（植物学专业论文）低温胁迫下螺旋藻（节旋藻）几种氧化还原酶的研究.pdf

中文摘要 螺旋藻是一类光合自养的原核生物 在地球上已有3 5 亿年的生存历 史 目前产业化藻种主要是非洲c h a d 湖的钝顶螺旋藻 s p i r u l i n a p l a t e n s i s 和墨西哥s o s at e x c o c o 湖的极大螺旋藻 m a x i m a 这2 种 螺旋藻在高温 2 8 3 5 2 下生长的较好 1 9 9 6 年在鄂尔多斯高原沙区碱 湖中发现了能形成大面积水华的钝顶螺旋藻 p l a t e n s i s 经研究 该 藻生长温度范围为4 4 0 最适生长温度为2 4 2 可作为我国北方地区 发展螺旋藻产业的重要螺旋藻种质资源 本文以内蒙古鄂尔多斯高原沙区碱湖特有的钝顶螺旋藻 s 非洲 c h a d 湖的钝顶螺旋藻 s 2 和墨西哥s o s at e x c o c o 湖的极大螺旋藻 s 3 为材料 经低温胁迫处理后 测定了细胞内6 种氧化还原酶在不同处理 温度 时间的酶活性 并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离了其中4 种 l d h m d h g r 和s o d 酶的同工酶 通过比较来自中纬度与低纬度地区的 不同种间和种内不同品系的螺旋藻6 种氧化还原酶对低温的反应 探讨 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻对低温反应机理 丰富和完善鄂尔多斯高 原碱湖螺旋藻抗性生理学的研究内容 为螺旋藻产业适当扩大养殖的地 理范围和季节提供可利用的低温 广温型螺旋藻种质资源 结果表明 直接低温胁迫后 l d h m d h g r a p x 和s o d 随处 理温度的降低 酶活性呈先升高后降低的趋势 转折点多数在5 或1 0 2 c a t 活性随处理温度的降低呈下降趋势 随着处理温度下降和天数的延 长 鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻的6 种氧化还原酶活性均大于引进 种s 2 和s 随着胁迫强度的加大 s 的活性下降的程度小于引进种 表 明 鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻s 的抗寒能力强于引进种 同工酶分离鉴定的结果表明l d h 在低温胁迫下无新诱导的同工酶产 生 s o d 在个别温度下有少量新诱导的同工酶产生 低温可诱导m d h 和g r 新同工酶的大量表达 特别是经低温锻炼和a b a 预处理后 鄂尔 多斯高原碱湖钝项螺旋藻的m d h 和g r 表达量明显增加 且高于引进种 经低温锻炼或a b a 预处理后 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻的l d h m d h g r c a t 和s o d 活性与直接低温处理相比有显著的提高 而引 进种仅个别酶的活性有所提高 说明低温锻炼 a b a 预处理可以提高螺 旋藻对低温的适应能力 特别是对抗寒性强的鄂尔多斯高原碱湖钝项螺旋 藻的作用高于冷敏感的引进种 a b a 预处理与低温锻炼相比 a b a 预处理后虽然3 个样品的6 种氧 化还原酶活性均高于低温锻炼的 但其中只有l d h 在这2 个处理问s 2 有 显著差异 s s 3 均呈极显著差异 s o d 仅s 2 有显著差异 表明 对提 高螺旋藻抗寒能力方面a b a 预处理强于低温锻炼 但不同的酶表现不尽 相同 多数酶在这2 个处理间差异不显著 关键词 螺旋藻 低温胁迫 氧化还原酶 同工酶 a b s t r a c t s p i r u l i n ai sag r o u po fa u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e w h i c hh a se x i s t e do nt h e e a r t hf o r3 5h u n d r e dm i l l i o ny e a r s s p i r u l i n ap l a t e n s i s s 2 i nc h a dl a k ei n a f r i c aa n ds p i r u l i n am a x i m a s 3 i ns o s at e x c o c ol a k ei nm e x i c oa r em a i n l y i ni n d u s t r i a l i z a t i o na tp r e s e n t t h e s et w os p i r u l i n a sg r o ww e l li nh i 曲 t e m p e r a t u r eo f 2 8 3 5 c i n1 9 9 6s p i r u l i n a p l a t e n s i s s ob l o o mw a sf o u n di n t h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a u s p i r u l i n ap l a t e n s i sw a sr e p o r t e dt h a ti t s g r o w t ht e m p e r a t u r er a n g e df r o m4t o4 0 c a n di t so p t i c a lg r o w t ht e m p e r a t u r e w a s2 4 w h i c hc o u l db et h ei m p o r t a n ts p i r u l i n as t r a i nr e s o u r c ef o rt h e i n d u s t r i a l i z a t i o ni nt h en o r t ho fc h i n a i nt h i sp a p e r t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i xo x i d o r e d u c t a s e sw a sd e t e r m i n e d u s i n gs p i r u l i n a a sm a t e r i a l s a f t e r b e i n gl o wt e m p e r a t u r et r e a t e d u n d e r d i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dt i m e a n df o u ri s o e n z y m e so f l d h m d h g ra n d s o dw e r ee x t r a c t e du s i n gp e g e t h er e a c t i o nt ot h el o wt e m p e r a t u r eo fs i x o x i d o r e d u c t a s e so f s p i r u l i n a so f d i f f e r e n ts t r a i n sa n di nd i f f e r e n ts p e c i e sf r o m m i d d l el a t i t u d ea n dl o wl a t i t u d ew a sc o m p a r e dt os t u d yt h el o wt e m p e r a t u r e r e a c t i o nm e c h a n i s mo f s p i r u l i n as if r o mt h ea l k a l i n el a k eo f e r d o sp l a t e a u t o e n r i c ha n di m p r o v et h ea n t i p h y s i o l o g i c a lr e s e a r c hc o n t e n to fs p i r u l i n as l f r o mt h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a u a n dt oo f f e rt h eu s a b l el o wa n dw i d e t e m p e r a t u r es p i r u l i n as t r a i nr e s o u r c ef o rt h eb r o a d e n i n go ft h ec u l t i v a t i o n a r e a sa n ds e a s o n si ns p i r u l i n ai n d u s t r i a l i z a t i o n 一 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg l l z y m ea c t i v i t yo f l d h m d h g r a p x a n ds o ds h o w e di n c r e a s i n gf i r s ta n dt h e nd e c r e a s i n gt r e n dw i t ht h ed r o po f t h e t e m p e r a t u r ei nt h ep e r i o do f d i r e c tl o wt e m p e r a t u r es t r e s sa n dt h et u r n i n gp o 缸 w a sm o s t l ya t5 o ri o c c a ta c t i v i t ya l s od e c r e a s e d w i t ht h ed r o po f t h e t e m p e r a t u r ea n dt h ep r o l o n g i n go ft r e a t m e n tt i m e a l lo ft h ee n z y m ea c t i v i t y o fs i xo x i d o r e d u e t a s e so fs p i r u l i n as lf r o mt h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a u w e r ch i g h e rt h a nt h a to f e x o t i cs p e c i e ss 2a n ds 3 w i t ht h ed r o po f t e m p e r a t u r e i n t e n s i f i e d t h ed e c r e a s ed e g r e eo ft h ee n z y m ea c t i v i t yo fs lw a sl e s st h a n e x o t i cs p e c i e s w h i c hs h o w e dt h a tt h ec o l dr e s i s t a n c eo fs p i r u l i n as lf r o mt h e a l k a l i n el a k eo f e r d o sp l a t e a uw a ss t r o n g e rt h a nt h a to f t h ee x o t i cs p e c i e s n on e wi n d u c e di s o e n z y m eb a n dw a sp r o d u c e da f t e rl d hb e i n gl o w t e m p e r a t u r es t r e s s e d af e wl l e wi n d u c e di s o e n z y m eb a n d so fs o dw e r e p r o d u e e du n d e rs o m ei n d i v i d u a lt e m p e r a t u t e s a n dl o wt e m p e r a t u r ec o u l d i n d u c en e wi s o e n z y m eb a n d so fm d ha n dg rt ob ee x p r e s s e d e s p e c i a l l y b e i n gp r e t r e a t e dw i 廿ll o wt e m p e r a t u r ea n da b a t h ee x p r e s sq u a n t i t yo f m d ha n dg ri n c r e a s e do b v i o u s l ya n dh i g h e rt h a ne x o t i cs p e c i e s a f t e rl o wt e m p e r a t u r ea c c l i m a t i o no ra b ap r e t r e a t m e n l t h ee l l z y m c a c t i v i t yo f l d h m d h g r c a t a n ds o dw a sd r a m a t i c a l l ye n h a n c e dt h a n t h a tb e i n gd i r e c tl o wt e m p e r a t u r et r e a t e d h o w e v e rt h ee n z y m ea c t i v i t yo ff e w e x o t i cs p e c i e sw a se n h a n c e d i ti n d i c a t e dt h a tl o wt e m p e r a t u r ea c c l i m a t i o n a n da b ap r c t r e a t m e n to fs p i r u l i n ac o u l de n h a n c ei t sl o wt e m p e r a t u r e a d a p t a b i l i t y e s p e c i a l l y f o rs if r o mt h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a u c o m p a r e dw i t hc o l ds e n s i t i v ee x o t i cs p e c i e s t h ee n z y l l l ea c t i v i t yo fs i xo x i d o r e d u c t a s e so ft h r e es a m p l e sa l t e rb e i n g p r e t r e a t e dw i t ha b a w a se n h a n c e dc o m p a r e dw i t ht h a ta t t e rb e i n gp r e t r e a t e d w i t hd i r e c tl o wt e m p e r a t u r e e x c e p t i o n a l l yl d ho fs 2i nt w o 臼e a l m e n t sh a d s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea n dt h a to f 1a r i ds 3h a de x t r e m e l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i nt h ea s p e c to fs o d o n l yt h a to fs 2h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h e s e i n d i c a t e dt h a ta b a p r e t r e a t m e n tc o u l de n h a n c es p i r u l i n ac o l dr e s i s t a n c em o r e t h a nl o wt e m p e r a t u r ea c c l i m a t i o n b u tv a r i e do nd i f f e r e n te n z y m e sa n dm o s t e n z y m e si nt h et w ot r e a t m e n t sh a dl i t t l ed i f f e r e n c e k e yw o r d s s p i r u l i n a l o wt e m p e r a t u r es t r e s s o x i d o r e d u c t a s e i s o e n z y m e 内蒙古师范大学硕 1 学位论文 前言 p r e f a c e 螺旋藻是一类光合自养的原核生物 属于蓝藻f 1 c y a n o p y t a 颤藻科 o s c i l l a t o r i a c e a e 螺旋藻属 s p i r u l i n a 或节旋藻属 a r t h r o s p i r a i 啦 是最早进 行光合作用的生物之一 广泛分布于土壤 沼泽 温泉 湖泊及海洋中 3 1 大多数螺 旋藻喜高温 2 8 3 5 c 高碱 p h8 5 l o 5 和高盐环境 在一些不适合其它生物生存 的极端环境 螺旋藻都能良好生长 4 螺旋藻能利用光能将c 0 2 转化为有机物 且光 能转化率高达1 8 具有巨大的生产潜力1 5 其含有极丰富的营养成份和生理活性物 质 具有提高机体免疫功能 抗衰老等作用1 6 l 近年来 螺旋藻成为许多国家开发利 用的一种新型的微藻 被世界卫生组织和联合国粮农组织称为 2 l 世纪人类最佳保 健品和最理想的食品 7 j 1 9 4 0 年法国药物学家c r e a c h 在c h a d 湖发现了钝项螺旋藻 此后有关螺旋藻的 基础研究和应用逐渐引起各国科学家们的广泛关注 从分类 形态解剖 生理 生态 营养成分及培养条件等方面展开了一系列的研究 1 9 6 6 年巴斯德研究所c z a r r o u k 的 螺旋藻培养研究 博士论文发表i s 螺旋藻在实验室培养获得成功 为工厂化生 产奠定了基础 他提供的z 氏培养液配方至今仍在被广泛应用 1 9 7 0 年o g a w a 等对 螺旋藻的生长进行了研究网 1 9 7 9 年m e l a e k 等对其光合作用进行了研究 1 0 l 1 9 8 0 年l l t i s 对其生态进行了研究0 1 1 g o m o n t 等人分别对螺旋藻分类进行了研究 2 1 2 1 3 1 1 9 9 6 年和1 9 9 7 年k e b e d e 分别研究了螺旋藻生长的最适条件和盐分对其的影响i l 1 9 9 7 年梁静娟等对其营养学进行了研究i 1 9 9 6 年t o s h i r n i t s u 和k y o k o 2 0 0 1 年汪 志平和徐步进对其药理学进行了研究 1 7 垌 2 0 0 0 年张文雄等对其毒理学进行了研究 0 9 1 等等 随着基础研究的深入 螺旋藻的应用领域也从营养食品 加l 医药保健品 2 1 1 扩大到系列化妆品吲 饲料和饵料添加剂 2 3 1 精细化工产品阴 环境治理和新能源 开发1 2 5 2 6 1 等方面 在世界范围内形成了相当规模的螺旋藻产业 1 9 6 8 年 法国与墨西哥合作在s o s at e x c o c o 湖畔建立了世界上第一个螺旋藻生 产工厂 1 9 7 4 年以来 日本 泰国 我国台湾省和墨西哥相续建立了四家商品化生 产的螺旋藻公司 美国从1 9 8 2 年起进行螺旋藻商品化生产 1 9 8 3 年的螺旋藻保健食 品销售额达约l 亿美元 目前世界上已有l o 多个国家和地区进行螺旋藻研究和生产 低置胁迫下螺旋簇 节旋凝 几种氧化j e 踉酶的研究 螺旋藻销售额己达2 0 亿美元以上 2 0 世纪7 0 年代螺旋藻就己引入我国 但其研究 开发和应用方面的工作 近十几年才得到较快的发展 目前我国约有螺旋藻厂1 0 0 多家 年产千粉20 0 0 多吨 占全球产量的4 0 左右 已成为螺旋藻养殖大国鲫 目前国内产业化所用的藻种 一个是非渊c h a d 湖钝顶螺旋藻 s p i r u l i n a p i 蹴棚话 另一个是美洲墨西哥s o s at e x c o c o 湖极大螺旋藻 sm a x i m a 融2 9 l 这2 个种均来自国外 属于引进种 它们的原产缝均在北纬十几度 都属于喜高温的物种 正因为如此 我国螺旋藻工厂主要分布在南方和沿海地区 随着引进藻种的驯化 螺 旋藻工厂适当向北移了一些 但目前仍分布予北纬3 7 以南 为扩大螺旋藻养殖的地 理范围 使其生产地在我国由南向北发展 同时让现有的螺旋藻工厂冬季时也可以生 产 大大提高生产周期和产量 人们迫切希望得到耐低温藻种 1 9 9 6 年内蒙古农业大学的秀辰教授 李博生教授在鄂尔多斯高原毛乌素沙地碱 湖发现了4 种螺旋藻资源 经藻类专家鉴定其中之一是钝顶螺旋藻 3 0 3 这是目前在 世界上发现有钝顶螺旋藻分布的第二个地区 且其分布纬度高 3 9 2 3 n 在国家自 然科学基金的资助下 研究得知该藻生存的温度范围至少为 2 0 c 4 5 生长的温度 范围为6 c 4 0 c 最适生长温度约为2 4 这是一个天然耐低温 广温型藻种阎 目前 在其对低温的反应方面已进行了一些研究 2 0 0 5 年栗淑媛等研究了低温胁迫 对螺旋藻脱氢酶活性 可溶性蛋白和游离氨基酸外渗的影响0 3 j 2 0 0 6 年袁淑珍研 究了低温胁迫对螺旋藻代谢功能的影响 l 2 0 0 6 年张三澜研究了螺旋藻质膜对低温 的反应闭 但有关螺旋藻细胞内氧化还原酶对低温的反应未见报道 为此进行了这方 面的研究 与无氧呼吸有关的乳酸脱氢酶 e c1 i 1 2 7 缩写l d h 是一种广泛存在于生 物体中的氧化还原酶 催化乳酸和丙酮酸的可逆转化 改变环境因素对l d h 同工酶表 达的影响已在不少生物中得到证明p 7 棚 与有氧呼吸有关的苹果酸脱氢酶 e c1 1 1 3 7 缩写m d h 是生物细胞内三羧酸循环中的一种氧化还原酶 可促进苹果酸与草酰乙酸 的相互转化 与光呼吸及乙醛酸循环有关 亦与丙酮酸羧化支路相关联暇4 0 1 已有研 究表明 受环境胁迫后m d h 的活性会有所提高 这种改变可能是环境压力对基因表 达的影响所致 1 熊嘲 生物体代谢活动中会产生活性氧 在其长期进化过程中也形成了完普和复杂的酶 类和非酶类抗氧化保护系统来清除活性氧 在j 下常情况下 生物体内活性氧的产生和 内蒙古师范大学磺士学位论文 清除处于一种动态的平衡状态 但是各种逆境胁迫都会打破这种平衡 使细胞内活性 氧过量积累 对生物体产生毒害作用 主要表现在它们能与蛋白质 脂类和核酸发生 作用而引起蛋白质变性和降解 膜脂过氧化和d n a 链断裂等现象 导致细胞结构和 功能的破坏嗍 然而生物体也形成了分解氧自由基抗氧化酶系统 主要包括谷胱甘肽 还原酶 e c1 6 4 2 缩写g r 过氧化氢酶 e c1 1 1 1 6 缩写c t 抗坏血酸过 氧化物酶 e c1 1 1 1 1 l 缩写a p x 和超氧化物歧化酶 e c1 1 5 1 1 缩写s o d 等 植物抗逆能力与这些抗氧化酶对氧自由基的清除力密切相关嘲 本文对这几个与 螺旋藻抗氧化有关的酶也进行了研究 本文以内蒙古鄂尔多斯高原沙区碱湖特有的钝顶螺旋藻 s 1 非洲c h a d 湖的钝 顶螺旋藻 s d 和墨西哥s o s a t e x e o e o 湖的极大螺旋藻 s 3 为材料 采用植物抗寒 研究的方法和技术 控制实验条件 低温胁迫处理后测定了6 种氧化还原酶在不同处 理温度 时间的酶活性 并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定了其中4 种 u m m d h g r 和s o d 的同工酶 通过比较来自中纬度与低纬度地区的不周种间和种 内不同品系螺旋藻的6 种氧化还原酶对低温的反应 探讨鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋 藻对低温反应的机理 丰富和完善鄂尔多斯高原碱湖螺旋藻抗性生理学的研究内容 为螺旋藻产业适当扩大养殖的地理范围和季节提供可利用的低温 广温型螺旋藻种质 资源及其有关的基础数据 低温胁迫下螺旋藻 节旋藻 几种氧化还原酶的研究 钝顶螺旋藻 s p i r u l i n a p l a t e n s i 钝项螺旋藻 p l a t e n s i s 极大螺旋藻 s 3 最m 咖口 中国鄂尔多斯高原毛鸟素沙地 巴彦淖尔碱湖 非洲c h a d 湖 墨西哥s o s at e x c o c o 湖 内蒙古农业大学 乔辰教授提供 南京大学 曾昭琪教授提供 中国农业科学院 陈婉华先生赠 注 下文样品代号以此表为准 2 主要实验仪器设备和药品 2 1 主要仪器 m g c 3 5 0 b d 型智能光照培养箱 上海一恒科技有限公司制造 p b 1 0 型酸度计 s a r t o d u s 制造 v c 1 3 0 型超声波细胞破碎机 s o n i c s u s a 制造 g l 2 1 m 型高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司制造 j y 6 0 0 c 型电泳仪 j y s c z a 型电泳槽 北京君意东方电泳设备有限公司制造 g i s 2 0 1 0 型凝胶成象分析系统 t a n o n 科技上海有限公司制造 u v 2 0 0 0 型紫外 可见分光光度计 莱伯泰科有限公司制造 2 2 主要药品 脱落酸 a b a 二硫苏糖醇 d t r 氯化硝基四氮唑 n b t n 甲基吩嗪甲 基硫酸盐 p m s 苯甲基磺酰氟 p m s f n n n n 四甲基乙二胺 t e m e d t r i s 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 2 6 二氯酚靛酚 以上药品均为进口或 4 内蒙古师范丈学硕士学位论文 进口分装的分析纯试剂 抗坏血酸 a s a 氧化型谷胱甘肽 g s s g 还原型谷胱甘肽 g s h n a d n a d h n a d p h 邻苯三酚 甘氨酸 草酰乙酸 以上药品均为国产分析纯试剂 3 实验方法 3 1 螺旋藻培养 将分离纯化的螺旋藻样品用z a r r o u k 培养液f 8 在自然光照下室温通气培养 在对 数生长期取材 3 2 酶活性测定 3 2 1 乳酸脱氢酶 采用李建武等 锚 的方法迸行测定 反应体系为o 1m o l l 磷酸钠缓冲液 p h7 5 内含n a d h 浓度为o 1 6 2m o l l 丙酮酸钠浓度为0 7 4 5m o l l 3 0m l 粗酶液加入 量为o 0 5 m l 总体积为3 0 5 m l 每隔3 0s 读出a v a l m 的减少值 取3 m i n 反应时 间来计算酶活性 在2 5 2 p h7 5 条件下 1 个酶活性单位定义为a m n m m i n 下降1 0 的酶量 3 2 2 苹果酸脱氢酶 采用张丰德f 明的方法进行测定 反应体系为0 2m o l l 磷酸缓冲液 p h7 4 内 含n a d h 浓度为0 4m m o l l 草酰乙酸浓度为0 2m m o l l 2 9 0m l 粗酶液加入量 为o 0 5 m l 总体积为2 9 5 m l 每隔3 0s 读出a a a o n m 的减少值 取3 r a i n 反应时间 来计算酶活性 在2 5 p h7 4 条件下 1 个酶活性单位定义为a mn m m i n 下降1 0 的酶量 3 2 3 谷胱甘肽还原酶 采用李忠光等m 的方法进行测定 反应体系为0 0 5m o l lt r i s h c l 缓冲液 p h 7 5 内含n a d p h 浓度为o 2m m o l l g s s g 浓度为o 5r e t o o l l 2 9 5m l 粗酶液 加入量为0 0 5m l 总体积为3 0 0m l 每隔3 0s 读出a v t o r a n 的减少值 取3r a i n 反 应时间来计算酶活性 在2 5 1 2 p n7 5 条件下 1 个酶活性单位定义为a 3 o n m m i n 下 降1 o 的酶量 3 2 4 过氧化氢酶 彘沮胁迫下一旋蕞 节旋蕞 几种氧化还墩酶的研究 采用李忠光等m 的方法进行测定 反应体系为0 0 5m o l lt d s h c l 缓冲液 p h7 o 内含i 2 0 21 2 5r e t o o l l 2 9 5m l 租酶液加入量为o 0 5m l 总体积为3 0m l 每隅3 0 读出a 2 0 l m 的减少值 取3r a i n 反应时问来计算酶活性 在2 5 c p h7 0 条件下 1 个酶活性单位定义为a 2 4 0 n m m i n 下降1 0 的酶量 3 2 5 抗坏血酸过氧化物酶 采用李忠光等m 的方法进行测定 反应体系为o 0 5m o l l1 h s h c l 缓冲液 p h 7 0 内含a s a 浓度为0 5r e t o o l l 2 9 5m l 租酶液加入量为0 0 5m l 总体积为3 0m l 每隔3 0 读出a 枷衄的减少值 取3 m i n 反应时间来计算酶活性 在2 5 0 p h7 0 条件下 1 个酶活性单位定义为a 3 4 0 n m m i n 下降l o 的酶量 3 2 6 超氧化物歧化酶 采用李建武等嗍改进的邻苯三酚自氧化法进行测定 邻苯三酚自氧化速率的测定方法见表i 2 s o d 活性的测定方法见表1 3 袭t 2 邻笨三酚自氧化速率的测定 t a b i e1 2 d e t e r m i n i n gt h e 眦o f p y r o g a l l o la m o x i d a f i o n 试栽 加 m 对照管怨全鬃 嚣m 终m 蹿o i 嚣l m l ll j 加嘌恐 4 5 4 55 0 t r i s h c l 缓冲液p h8 2 2 5 保温2 0 m i n 4 5m m o l l 邻苯三酚溶液0 o l一0 10 1 0 m m o l l h c i一0 01 一 迅速插匀倒入l 啪比色杯 每隔1 0 l 测光吸收值一次 要求自氧化速率控制在0 0 7 0 a 北 m i n 总量4 5 4 5 一 表i 3s o d 活性的测定 一 一 一 一 e q 壅 2 垒 塑啦i g 丝兰 i i 丝垡 q 望 一 一 试 剂 加入量 m l对照管加入鼽l 慧船 搬作方法同表1 2 酶活力单位定义为 2 5 lm l 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达5 0 内蒙古师范人学硕士学位论文 时的酶量为一个活力单位 单位体积中的酶活力 u m l 山k 5 m i n 一圾 l i i i 璺 垒5 0 垫 l x 反应液总体积 堕誓黼酶样液体积 注 a a 3 2 5 曲n i n 为自氧化反应速率 a b 3 2 5 加n i n 为s o d 抑制下的自氧化速 率 邻苯三酚自氧化速率控制a 3 2 5 m i n 在0 0 7 左右 以上各个酶均在常温 2 5 下进行了酶活性测定 作为对照 3 3 低温胁追处理方法 3 3 1 直接低温胁迫处理 准确称取对数生长期的螺旋藻样品1 0g 加入5 0m l 新鲜z a n o u k 培养液 置于 光照培养箱中直接进行低温胁迫处理 处理温度分别为1 5 1 0 5 o 5 处理天数为l d 3 d 5 d 7 d 光照强度l2 0 0i lm o l m 2 s 光 暗周期为1 2 h 1 2 h 日 夜 3 3 2 低温锻炼后低温胁迫处理 准确称取螺旋藻样品1 0 9 加入5 0 m l 新鲜z a r r o u k 培养液 样品先置于1 4 1 2 7 2 n 夜 l2 0 0pm o l m 2 s t 光 暗周期为1 2 h 1 2 h 的光照培养箱中低温锻炼6d 然后 再进行低温胁迫处理 处理方法同3 3 1 3 3 3 脱落酸 a b a 预处理后低温胁迫处理 准确称取螺旋藻样品1 0g 簧于5 0m l 新鲜z a r r o u k 培养液中 样品先用lx1 0 5 m o l la b a 于2 5 下处理ld 然后再进行低温胁迫处理 处理方法同3 3 1 3 3 4 粗酶液的制备 取处理后的螺旋藻样品 用蒸馏水冲洗3 次 吸去多余水分 准确称取o 5g 加入 2 m l 预冷的o 0 5 m o l l 的磷酸缓冲液p h 7 8 含l m m o l l e d t a l m m o l l a s a l m m o l ld r r lm m o l lp m s f lm m o l lg s h 4 7 1 在冰浴中进行超声波破碎 功率 调至2 0 w 每次破碎1 0s 中间间隔2 0s t 共破碎3 次 将破碎液在4 c 下 r c f 为l o 0 0 0 x g 离心2 0r a i n 取上清液在4 贮存备用 以上每项测定均重复3 次 3 4 同工酶的研究 3 4 1 常温和低温胁迫处理方法 7 低温胁迫下螺旋藻 节旋藻 几种氧化还原酶的研究 常温 准确称取在2 5 y 3 下培养的样品0 5 毋进行同工酶的分离和鉴定 直接低温胁迫处理 准确称取螺旋藻样品1 0g 加入5 0m l 新鲜z a r r o u k 培养液 置于光照培养箱中直接进行低温胁迫处理 处理温度分别为5 c 0 1 2 和 5 t 2 处理天数 为3d 光照强度l2 0 0 扯m o l m 2s 彤暗周期为1 2 h 1 2 h h 夜 取对数生长期的样品进行低温锻炼 见3 3 2 和a b a 预处理 见3 3 3 后 再 进行低温胁迫处理 方法同前 3 4 2 粗酶液的制备 粗酶液的制备方法同3 3 4 3 4 3 同工酶的分离 采用不连续系统 垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 p a g e 脚1 进行同工酶分离 制胶按表1 4 比例灌胶后 胶板放在阳光下lh e 右 使胶充分聚合 加样1 0 0l a l 粗酶液 j 电泳起始电流为1 5m a 样品进入分离胶后 改为3 0m a 溴酚蓝距前沿约1g i l l 停止电泳 电泳时间和5h 表1 4 不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方 旦 堕 兰塑婴 堕塑 壁 垫 p 垡堡i 鳇 垫 螋 垫堡 塑p 煦 塑堡 试剂名称 配鼍裂淼糌警所删1 勰鎏篇 臁 3 4 4 同工酶的鉴定 采用酶活性染色进行同工酶的鉴定 l d h 采用何忠效等梆 的方法 染色液为5 0m g 篚j n a d 3 0m g 的n b t 2m g 的p m s 3 内蜚古师范大学硕i 一学位论文 1 0 m l 的乳酸钠 1m o l l p h7 o 5m l 的n a g o 1m o l l 1 5m l 的t f i s h c i o 5 m o i l p h7 1 7 0m l 蒸馏水 活性染色液临用前配制 下同 显色 将电泳后的凝胶板浸入染色液中 在3 7 3 2 保温6 0r a i n 出现蓝紫色的l d h 同工酶谱带后 蒸馏水冲洗用7 醋酸固定 m d h 采用何忠效等1 4 s 1 的方法 染色液为5 0m g 的n a d 3 0m g 的n b t 2m g 的 p m s 1 0m l 的l 苹果酸钠 1m o l l p h7 o 2 0m l 的t r i s h c o 5m o l l p h7 1 7 0 m l 蒸馏水 显色 将电泳后凝胶板浸入染色液中 在3 7 3 2 保温6 0m i n 显示蓝紫色区带 蒸馏水冲洗后用7 5 醋酸固定 g r 采用a n d e r s o n m d 等 4 9 1 的方法 染色液为0 2 5m o l lt r i s h c l p h7 8 含 0 2 4m m o l lm t t 0 4m m o l ln a d p h 0 3 4m m o l l2 6 二氯酚靛酚 3 6m m o l l g s s g 显色 黑暗中放置lh 显示出蓝紫色区带即可 s o d 采用氯化硝基四氮唑蓝州b d 光化还原法染色 4 6 1 显色 电泳后的凝胶板浸泡在2 4 5 xl o 3m m o l l 的n b t 溶液中2 0m i n 黑暗中 进行 一再移到含有0 0 2 8m m o i l 的t e m e d 和2 8 l o 5m m o l l 核黄素的0 0 3 6 m r n o l l 的磷酸缓冲液q h7 8 中浸泡1 5m i n 一将凝胶板浸在p h7 8 的0 0 5m m o l l 的磷酸缓冲液中 含有1 1 0 4m m o l l 的e d t a 一并用40 0 0l im o l m z s 光照3 0r a i n 一在蓝色凝胶背景上出现透明的酶带 3 5 数据处理 采用s p s s 1 3 0 分析软件 对酶活性随温度和时间的变化进行方差分析和d u c a n 多重比较 对不同处理间螺旋藻氧化还原酶活性进行多因素方差分析 9 二结果与分析 r e s u l t s a n a l y s i s 1 酶活性测定 1 i 乳酸脱氯酶 由图2 l 看出 随处理温度的降低 l d h 活性均呈现先增高后降低的趋势 随处 理天数的延长 l d h 活性基本呈下降趋势 在任一温度和天数组合下 s l 的l d h 活 性高于s 2 和s 3 3 善2 i 蟾l o 3 芎 蟊 艟l o 4 善3 彗2 嫠 o 曩度t c m p e r a t u r e j 天教d i y i d s i 盟a 岛 图2 1低温处理对螺旋藻l d h 活性的影响 f i g2 lt h ee f f e c to f l o wt e m p e r a t u r ef o rl d ha c t i v i t yi ns p i r u l i n a i o 内蓑古师范大学硕士学位论文 在2 5 0 时 s l s 2 和s 3 的l d h 活性分别为i 6 5u g f w 0 7 3u g f w 和o 9 9 u g f w s 1 分别是s 2 和s 3 的2 3 倍和i 7 倍 直接低温处理后 3 个螺旋藻样品的 l d h 活性均低于2 5 1 2 时的 s l s 2 和s 3 的l d h 平均活性分别比2 5 2 时降低了5 7 舒6 6 0 o 和6 7 7 与2 5 时相比 低温锻炼后再低温处理 s i 的l d h 活性在1 5 l o 1 2 5 c 和 0 1 2 处理l d 时 1 0 2 和5 1 2 处理3 d 时高于2 5 c 时的 s 2 和s 3 在5 0 和0 1 2 处理l d 时 高于2 5 c 时的 与直接低温处理相比 低温锻炼对3 个样品的l d h 活性都有提高 且处理天数越短 提高的幅度越大 特别是对于s l 表现的更为明显 其中s t 的l d h 活性是直接低温处理的2 0 5 倍 经过多因素方差分析 差异极显著 p o 0 5 可见低温锻炼可提高s l 的l d h 活性 而对s 2 和s 3 的影响不大 与2 5 时相比 a b a 预处理后再低温处理 s l 的l d h 活性在1 5 l o 5 和0 1 2 处理l d 时 1 5 c 1 0 和5 处理3 d 和5 d 时 1 5 1 2 处理7 d 时高于2 5 2 时 的 s 2 在1 5 1 2 1 0 和5 1 2 处理i d 时 5 c 处理3 d 时 l o 处理5 d 和7 d 时高于2 5 时的 s 在1 5 o 1 0 5 和0 c 处理l d 时 1 5 1 0 2 和5 处理3 d 时 5 1 2 处理5 d 时高于2 5 时的 与直接低温处理相比 a b a 预处理对3 个样品的l d h 活 性都有提高 且对于s l 和s 3 的提高幅度高于s 2 其中s 卜s 2 和s 3 的l d h 活性是直 接低温胁追处理的2 6 倍 1 5 倍和2 9 倍 经多因素方差分析 s i 和s 3 的差异极显 著 p o 0 1 s 2 的差异显著 p o 0 5 以上结果表明 a b a 预处理可提高螺旋藻 u h 的活性 1 2 苹果酸脱氢酶 由图2 2 看出 随处理温度的降低 m d h 活性均呈现先增高后降低的趋势 随 处理天数的延长其活性变化幅度不大 在2 5 1 2 时 s 卜s 2 和s 3 的m d h 活性分别为1 8 5 u g f w 1 4 4 u g f w 1 3 7 u g f w s 1 分别是s 2 和s 3 的1 2 8 倍和1 3 5 倍 直接低温处理后 s i 和 的m d h 活性只在5 处理3 d 高于2 5 2 时的 s 3 则都低于2 5 时的 s l s 2 和s 3 的m d h 平均活性分别 比常温的降低了3 6 2 4 0 3 和4 0 9 3 个螺旋藻样品的m d h 活性在处理l d 3 d 和5 d 时从5 7 d 时从1 5 2 时开始 s l 的m d h 活性高于s 2 和s 3 差异显著 p o 0 5 低温胁迫下螺旋藻 节旋藻 几种氧化还原酶的研究 温度t c m p c t a l l l t c 天数d a y s d 啊s l a 岛 图2 2 低温处理对螺旋藻m d h 活性的影响 f i g2 2 t h ee f f e c to f l o wt e m p e r a t u r ef o rm d ha c t i v i t yi ns r u l i n a 低温锻炼后再低温处理 在任一温度和天数组合下 s l 的m d h 活性均高于s 2 和s 3 且差异显著 p 0 0 5 a b a 预处理后再低温处理 3 个螺旋藻样品的m d h 活性在处理l d 的5 3 d 5 d 和7 d 的1 5 2 时开始 s i 的m d h 活性高于s 2 和s 3 差异显著 p o 0 5 a b a 预处理后 s i 的m d h 活性在0 1 2 处理l d 时 5 和0 1 2 处理3 d 时 l o 和5 0 处理 5 d 时 1 0 处理7 d 时高于2 5 时的 s 2 在5 处理3 d 时 1 0 处理5 d 和7 d 时高 a珏nn口且 r rhauk且 一 一 r n 口n 什a 正 乳且 k扭 轧江 3 5 2 5 l 5 0 3 5 2 5 1 5 0 3 5 2 s 5 o 2 o 2 l o 2 l o f声玛墨仉 掣烬 亭 墨1 掣裙 事一曲 nv 掣蟾 内蒙古师范丈学颂士学位论文 于2 5 2 时的 s 3 仅在1 0 c 处理5 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