蛋白质与酶工程 期末考试资料.docx

第一章 绪论1、蛋白质工程: 广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。2、蛋白质工程的研究内容：（1）确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。（2）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。3、酶工程：酶工程（ enzyme engineering ）是指从细胞和分子水平上对酶进行改造和加工，使酶最大限度地发挥其效率的过程。虽然目前已发现少数酶具有核酸本质，但目前一般所指的酶工程主要对象是化学本质为蛋白质的酶类 。4、酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。5、酶的分类：主要由蛋白质组成蛋白类酶（P酶）主要由核糖核酸组成核酸类酶（R酶）6、“基因工程发酵工艺先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。7、酶的催化作用特点： 催化效率高、 专一性强、 反应条件温和、 反应容易调节控制、 需要辅因子参与作用8、生物技术的四大支柱：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程。基因工程：“剪刀+糨糊”跨越物种界限的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术。酶工程：让工业生产高效、安静而环保的工程。发酵工程：将微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。第二章 蛋白质结构基础9、在有机体内通过生物合成连接成多肽链，其顺序由编码基因中的核苷酸三联体遗传密码决定。 10、20种常见氨基酸中，19种都具有如下共同的化学结构： RH2N-CH-CO2H另有一种脯氨酸具有类似而不相同的化学结构。11、 20种氨基酸在蛋白质中是通过肽键(peptide bond)连接在一起的。一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接称为肽键： 12、结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域(domain)。第三章 蛋白质分子的设定13、大改、中改、小改、第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；定义：是指在蛋白质中替换1个肽段或者1个结构域第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo protein design）。14、蛋白质设计的原理：内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。 所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。（2个因素）所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。 对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。 最优的氨基酸侧链几何排列。 结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。实践表明这是蛋白质设计最困难的问题。第四章 蛋白质的修饰与表达15利用基因融合技术表达外源基因的缘由外源蛋白易被宿主的蛋白水解酶水解，可以通过产生融合蛋白避免目标基因产物被快速降解，稳定表达产物的产率。通过与一特异性蛋白质或者其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物达到快速、有效的回收、纯化。与特定肽段进行融合表达，可将表达的蛋白质定向地定位在宿主细胞的不同区位。通过同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通过体外切割去除融合部分，是获得天然蛋白的可靠和可重复的方法。通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，如与硫氧化还原蛋白形成融合蛋白，可使外源蛋白改变在细胞内的溶解性，防止包涵体的产生。基因融合也是对基因进行改造的手段，广泛应用于蛋白质结构功能的研究。16、哺乳动物细胞表达体系的优点：1、哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。2、哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。17、表达载体的一般特点：(1) 复制起始点，绝大多数载体利用pBR332或pUC质粒来源的复制起始点。复制起点决定了细胞内质粒的拷贝数，这样也决定了细胞内目标基因的数目。(2) 选择性基因 ，载体上至少含有一个选择性基因。 作用：对转化体的确定；在培养过程中使受体细胞保持质粒不丢失。选择性基因往往是抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、四环素及卡那霉素抗性基因。(3) 强的、可诱导的启动子 原核细胞的启动子作为RNA聚合酶的识别和结合位点，使得RNA的转录有效起始。(4) 强的转录终止序列 (5) 核糖体结合位点 在启动子的下游区和翻译起始密码ATG上游区要有核糖体结合位点（SD序列），对原核细胞mRNA翻译起始至关重要。(6) 合适的多克隆位点，用于将目标基因插入到表达载体18、两个主要的哺乳动物细胞表达系统:瞬时表达系统和稳定表达系统.第六章 酶的固定化19、固定化酶：是指在一定空间上呈闭锁状态存在的酶,能连续的进行反应,反应后的酶可回收重复利用.20、固定化酶的优缺点：优点：1、多次使用，2、可以装塔连续反应3、纯化简单4、 提高产物质量5、应用范围广缺点：1、首次投入成本高，2、大分子底物较困难21、评价固定化酶的指标是酶活单位和酶活力单位。1 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 计量单位2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位。品质的体现22、酶的固定化方法：（一） 吸附法（二）结合法（三）交联法（四） 包埋法23、原生质体：原生质是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。第七章 酶的化学修饰24、 酶的活性中心: 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.。25、 酶由活性中心、必须基团、菲必须基团组成,26、酶活性中心的共同特点：(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。27、改变酶特性的方法：分子修饰和基因工程28、小分子修饰：通过选择性的试剂或者亲和标记试剂与酶分子侧链上的特点的功能基团发生化学反应。29、酶化学修饰的基本原理：1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境30、酶化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为蛋白的化学修饰。第八章 抗体酶31、抗体酶：抗体酶又称催化抗体，是酶的高效催化能力和抗体的高度选择性巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。 32、抗体酶与天然酶相比其优势何在？（1）抗体酶可以达到专一催化某一底物转化的反应。 （2）抗体酶能催化那些理论上认为非常不利的反应。（3）抗体酶能催化那些天然酶不能催化的反应。 (4) 不仅提供了人工生物催化剂，而且提供了研究生物催化过程的新途径。33、抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择性结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。34、 核酶（ribozyme）泛指一类具有催化功能的RNA分子。一般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。35、影响核酶活性的因素:1、pH值对活性的影响：pH7.0-7.5时核酶活性最高；2、二价金属阳离子对活性的影响：如Mg 2+ Mn 2+； 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；4、变性剂对活性的影响;核酶的切割效应5、温度对活性的影响：在65范围内随温度升高而增加，37 时均有适宜的活性。第九章 酶反应器36、酶反应器：用于酶催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。37、理想的酶反应器的要求;(1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度 （或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。(2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。(4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。38、常见酶反应器的类型：1、按结构区分：a搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）、b鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )、c填充床式反应器(packed column reactor, PCR )、d流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)、e膜反应器(Membrane Reactor, MR) 2、 按操作方式区分:a间歇式反应(batch ) 、b连续式反应(continuous ) 、c流加分批式反应(feeding batch ) 3、 混合形式a连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、b分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR） 4、根据所使用的酶区分:a溶液酶反应器、b固定化酶反应器39、各种酶反应器的类型及特点反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反应器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。鼓泡式反应器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难 喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适