（蔬菜学专业论文）红叶芥（Brassica+juncea+Coss）种质资源红色素性质及LCMS成分研究.pdf

中文摘要 红叶芥 c = o 、_ n = n 、n = 0 等，助色团有一q h 、一 o r 、n h 2 、一b r 等。有机化食物中如只有上述发色团单独存在，则化合物仍为无色，它只 能吸收能量较高，波长较短的紫外线，激发其中价电子低能阶激发到高能阶，如 c = c c = c 9 0 【2 9 1 。栀子黄色素和b 环糊精可形成1 ：l 包合物【3 0 】。对油溶性的 辣椒红色素，采用混合乳化剂进行改性后用琼脂、阿拉伯胶进行赋型，可获锝具有良好水 溶性的产品m 1 。 1 2 。5 。2 调色添加剂豹结构修饰 花色苷颜色易随p h 变化，这是由其c 2 位水化引起的，通过掩盖c 2 位，就可以抑制 水化反应，稳定花色茜。稳定化作用可添如多糖类、配稽体、酚类以及有枕酸，其中研究 最多的是添加有机酸进行酰化掩盖c 2 位，所用的酸有4 一香豆酸、阿魏酸、咖啡酸以及芥 子酸等1 。 1 3 花色苷类色素 1 3 1 花色苷类色素的概述 花色苷( a n t h o c y a n s ) ：一类水溶性的红色色素，使许多花，水果，蔬菜具有鲜艳的颜色。 花色苷类( a n t h o c y a n i n ) 是类黄酮化合物中的一类，而且是一类最为人们所熟悉的天然色 素，对大量植物以及他们的制品的监、紫、紫罗兰、洋红、红以及橙等色泽起着主要的贡 献协。花色素( a n t f l o c y a n i d i n ) 是花色的母体色素。花色素一词最早由凇r q u a r t ( 1 8 3 5 ) 提出，用来描述花卉中的一种水溶性的色素，m o r o t ( 1 8 4 9 ) 成功地分析出矢车菊的蓝色色 素是由c ，h o 三种元素组成的1 3 引。对花色素详细的化学分析始于】9 世纪末和2 0 世纪初，从 9 两南人学硕十学何论文 大量的研究结果来看蚓。参与花色形成的大部分色素属于类黄酮( f l a v o n o i d ) 或属于类胡 萝卜素( c a r o t e n o i d ) ，也有些色素不属于上述两类化合物中的任意一种，如甜菜色苷 ( b e t a c y a n i n ) 和甜菜黄质( b e t a x a n t h i n ) ，但这些色素种类少，而且仅存在于特殊的植物 中b 3 3 。但不论哪种色素都是植物的二次代谢产物次生代谢产物( s e c o n d a r yp l a n t p r o d u c t s ) m 1 。花的颜色主要由类黄酮及类胡萝卜素等化合物来决定俭9 3 3 i 。其中又以类黄酮 类中的花色素最为重要，因为它及其相关产物提供了黄色、红色、橙色、蓝色及紫色等色 素成分：类胡萝卜素的颜色范围很窄，仅提供黄色至橙色系列的色素m5 2 1 。在天然状态f ， 类黄酮以糖苷( g l y e o s i d e ) 的形式存在。脱糖后的部分羁q 糖菅配基( a 9 1 v c o n e 。花色素苷 ( a n t h o c y a n i n ) 的糖茁配基称为花色素( a n t h o c v a n i d i n ) ”引。 1 3 2 花色苷成分及化学结构的研究 所有的花色苷都是2 一苯基一苯并吡喃阳离子结构的衍生物，它的种类很多，人们对不 同植物所含花色苷的种类、结构的研究报道较多，其分离鉴定的方法也有很多种。如纸层 析法旧1 、光谱鉴定法忙引薄层层析法，引、高效液相色谱( h p l c ) 法隋卜眈1 ，液相色谱一质谱联用 ( l c 一髑) 技术及液相色谱核磁共振联用技术( l c 一嘲r ) 等。高压液相色谱( h p l c ) 是植 物化学研究中的一种常规分析技术，己被广泛应用于天然产物的分析、分离( 包括制备型分 离) 、纯化以及检测化合物的纯度等方面n 2 删。与这一高效分离技术联用的一些重要分析技 术分析仪器，如l c u v p a d ，l c m s 和l c n m r 等，通过h p l c 与上述不同波谱检测器的结 合使用，使得在对一个复杂混合物经h p l c 分离的同时可记录每个色谱峰完整的在线波谱学 数据n 6 ，77 j 。植物粗提物是个非常复杂的混合物，其所含化合物可达数百种之多，对其中每 一个成分进行分离、纯化及结构鉴定是一项耗时费力的工作，液相色谱波谱( 紫外、质谱 及核磁共振) 联用新技术的出现，成功的解决了这一难题h 引，目前，在发达国家这一新技术 己被广泛应用于植物粗提物有效成分的快速筛选分析研究中，大大加快了植物有效成分的 研究速度和发现新化合物、先导化合物的几率”9 1 。目前，质谱是天然产物分子结构分析最 灵敏最可靠的方法之一它不仅可以给出化合物的分子量、分子式，而且还可以提供有关 化合物的结构类型等重要信息。由于质谱仪的高分辨能力，在测定天然产物结构时的灵敏 性，准确性，选择性均非常好。液质联用技术( l c 嘲s ) 在天然产物化学中的应用始子2 0 世 纪8 0 年代中期，是对植物粗提物进行快速筛选分析的重要工具。本研究以红叶芥为材料， 对其花色素的提取、精制、稳定性、组成及化学结构等方面的性质进行了试验研究- 旨在 为充分利用这一天然色素资源提供科学依据，同时也为更进一步的研究奠定基础。 1 3 3 花色苷类色素的类型、结构及存在 花色苷类色素以糖苷形式存在，称花色苷，很少有游离的花色素。自然界广泛分布的花 色素以天竺葵色素( p e l a r g o n i d i n ) 、矢车菊色素( c y a n i d i n ) 。飞燕草素( d e l p h i n i d i n ) 、 i o 第l 章文献综述 芍药花色素( p e o n i d i n ) 、牵牛花色素( p e t u n i d i n ) 及绵葵三素。其糖基多为葡萄糖、鼠李 糖、半乳糖、木糖和阿拉信糖等。两菲糖部分多以3 ，5 ，7 一三羟基花色基原盐酸盐衍生而来。 已知有2 0 多种，食物中重要的有6 种，表l 中是其名称及结构，图l 是花色苷类色素的母体 结构，表2 是不同种花色苷色素在不同键上的取代基。 表1 花色苷类色素名称 t a b i e1 t h en a m eo fa n t h o c y a n i d i n s r 5 图1 花色素分子结构图 f i g 1t h es t r u c t u r eo fa n t h o c y a n i d i n s 表2 花色苷类色素的结构分析 t a b l e 2t h ea 姐i y s eo fs t m c t u 他o f t h o c y 柚i d i n s 1 3 4 花色苷类色素的理化性质的研究 花色苷为水溶性色素，易溶于甲醇、乙醇、水及它们所组成的混合溶齐j j ，不溶于右油醚、 乙醚等非极性溶剂m 1 。花色素苷在可见光范围内有特征性吸收峰，光谱中产生不同波长的吸 收峰主要是由于花色素中萤元的结构不同而引起的，但其最人吸收峰均在5 0 0 一5 6 0 n m 范围内 m 驯。花色苷是天然物中不稳定的一类化合物门，由于它在p h 值的变化、光照、温度、氧化剂、 还原剂以及某些金属离子等的作用下会发生变化，给研究和利用花色素带来了困难。因此， - 两南人学硕十学1 ： 7 ：论文 对于花色苷色泽变化的研究，引起了越来越多研究者的重视旧“蛇7 卜驯。花色苷呈不同的色泽。 ( 1 ) 与结构有关( 羟基。甲氧基) ：增加羟基基团的数目，可使其蓝色增加，增加甲氧基基团使红 色增加；( 2 ) p h 值：花色苷分子中氧原子为四价，具有伪碱基性质，与酸形成盐；又具有酚羟 基，有酸的性质，可与碱生成盐。冈此，分子结构随p h 变化而改变，使颜色变化。以矢车菊色 素为例：酸性d h 呈红色，稀碱溶液( p h 8 一l o ) 呈蓝色，p h 1 1 时，很快水解成完全离子化的无色 或浅黄色的无色查耳酮心8 l ；( 3 ) 与c a 、m g 、m n 、f e 、a 1 等金属络合，生成紫红色，蓝色或灰紫 色色淀，不受p h 影响而变色；( 4 ) 对光和温度极敏感：含花青素较多，光照、较高温度下很 快褐变；( 5 ) s o ：可使花色苷退色呈微黄色，不是由于氧化还原或p h 值变化，而是加成反应：( 6 ) 氧或氧化剂存在下极不稳定，反应机理尚不清楚，可能酚羟基被氧化成醌；( 7 ) 与盐酸共热生成 无色花色苷，一定条件下可转变为相应有色花色苷；( 8 ) v c ，酚及糖的衍生物，可能与花色苷直 接缩合加速失色：( 9 ) 一些酶反应也会使花色苷失色幢引。 从以上可知，花色苷本身是不太稳定的，相对来说，它在酸性条件最为稳定。他们可以 通过不同途径，降解为无色的或棕色的可溶或不可溶产物。在花色苷的葶取、纯化过程，或 食品加工和储藏过程当中，都会发生这种降解反应。了解影响花色苷稳定性的因素以及降解 机理，对于他作为添加荆的应片j 是至关重要的，而且也有助于对他进行更加有效的纯化。影 响花色苷稳定性的主要因素有p h 值、温度、氧以及光的存在，但是酶的降解以及与食品组分 ( 如抗坏血酸、金属离子、糖类以及辅色素等) 也较为重要旧1 。以下将着重阐述p h 值、温度、 氧以及光的存在、酶的降解对花色苷的影响。 ( 1 ) p h 值天然色素中的黄酮类、花色苷类，随着p h 值的变化而发生色变的现象比较常 见。如酸枣色素在酸性条件下呈褐黄色，碱性时! i ! i j 是呈红色；玫瑰茄红色素在不同p h 值条件 下的吸收曲线不一样，呈现的色泽也不同，p h 值为4 时呈鲜红色，p h 5 6 时为橙色，p h 7 以下 则为青紫色。有些天然色素在不同酸碱度情况下，对光、热、氧的稳定性亦有不同。如辣椒 色素在p h 为4 时的溶液中照射6 天的色差是p h 为8 的8 倍：虫胶色素在不同p h 下加热至 1 2 0 l 小时色差也达数倍。花色苷类色素，如高粱红等，在酸性或碱性条件下加热易发生水 解反应，引起色变或溶解性变化。表现为褪色或混浊。食品作为被着色染料，其p h 值一般在 2 o 一8 o 之间。因此在使用天然色素时必须注意食品本身的p h 值，应选择在该p h 条件下稳定性 好、色泽匹配的色素，不得已时可以在食品性质、风味不变化的情况下，适当调节p h 值，以 适应色素的稳定性要求，但必须进行充分的预实验9 “。 ( 2 ) 金属离子金属离子的存在对某些天然色素稳定性的影响非常明显，它可以直接和色 素发生反应引起色变，也可以在贮藏过程中促进氧化反应，加速褪色。如姜黄色素可以在铁 离子作用下变为墨绿色、褐色等；栀子黄色素在铁、铜、锡作用下可发生吸收峰的变化及消 失，并有严重褪色。因此在使用天然色素时，应选择不锈钢以及耐酸碱的陶瓷、搪瓷、玻璃 制品作为生产容器，对生产用水必先软化，或者在食品中添加适当的金属离子螯合剂，如植 酸、柠檬酸等。金属离子螯合剂可与金属离子生成性质稳定的络合物，消除其影响，而且不 1 2 第1 章文献综述 会影响食品本身的质量。如在辣椒色素配制的饮料中加入适量的螯合剂，如丙氨酸、甘氨酸、 均能合金属离子，使其失去活性，同时义可增加食品营养，并具备定的抗氧化作用。 ( 3 ) 氧化作用氧是生物界不可缺少的活性元素，可以与所有元素反应生成氧化物，因而 对食品中的各种成分均有不同程度的影响，天然色素也避免不了。在使用天然色素时，应尽量 避免长时间与氧接触，包装时可采用真空软包装或充入惰性气体，也可以在不影响食品风味的 前提下加入适量的抗氧化剂。如维生素c 、维生素e 、卵磷脂、亚硫酸钠及氨基酸等，必要时 可以加入两种以上的抗氧化剂。但是必需进行预实验，否则可能起不利抗氧化的作用。在实 验中发现，有些抗氧化剂合用时有增效作用，有些则有拮抗作用。如硫代硫酸钠与维生素e 合用作为辣椒色素的抗氧化剂对效果很差，褪色速度比空自色素液还高一倍。丽在1 9 0 的高 温下，从茶叶中提取的天然抗氧化剂与卵磷脂合用时，其抗氧化效果可提高4 0 。 ( 4 ) 温度这里所说的温度是指食品加工温度，而不是指食品贮藏温度。贮藏温度主要受 外界气温影响，般条件下很难予以控制，尤其大批量食品的贮藏。食品加工温度是可以根 据食品特性予以调控。天然色素用于食品着色时，多数情况下首先接触到热，因而加热温度 是影响天然食用色素稳定性的重要因素。减轻温度对天然色素色变的影响，可以根据所用天 然色素及被着色物料的特性适当调整加工温度，尽可能进行低温操作。另外，色素的加入最 好设计在工艺的末端，尽量缩短加热时间。 ( 5 ) 光无论是天然色素本身的贮藏，还是被着色食品的加工贮藏，随时都有可能被光线 照射进而引起许多色素的颜色变化，影响食品的质量。在光线中以紫外线对色素的影响最 大，其次是可见光及红外线。日光灯光线的能量分布近似太阳光，对色素的影响作用也近似 于太阳光，这一点往往被人们忽视。对于这类天然色素的应用，除在加工过程中予以遮光外， 成品的贮藏避光则更为重要，一定要选购透光性差的有色包装材料制作包装，对其色变起到 很好的防护作用忉1 。 另外，酶也是一种重要的影响因素，对色素的分子结构破坏很大，例如，类胡萝卜素易 被脂肪氧化酶、过氧化等催化氧化；花色苷色素在花色素酶作用下水解，极不稳定，迅速分 解并褪色。因此，加工贮藏和包装之前，必须破坏或抑制酶的活性，如采用蒸汽漂白，添加 的竞争性抑制剂等吲。 如上所述，天然色素的褪色、变色是由诸多复杂的因素引起的，它们不仅对天然色素独 立产生影响，还可能有明显的相乘作用，再加上加工食品的原料、制造、工艺、杀菌方法、 包装形式等影响，因此天然色素变色的原因十分复杂的。要解决这一问题，首先要了解天然 色素的特征，考虑其自身结构等性质，此外将天然色素精制纯化也是其提高稳定性的有效途 径。最有效防止变化的手段是在在加工、包装、流通过程中消除引起变色、褪色的根源，即： 保持稳定的p h 值范围，低澡加热，与酶隔绝。低温。卜 流通。另外，还要开发专用包装材料、 机械等。例如：隔绝酶的薄膜，瞬间杀菌装置等啪盼9 1 1 。 但是对于食品着色这些方法都不完善，还有许多不适应的地方，所以在天然色素的稳定 1 3 两南人学硕十学俯论文 化方面，要根据不同重要条件，采取相应的稳定化方法，如使用稳定剂、抗氧化剂、对大然 色素的结构进行化学改性等等以提高其稳定性。现在还可以采用一项新技术一微胶囊技术 来提高大然色素的稳定性蝣。此项技术是利用可形成胶囊肇或膜的物品，将食用天然色素作 为核心物质包裹、固化、脱水、使之与环境中的不利因素隔绝，从而达到保护核心物质的高 技术。这种技术可以改善非水溶性物质在水中的分散性，显著扩大其在食品中的应用面。现 已进行了这方面的深入研究m 1 。 以上所述，稳定化技术还有待于进一步研究与改善。目前对天然色素褪色、变色的化学 结构仍不十分清楚，稳定剂对天然色素的稳定机理也不十分清楚，但己为天然色素的使用创 造了条件。总之，使用天然色素时必须根据具体情况，综合考虑，充分实验，选择理想的防 护措施和稳定化技术，才能获得最佳效果。 1 3 5 花色苷类色素的作用 1 3 5 1 在园艺学和分类学上的应用 花色素是植物所特有的多酚类化合物，是由类黄酮代谢所衍生的化合物哺2 4 3 。 花色素的结构是影响花色的主要冈子，会因所携带羟基的多少、甲基化的程度、糖基化 数目、种类及连接位置的不同等而早现出不同颜色，使花色素产生广泛的颜色变异43 7 ，2 8 1 。影 响花色素苷表现的因素还和细胞的p h 值n 吲、共色素与花色素苷的共色作用n 睁川、金属络合 物n 0 7 。川以及花瓣细胞形状有关“1 坨1 。花色素的存在及累积使植物具有较高的圊艺价值n 1 3 ，川1 ， 并可作为分类学的标准州1 9 1 ，利用转基冈技术，还可以改变和创造新花色n 2 0 堙。 1 3 5 2 在食品工业中的应用 近年来，随着医学毒理学和生物学研究的不断深入，发现曾允许使用的人工合成食用 色素中，大多数种类对人体都有不同程度的伤害，尤其是致癌、致畸、致突变，己引起人 们的高度重视2 2 1 2 4 1 。随着对天然食用色素的某些生理活性作用的逐步发现，天然食用色素 将会越来越受到重视和喜爱，天然食月j 色素逐步取代人工合成食用色素是历史发展的必然 趋势。国内外科学工作者对天然食用色素的研究十分活跃陋“堙5 。1 2 8 1 。其中，对于花色素昔提 取物重要的生理作用己得到证实n 2 引。特别是天然花色素苷作为食品添加剂具有果香味，水 溶性好，安全性高等显著优点，因而国内外公认花色素苷是作为替代合成食用色素的最为 理想的天然色素n 2 7 m 1 3 1 1 。并且，可利用现代科学技术，将某些花色素苷基因转入食品中， 开发出具备相应生理功能的保健食品3 引。2 0 0 4 年2 月，新华社报道。美国科学家培育出一 种新型转基因两红柿，它因其中含有一种名为花色素苷的物质而呈现出奇异的紫色，还具 有预防癌症和心肌梗塞的功能删。 1 3 5 3 在化工工业中的应用 1 4 第1 章文献综述 早在几千年前，我国古代劳动人民就有把风仙花的花瓣捣碎，加入少量明矾，用来染指 甲，故风仙花义俗称“指甲花”。其在纺织品上的应用也早已存在，至今一些少数民族服饰蜡 染、扎染所用染料均来自天然色素。天然色素被广泛用于化妆品、印染等化工工业，有着巨 大的优势，它无毒无害，来源丰富，属可再生资源，利于生态，其经济效益和社会效益可观| 1 3 4 1 3 5 】 1 3 5 4 在医学上的应用 花色素苷具有清除氧自由基及抑制脂质过氧化的能力n 驯矧，并且对d n a 和肝脏的氧化 性损伤具有保护作用n 矧：花色素苷作为酶的非竞争性抑制剂能够极大地抑制体外不饱和脂 肪酸的酶促过氧化反应柏1 ，还能抑制络氨酸酶活性以阻l 卜黑色素( 如雀斑、老年斑) 形成： 花色素苷具有降低高血脂大鼠的甘油酯水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代谢的作用n 训： 具有抑胆固醇吸收、降低低密度脂蛋白胆同醇含量、抑制动脉硬化的功能u 柏1 以及抗突变“矧、 抗肿瘤n 4 5 1 、抗过敏、保护胃粘膜n 劓1 和降低血糖水平作用n 4 2 1 等众多的生理功能，因此，在医 学领域有着广泛的应用。 1 5 两南人学硕十学仲论文 第2 章引言 芥菜( b ，哪s f i 叩加力c c 幻s ) 是十字花科芸薹属( 胁s s j c a ) 的重要作物，在我国有两千 多年的栽培历史，种类繁多，资源及其丰富。芥菜分布遍及全国各地，在长江以南地区种植 尤为广泛。 芥菜即可鲜食也可加工，其产品器官加工成为榨菜，被誉为世界三大名腌菜之一。榨菜 质地脆嫩、风味鲜美、营养丰富，享誉国内外，远销世界各地，成为中国的特色出口蔬菜之 一。近年来随着国际市场对芥菜产品需求量的增大，芥菜加工业迅速发展，并且带动了为其 配套的香料、佐料、陶瓷和运输业的等的发展，在改善经济条件、提高农民收入、发展乡镇 企业、提供就业机会以及出口创汇方面起着重要的作用。 红叶芥是芥菜当中一个非常独特的资源，为根用芥菜，叶片从幼苗期开始到采收期都呈 现红色，色泽鲜艳。由于红叶芥从苗期到成株期均可取叶提取色素，不受季节限制，而红萝 卜等根茎作物需等到产品器官充分成熟后才能取根茎提取色素，受到发育阶段限制，因此， 红叶芥红色素利用上要优于根摹类作物。而且红叶芥在我国栽培面积广，产量高，所以可作 为天然色素开发利用的良好资源。 如果经过研究，在利用了红叶芥的根之后，可以利用叶的红色素作为生产之用，做到根 叶兼用。其所具有的价值将大人增加。因此，研究红叶芥红色素提取的最优条件、成分组成 和性质是本篇论文的目的。 在生产上，色素分为合成色素和天然色素。合成色素多是苯胺类化合物，做食品添加剂 会扰乱人体的正常组织细胞，形成肿瘤，具有致癌和致畸性，甚至导致多种疾病。因此，许 多发达国家已经禁止使用合成色素。而天然色素种类繁多，原材料成本低，色调自然，具有 无毒和营养价值高等特点，适合人类使用，如果可以充分开发利用，不仅对人类的健康是一 种保证，而且对经济的可持续健康发展具有很深远的意义。 目前，天然色素多是从植物中提取，这种色素以其多样性和再利用性受到广大的青睐。 来自植物的红色素种类有多种，如甜菜花青素、玫瑰茄色素、紫草色素、番茄色素等。他们 在食品工业、化工工业、医学上的应用都十分广阔。 我国天然色素种类丰富，可开发利用的品种很多。红叶芥色素为一种天然植物色素，安 全性好，兼有营养和药用作用，提取方法简单，为水溶性和醇溶性色素，色泽稳定性较好。 如果能通过研究得到红叶芥的红色素为以上某一种或某几种色素，并掌握红叶芥红色素的稳 定性能，将可以更好为利用此种色素提供有利的依据。 如何提高红叶芥红色素的稳定性，调控红叶芥红色素的含量，对丁红叶芥红色素的开发 和推广都有重要的理论和实践意义。本论文在前人研究的基础上，筛选了红叶芥红色素的最 佳提取、稳定条件，研究了红叶芥红色素性质，为进一步开发利用这丰富的天然资源提供 科学依据。 1 6 第3 章材事： j 方法 第3 章材料与方法 3 1 材料 3 1 1 试验地点：题南大学重庆市蔬菜学重点实验室 3 1 2 供试材料：红叶芥菜( 根用芥菜，见附图卜5 ) 3 1 3 主要药品、试剂 乙腈( h p l c 级) 、甲醇( h p l c 级) 、三氟乙酸( h p l c 级) 、无水乙醇、h c l 、乙醚、环己烷、 三氯甲烷、石油醚，苯、乙酸乙酯、丙酮、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸( v c ) 、苯甲酸钠、 冰醋酸、氢氧化钠、异丙醇、谷氨酸、赖氨酸、n a h 2 p 0 4 、f c c l 3 、f e s 0 4 、c u s 0 4 、m g s 0 4 、 z n s 0 4 、1 s 0 4 、a l c l 3 、k c l 、n a c l 、c a a 2 、 2 0 2 、n a 2 s 锈、阳离子离子交换树脂( 沧埘宝恩 化工) 、a b 8 大孔吸附树脂( 沧州宝恩化工) ( 以上试剂除特殊标注外，均为分析纯) 。 3 1 4 仪器设备 真空旋转蒸发仪( r e 5 2 9 8 ，上海亚荣生化仪器厂) 、液质联用仪( 美国a g i l e n t 公司，a 舀l 甜t l l o o 系列) 、紫外可见分光光度计( 日本岛津，u v _ 2 5 0 lp c 型) 、电子天平( m e t t l e r a e 2 4 0 。上海) 、 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司，s h b i i 型) 、数显温控仪( 天津中环试验电炉 有限公司) 、纯水制备仪( m i l l i p o r e ) 、酸度计( p h s 2 ，上海第二分析仪器厂 、烧杯、三角瓶、 水浴锅( h h s 型江苏省医疗器械厂) 、冰箱、容量瓶、漏斗、温度计o 2 0 0 、液管、布式漏斗、 切割刀、烘箱舢e 5 0 0 a o ，德国) 、真空浓缩瓶、试管。 3 2 试验方法 3 2 1 红叶芥红色素的提取流程 红叶芥叶片，研磨后用p h = 3 的乙醇溶液浸提，布氏漏斗过滤，得色素提取液，避光低温 保存。备用，流程入下。 1 7 两南人学硕十学何论文 3 。2 2 红叶芥红色素的定性分析 ( 1 ) 显色反应：i 盐酸一镁粉反应：取色素提取液5 i n l ，加入少许镁粉，振荡后，加入几滴盐酸， 看色素液是否产生气泡，颜色有无变深：另一组试验，不加镁粉，只加盐酸，观察有无气泡产 生；i i 中性醋酸铅反应：取色素提取液5 n l l ，逐滴加入新配制的饱和中性醋酸铅溶液，观察是 否有沉淀产生；i i i 三氯化铁显色反应：取色素提取液5 n l l ，加入1 f e c l 3 溶液，振荡观察现象。 ( 2 ) 红叶芥红色素在不同溶剂中的溶解性：比较色素是否溶解于水、1 0 盐酸、1 0 氢氧化钠、 无水乙醇、3 0 乙醇、甲醇、乙醚、环己烷、三氯甲烷、石油醚、苯、乙酸乙酯剂，重复三次。 ( 3 ) 红叶芥红色素的最大吸收峰测定：用5 0 乙醇溶液3 m l 作为提取剂，在6 0 下对1 9 红叶 芥进行浸提，l h 后，把色素浸提液放入3 c m 的比色皿中，以蒸馏水为空白作对比，用阱1 8 0 0 光光度计在2 0 卜8 0 0 姗波长范围内，对其进行吸光度的测定，判断其在可见光处的最大吸 收峰，重复三次。 3 2 3 红叶芥红色素提取条件的正交试验研究 提取结果的好坏受到多种因素的影响，其中包括提取温度、提取时间、物料配比等。经 预备可知，在提取红叶芥色素过程中最主要的影响冈素分别是物料比、浸提时的温度和浸提 时间，因此安排3 因素3 水平的正交试验【7 1 ，采用p h = 3 的不同浓度乙醇进行提取，在物料 比为：l ：3 0 、l ：6 0 、l ：9 0 ，时间分别为：0 5 h 、1 5 h 、2 5 h ，温度分别为：5 、3 5 、6 5 的条 件下进行提取，在最大吸收波长下测定不同条件下浸提液的o d 值，并根据正交试验安排，来 确定红叶芥红色素最优提取条件，重复三次。 3 2 4 红叶芥红色素花色苷稳定性试验 ( 1 ) p h 值对花色苷稳定性的影响：用柠檬酸一磷酸二氢钠配制p h = 卜1 4 的缓冲溶液，调节卜1 4 的色素溶液混合。观察色素溶液的颜色变化，以及p h 为l 、3 、5 、7 、9 、l l 、1 3 时最人吸收 波长5 3 6 处的吸光度，重复三次。 ( 2 ) 金属离子对色素稳定性的影响：1 ) 用f e c l s 、f e s o t 、c u s o t 、m g s 0 一、z n s 0 4 、m n s o t 、a 1 c l s 、 k c l 、n a c l 、c 1 2 配带0 成含f e 3 +、f e 2 + 、c u 2 + 、 m 矿+ 、 z n 2 + 、m n 2 + 、a 1 3 +、k + 、n a + 、 c a 2 + 等金属离子，浓度为o 0 2 5m o l 几的p h 为3 色素水溶液作比较，观察颜色变化，以及在 最大吸收波长5 3 6 处的吸光度，重复三次：2 ) 再用以上金属离子且浓度为0 0 2 5m o l 几、0 0 5 m o l l 、o ，lm o l l 、o 2m 0 1 几的p h 为3 色素水溶液，室温放置l h ，观察不同离子影响下颜 色的变化，并在5 3 6n m 处j 1 4 | l 定其o d 值的变化，重复三次；3 同时用以上金属离子，浓度为 2 、4 、6 、8 、1 0 的p h 为3 色素水溶液，室温放置l h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 在5 3 6n l i l 处测 定其o d 值的变化，重复三次。通过计算色素残留值( 色素残留值= a 5 b ：a = 5 小时的0 d 值之和，b = 对照0 d 值) 。 1 8 第3 章材= ： j 方法 ( 3 ) 食品添加剂对色素的影响：配制含氯化钠、麦芽糖、葡萄糖、v c 、苯甲酸、水杨酸、柠 檬酸、蔗糖，浓度为2 、4 、6 、8 、10 9 6 的p h 为3 色素水溶液，室温放置l h 在5 3 6n m 处 测定其o d 值的变化，重复三次。通过计算色素残留值( 色素残留值= a 5 b ；a - 5 小时的 o d 值之和，b = 对照o d 值) 研究这些食品添加剂对色素的影响。 ( 4 ) 氧化剂对色素稳定性的影响：以h z 晓为氧化剂，配制不同浓度( 1 、2 、3 、4 、5 、6 、 5 0 、2 0 、3 0 ) 的h ：0 2 色素水溶液，室温放置o h 、1 h 测定其在最大吸收波长处的吸光度，重 复三次。 ( 5 ) 还原剂对色素稳定性的影响：以n a ：s o s 为还原剂，配制不同浓度( o 2 、o 6 、o 9 、1 2 、 1 5 、l 。8 ) 的n a 态0 3 色素水溶液，室温放置l h 测定其在最大吸收波长处的吸光度重复三 次。 ( 6 ) 光对花色苷稳定性的影响：i 取色素提取液分别在避光、室内自然光、室外自然光照射 情况下，分别在0 h 、3 h 、5 h 、7 h 、9 h 、1 2 h 定时取样，测定其在最大吸收波长处的吸光度；i i 将色素液体放在密封透明玻璃瓶中，放置于室内自然光下。一月内每天取色素液体进行0 d 值 测量，看其衰变程度。 ( 7 ) 温度对花色苷稳定性的影响：取色素提取液分别放置在5 、2 5 、4 5 、6 5 、8 5 下恒温l h ， 冷却至室温后，测定其在最大吸收波长处的趿光度，重复三次。 3 2 5 红叶芥红色素精制方法的研究 ( 1 ) 预处理 1 ) 树脂预处理：i 将树脂先用蒸馏水充分淋洗，再用8 0 乙醇溶液浸泡2 4 h ，过滤，乙醇 溶液反复冲洗，以去掉残留在树脂中的溶剂；ii 活化树脂；5 h c l 溶液浸泡z 4 h 后。用蒸 馏水洗至中性；i i i2 n a o h 后溶液浸泡2 4 h ，用蒸馏水洗至中性，备用。 2 ) 色素预处理：取色素于粉、蒸馏水，以i ：3 0 的比例对色素进行还原。即，】0 0 9 色素 干粉加3 0 m 1 蒸馏水。 取一定量的阳离子交换树脂x a d 一4 ，加入蒸馏水，搅拌滤水，再清洗一次，放置2 4 h ，与 水一起装柱，分别用1m o l 几的n a o h ，蒸馏水、l m 0 1 l 的h c l ，蒸馏水进行清洗，至洗出液 p h = 4 5 ，加入色素粗提液，至大部分树脂变为红色为止，加蒸馏水洗清杂质，至流出液呈透 明，然后用洗脱液( p h = 2 的酸性乙醇) 洗脱，收集流出液。用紫外可见分光光度计在5 3 4 册处 测定吸光值，比较三种树脂的精制效果。 ( 2 ) 树脂吸附能力的测定：1 ) 树脂吸附率的计算：吸附树脂主要是对色素进行吸附，因此吸 附前后吸光度的变化可以反映溶液中色素浓度的变化。故树脂对色素的吸附率可用下式表示。 即，吸附率= ( a o a t ) a o ，其中，a 0 是吸附前的色素溶液的吸光度，a t 是吸附后的色紊溶液 的吸光度；2 ) 不同种树脂吸附能力的测定：分别称取1 0 0 9 的活化阳离子交换吸附树脂、a b 一8 交换吸附树脂放入具塞三角瓶中，并加入1 0 m 1 等浓度的色素溶液，吸附3 0 分钟后搜集上清 1 9 两南大学硕十学何论文 液，供测定各树脂的吸光度，并 j 吸附率公式计算吸附率：3 ) 树脂吸附能力的测定：吸附结 果的好坏受到多种因素的影响，其中包括提取p h 值、温度、时间等。经预备可知，在精制红 叶芥色素过程中最主要的影响因素分别是p h 值、温度、时间，因此安排用三因素五水平的表 头l 2 5 ( 5 3 ) 对所得数据进行正交表整理，再用s p s s 分析，得到l s d 显著性。考虑到色素性质 其中p h 值选定为1 、2 、3 、4 、5 ，温度选定为5 、2 5 、4 5 、6 5 、8 5 ，时间为1 、2 、3 、4 、 5 小时，后测定上清液的吸光度a t ，计算吸附率。 ( 3 ) 树脂解析能力测定：称取2 ，0 0 9 已吸附色素并用蒸馏水多次冲洗除去杂质的树脂：组分 别用浓度为1 勰、3 5 、5 5 、7 5 、1 0 溉的乙醇溶液洗脱：另一组分嬲用滞值为l 、2 、3 、4 、5 、 6 的乙醇( 9 5 ) 溶液洗脱。收集洗脱液并定容到1 0 m 1 体积，测定其吸光度。 ( 4 ) 树脂重复性检验：称取1 o o g 活化的阳离子吸附树脂置于1 0 m 1 三角瓶中，取配制好的色素 溶液测定吸光度为a 。= 0 5 5 0 ，静态吸附至饱和。取上清液测定吸光度值a t ，计算吸附率，测 定树脂重复使用的性能。 3 2 6 红叶芥红色素成分及结构鉴定 ( 1 ) 提取液的制备：将色素的提取液用旋转蒸发器在真空条件下于4 0 旋转蒸发穰i n ，所 得色素液用微膜过滤，备用。 ( 2 ) h p l c 分离条件优化：将上述提取浓缩液经高压液相色谱( h p l c ) 分离，得到以下条件。仪 器配置：6 0 0 e 高压输液泵，二极管阵列检测器( f d a ) m i l l e n n i u m 3 2 色谱管理软件系统。色谱 条件：色谱分析柱：a g i l e n tt cc 1 8 色谱分析柱( 填料粒径5 u m ，柱尺寸3 9x1 5 0 咖，w a t e r s 公司) ：流动相：乙腈( h p l c 级) ，三氟乙酸( h p l c 级) ，去离子水( 1 8 2 q ) ：进样体积：2 0 u l 柱 温：2 5 ；流速：0 。3m l m i n 检测波长：5 3 6 n m 。优化各分离条件，使红叶芥红色素各化合物更 好的分离。 ( 3 ) 结构鉴定：利用高压液相色谱一质谱联用( l c m s ) 技术确定红叶芥中含有的色素种类及 分子量。色谱条件：a g i l e n tt cc 1 8 色谱分析柱( 填料粒径5l jm ，柱尺寸3 9x 1 5 0 m m ，w a t e r s 公司) ；流动相：6 5 的水溶液+ 3 5 乙腈水溶液( 用0 4 5pm 滤膜过滤) i 流速：o 5 m l m i n ：二极 管阵列检测器( p d a ) ：u v 检测，波长范围：2 1 0 一6 0 0 舳，在5 3 6 n m 下检测。质谱条件：电离方 式：e s i ( p o s i t i v e ) ：检测模式：sa d n o 瑚a l ：电离电压：3 5 o o p s i ：离子源温度：3 5 0 ；电喷雾接 口干燥气( n 2 ) 流速：9 0 0 l m i n 。 第4 章结聚0 分析 第4 章结果与分析 4 1 红叶芥红色素的定性分析 4 。1 1 显色反应 ( 1 ) 盐酸镁粉反应： 图1 盐酸一镁粉反应 f i g 1t h ee f k c to fh y d i o c h i o r i ca c i d - m a g n e s i u m 由图l 表明该色素属黄酮类化合物，能在盐酸一镁粉作用下。被氢气还原【1 圳。 ( 2 ) 中性醋酸铅反应： 红叶芥色素提取液 饱和中性醋酸铅溶液广1 1蓝紫色沉淀 饱和中住醋酸铅加入量增多广1 沉淀增多 固2 孛性醋酸铅反应 f i g 2t h ee a k to fa c e t u m 由图2 表明该色素成分中含有酚羟基，而酚羟基是黄酮类化合物分子结构官能团之n 训。 ( 3 ) 三氯化铁显色反应： 图3 三氯化铁显色反应 f i g 3t h ee f f e c to f f e r r i ct r i c h i o r i d e 由图3 表明这是化合物中含有酚羟基的特征性反应n 铡。以上显色反映可以参见附圈6 。 4 1 2 色素的溶解性 2 l 两南大学硕十学何论文 表1 色素的溶解性比较 1 a b 1t h es o l v a b i i i 够o fa n t h o c y a n i n s 由表1 可见，该色素易溶于水、甲醇、乙醇等极性较强溶剂，不溶于乙醚、苯等非极性 溶剂，为水溶性色素。 4 1 3 色素的最大吸收峰测定 因为经过酸碱反应h 矧，红叶芥色素会变色。即在酸性条件下为红色，碱性条件下为蓝色， 花色苷类色素具有此特性。同时由于花色苜类色素在波长为5 2 0 6 0 0 咖范围内有一明显的最 大吸收峰。因此，初步分析红叶芥色素是属于花色苷类色素。测定结果见图l 。 o d 1 4 2 1 o 8 o 6 0 4 o 2 0 3 2 9 n m3 3 3 n m5 3 6 n m6 6 7 n m7 4 4 n m 波长( 姗) w a v e l e n 咖 图4 色素最大吸收峰 f i g 4m a x i m u ma b s o r p t i o np e a ko fp i g m e n t d i f f e r e n tp e a k 从图4 可知，红叶芥色素在5 3 6n m 波长下的吸光度最大，即有最人吸收峰。为此试验于5 3 6 r i i i l 波长下测定吸光度，探讨试验条件对红叶芥色素提取效果的影响。 第4 寺结果与分析 4 2 红叶芥红色素提取条件的正交法试验研究 表2 含水乙醇提取红叶芥红色素正交实验设计结果表 t a b l e 2o r t h d g o n a id e s j g nr e s u i t so fr e dl e 叠fm u s t a r dp j g m e n te x t r a c t e dw i t ha i c o h d l 1 ( 1 ：l d o ) l 1 2 n ：3 0 ) 2 2 3 ( 1 ：5 0 ) 3 l ( 0 5 ) 2 ( 1 5 ) 3 ( 2 5 ) i 2 3 l 2 l ( 4 ) z ( 2 4 ) 3 ( 6 0 ) 3 l 2 2 i o 4 7 2 0 2 9 8 0 5 9 l l ，1 8 了 1 0 2 7 d 7 8 8 o 6 7 6 0 8 1 6 9 33 3 o 8 8 了 注：l s d 多重比较( 尸0 0 5 ) 表2 是对含水乙醇提取红叶芥红色素进行的正交实验分析，以下是用s p s s 对其进行的分 析。 表3 。红叶芥红色素提取条件圭效应方差试验 t a b j 臼1 衲o fb e 嘶e e 玎略n b j e c 拯e 融s 蚰r 鲫i e a fm u s t a r dp 噜舶蚰te x n 墨c t e d d e p e n d e n tv a r i a b l e ：吸光度 u r c e t ) 7 p ci i is u mo f ( d f ) m e 锄 概率 s q u 勰ss q u a 代s( s i 写) 截距平方鞫 3 ( 1 ：5 0 ) 1 ( 1 ：1 0 0 ) 。 从分析中可知料液比为l ：3 0 有最佳条件。 表5 多重比较( 处理时间) t a b i e 5m u i t i p l ec o m p a r i s o n s 口r o c e s s i n gt i m e ) d e p e n d e n tv a r i a b l e ：吸光度 时间时间 m e 柚s t d e 肿r 率 9 5 c o n 删e n c ei n t e r v a l t i m et i m ed i 仃e r e n c e( s i g ) 低限高限 (ij)lowerb o u n du p i ) e rb o u n d l s d1 o o2 o oo 2 0 1 7 8o 1 0 4 7 0 l o 0 7 0o ，0 1 8 1 9o 4 2 1 7 5 3 o oo 1 5 4 1 10 1 0 4 7 0 l o 1 5 8一o 0 6 5 8 60 3 7 4 0 8 2 o o1 0 0o 2 0 1 7 8o 1 0 4 7 0 lo 0 7 0o 4 2 1 7 50 0 1 8 1 9 3 0 0o 0 4 7 6 70 1 0 4 7 0 lo 。6 5 4一o 2 6 7 6 40 1 7 2 3 0 3 0 01 o od 1 5 4 1 lo 1 0 4 7 0 10 1 5 8一o 3 7 4 0 8o 0 6 5 8 6 2 o o0 0 4 7 6 70 1 0 4 7 0 l0 6 5 40 1 7 2 3 0o 2 6 7 6 4 注：l s d 多重比较( p = 0 0 5 ) 同样，由表5 可知：在显著性水平萨0 0 5 下，各时间之间差异显著：1 ( o 5 ) 3 ( 2 5 ) 2 ( 1 5 ) 。 从分析中可知时间为o 5 小时有最佳条件。 表6 多重比较试验( 温度) t a b l e 6m u l t i p l ec o m p a r i s 蚰s( p r o c e s s i n gt e m p e r a t l l r e ) d e p e n d e n tv a r i a h l e ：吸光度 t e m p ( i ) t e m p ( j ) m e a ns t d e 评d r d i f f c r c e 率9 5 c 0 n f i d 朗c ei n t e r v a l ( s i g ) 碾雨1 孺广 ( 1 一j )l o w e rb o u n du p p e rb o u n d l s d1 o o2 o o o 0 9 0 0 00 1 0 4 7 0 l0 4 0 lo 1 2 9 9 7o 3 0 9 9 7 3 o oo 1 3 0 1 l0 1 0 4 7 0 lo 2 3 0一0 3 5 0 0 8o 0 8 9 8 6 2 o o1 0 0一o 0 9 0 0 00 1 0 4 7 0 l0 4 0 l一0 3 0 9 9 7o ，1 2 9 9 7 3 o o一0 2 2 0 1l 牛0 1 0 4 7 0 l0 0 5 0一0 4 4 0 0 80 o 0 0 1 4 3 o o1 0 00 1 3 0 l l0 1 0 4 7 0 1o 2 3 0o 0 8 9 8 6o 3 5 0 0 8 2 0 0o 2 2 0 l l 木o 1 0 4 7 0 lo 0 5 0o 0 0 0 1 40 4 4 0 0 8 注：l s d 多重比较( p = o 0 5 ) 2 4 由表6 可知：在显著性水平。卸，0 5 下，各温度之间差异显著：3 ( 6 4 ) 1 ( 4 ) 2 ( 2 4 ) 。从分 篱4 章结果手分析 析可知温度为6 4 有最佳条件。 由表2 、3 、4 、5 、6 分析可知，利用各浓度酸性乙醇作为溶剂提取红叶芥色素时，各冈素 影响顺序为a