基化重新甲基化维持甲基化方向发育。14. 基因组印记的生物学意义：1) 基因组印记使二倍体体细胞中的一个等位基因沉默, 这与二倍体生物学的意义是相悖的, 容易使突变等位基因暴露. 2) 目前已有三种理论用予解释基因组印记的生物学意义: 进化理论: 一组各有缺陷的基因在相互组合时有优势, 为了不被淘汰而暂时沉默. 卵巢期理论: 避免畸胎瘤, 需要胎盘基因沉默. 冲突理论: 血缘关系理论(kinship theory)15. 核小体定位：1) 核小体是染色质结构的基本单位. 2) 核小体是连接DNA和染色体高级结构的中间环节. 3) 核小体核心8聚体与DNA的结合不是随机的. 4) 核小体核心8聚体与DNA的结合位置是动态的.16. 核小体相位：1）核小体相位（nucleosome phasing）指一段顺序确定的DNA与核小体核心8聚体的可变结合方式。例如缠绕在核心组蛋白8聚体上的DNA顺序可向前或朝后移动若干碱基对，从而改变双螺旋大小沟的朝向，也可称为核小体定位（nucleosome positioning）。2）核小体的定位方式：平移定位（translational position）旋转定位（rotational position）17. 旋转定位（rotational position）：缠绕在核小体上的DNA分子总是一面朝外，一面朝内。当移动缠绕在核小体上的DNA时，若改变的顺序少于整圈螺旋碱基对数（10.2 bp），原有的顺序朝向将发生变化。因朝外一侧比朝内一侧更易受到核酸酶的攻击，采用合适的酶处理可检测到这种变化。18. 核小体装配与表观遗传： 1) 虽然有报道表明DNA复制时核小体也采取半保守装配, 但更多的实验证据支持核小体核心8聚体在DNA复制时是保守装配. 2) 由此产生一个问题, 即染色质的表观遗传状态是如何传递的. 现在的证据倾向于,染色质的表观遗传状态可以通过转录时的组蛋白二聚体正向的(开放)或反向的(关闭)代换保持. 3) PolII基因在转录时可通过核小体,会破坏核小体的结构,使H2A-H2B组蛋白丢失,但核小体并没有离开原来DNA的位置. 此时会发生H2AZ取代H2A组蛋白事件.19. 染色质重建依赖于组蛋白的修饰：1) 核小体的修饰是染色质水平进行基因表达调控的中心环节. 2) 核小体修饰的目的是促使核小体核心8 聚体与DNA分子的结合或者松弛或者强化, 便于核小体移动或固定, 使转录调控因子结合或排斥.20. 组蛋白的修饰：1) 乙酰基化(可逆) 2) 甲基化(不可逆) 3) 泛素化(可逆) 4) Sumoylation(可逆) 5) 磷酸化(可逆) RNAi可介导组蛋白修饰21. 组蛋白的修饰乙酰基化：组蛋白乙酰基化是基因在染色质水平表达调控的主要方式之一. 组蛋白乙酰基化使其与DNA的结合松弛, 利于核小体位移.22. 组蛋白Sumoylation：一种与泛素分子类似的小分子修饰多肽(small ubiquitin-related modifier)可与组蛋白结合, 促使组蛋白甲基化, 最终使基因关闭。23. 组蛋白甲基化：组蛋白的甲基化是不可逆的,直接参与染色质的表观遗传.甲基化主要出现在lys位置, 有抑制和激活两种不同的效应.24. 剂量效应：1) 剂量效应系指一个基因因其在细胞中拷贝数的多少而产生表达增强与减弱的现象. 2) 多细胞生物中性别染色体在雌性和雄性细胞中的拷贝数不同, 为平衡基因表达产物的数量,出现整条染色体被抑止或超激活现象.25. 染色体剂量效应可通过基因的上调或下调形式达到：1) 哺乳动物雌性一条X-染色体失活,形成Barr小体; 2) 果蝇雄性X-染色体超表达以达到平衡; 3) 线虫雌性一条X-染色体低表达.第五章 突变体库的构建和鉴定1. 功能基因组学（functional genomics）：基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究 2. 突变体库的建立是功能基因学研究的重要内容和前提条件3. 研究功能基因组的方法：正向遗传学(Forward genetics) 根据表型及其遗传规律确定基因在染色体上的位置，并测定其序列，称为正向遗传学。反向遗传学(Reverse genetics) 而