提取板栗DNA的CTAB法和SDS法的比较.pdf

第14期 第51卷第14期 2012年7月 湖 北 农 业 科 学 Hubei Agricultural Sciences Vol 51 No 14 Jul 2012 收稿日期 2011 10 24 基金项目 湖北省自然科学基金重点项目 2010CBB03901 湖北省教育厅高校产学研合作资助项目 C2010060 作者简介 王少斌 1985 男 甘肃秦安人 在读硕士研究生 研究方向为果树生理生化分子生物学 电话电子信箱 sbsw2009 126 com 通讯作者 程水源 教授 电话电子信箱 s y cheng sina com 板栗 Castanea mollissima BL 是壳斗科栗属 落叶乔木 是一种重要的园艺作物 其经济栽培价 值高 1 迄今为止 人们对板栗的研究很多 但多集 中于板栗的种植 病虫害防治及板栗壳的利用等方 面 而对板栗基因组DNA的研究相对较少 基因组 DNA的提取及DNA分子标记的应用是构建基因文 库和遗传图库等分子生物学研究的基础 2 4 由于板 栗富含酚类 糖类 脂肪 色素以及单宁等次生代谢 物 给获得板栗基因组DNA带来了较大困难 提取 高质量DNA更加不易 此外 传统方法提取的DNA 得率低 纯度低 难以进行酶切及PCR扩增 进而影 响随机扩增长度多态性 AFLP 等技术在板栗上的 应用 采用十六烷基三乙基溴化铵 CTAB 法和十二 烷基磺酸钠 SDS 法分离板栗基因组DNA 通过比 较这两种方法提取的DNA的质量 以期优化板栗 高质量DNA模板提取的方法 旨在为板栗的分子 水平研究打下基础 1材料与方法 1 1材料 板栗果实取自于罗田县胜利镇板栗试验基地 品种为 罗田乌壳栗 将果实用液氮速冻后放入 提取板栗 DNA 的 CTAB 法和 SDS 法的比较 王少斌 1 程水源2 3 王 燕 2 许 锋 1 2 姜德志1 2 陈慧娟1 李琳玲2 3 程 华 2 3 1 长江大学园艺园林学院 湖北 荆州434025 2 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室 湖北 黄冈 438000 3 黄冈师范学院生命科学与工程学院 湖北 黄冈438000 摘要 分别采用十六烷基三乙基溴化铵 CTAB 法和十二烷基磺酸钠 SDS 法提取板栗 Castanea mollis sima BL 基因组DNA 取适量DNA进行琼脂糖凝胶电泳 并利用紫外可见分光光度计测定所提取的 DNA在260和280 nm的吸光度及其比值 利用Eco R 和Mse 双酶切后进行随机扩增长度多态性 AFLP 分析 结果表明 两种方法均能从板栗中提取出一定质量的 比较完整的 纯度比较高的DNA SDS法提取的板栗DNA的纯度更高 质量更好 关键词 板栗 Castanea mollissima BL DNA提取 十六烷基三乙基溴化铵 CTAB 法 十二烷基磺酸钠 SDS 法 随机扩增长度多态性 AFLP 中图分类号 Q503文献标识码 A文章编号 0439 8114 2012 14 3101 03 Comparison of CTAB and SDS Methods for DNA Extracion of Chestnut WANG Shao bin1 CHENG Shui yuan2 3 WANG Yan2 XU Feng1 JIANG De zhi1 2 CHEN Hui juan1 LI Lin ling2 3 CHENG Hua2 3 1 College of Horticulture and Gardening Yangtze University Jingzhou 434025 Hubei China 2 Hubei Key Laboratories of Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources Huanggang 438000 Hubei China 3 College of Chemistry and Life Science Huanggang Normal University Huanggang 438000 Hubei China Abstract Genomic DNA of chestnut Castanea mollissima BL was extracted by CTAB method and SDS method The DNA extracted was tested by agarose gel electrophoresis and spectrophotometry and then double digested by EcoR and Mse for AFLP The results showed that the DNA extracted by both methods was with good quality and high purity while DNA ex tracted by SDS method was with higher quality and purity compared with CTAB method Key words Castanea mollossima BL DNA extraction CTAB method SDS method AFLP 湖北农业科学2012年 80 低温冰箱里保存过夜 然后撕去外壳及内皮 层以外部分 分离果肉 将其剪碎 加液氮研磨 1 2方法 1 2 1DNA的提取方法 1 CTAB法 参照Loh等 5 的方法并加以改良来 提取板栗的基因组DNA 具体步骤如下 取5 g新 鲜的板栗果实于液氮中研磨至粉末 迅速转移到 10 mL离心管中 加入4 mL于65 预热的CTAB 提取液 20 g L CTAB pH 7 5的100 mmol L Tris HCl pH 8 0的50 mmol L EDTA 1 4 mol L NaCl 于65 水浴1 h 以10 000 r min离心12 min后 取上清液加入等体积的体积比为24 1的氯仿 异戊 醇混合液 充 分 混 匀 于 冰 上 静 置10 min 以 10 000 r min离心12 min 取上清液 加入等体积的 异丙醇于 20 沉淀20 min 以10 000 r min离心 10 min 取沉淀 用体积分数为75 的乙醇清洗沉淀 3次 每次30 min 用适量的TE缓冲液溶解 DNA 并加入5 L RNaseA 于37 水浴30 min消 化RNA 加入等体积的体积比为24 1的氯仿 异 戊醇混合液 抽提2次 用2倍体积的体积分数 为95 的乙醇和1 10体积的3 mol L NaAc沉淀 DNA 用体积分数为75 的乙醇清洗DNA 3次 自然干燥后 加100 L TE缓冲液溶解DNA 2 SDS法 步骤同上述CTAB法 仅将提取液改 为SDS提取缓冲液 pH 5 2的0 1 mol L NaAc 0 5 mol L EDTA 0 5 mol L NaCl 20 g L聚乙烯基吡咯 烷酮 PVP 14 g L SDS 体积分数为0 5 的 巯 基乙醇 提取时加入2 3体积的pH 4 8的2 5 mol L KAc 冰浴30 min 1 2 2DNA质量的检测方法 取10 L DNA溶 液用TE缓冲液稀释至500 L 检测DNA样品在 260 280 nm的吸光度A260 nm A280nm 利用A260nm A280nm 评价DNA样品的纯度 取5 L DNA样品 加2 L溴酚蓝上样缓冲液 于0 8 琼脂糖凝胶中电泳 用EB染色 拍照 用0 8 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的完整性以及是否降解 取500 ng SDS法 提取的总DNA用Eco R 和Mse 进行双酶切 采 用12 5 L反应体系 Eco R Mse 1 25 U 5 Re action Buffer 500 ng DNA和ddH2O 试验中做了不 同的酶切处理 分别在精密恒温仪和PCR仪上于 37 酶切1 2 4 6 h 然后于80 处理20 min 最 后按照李勇慧等 6 的方法进行AFLP标记分析 2结果与分析 2 1DNA样品的质量分析结果 由表1和表2可知 采用SDS法提取的DNA 的产率显著高于采用CTAB法提取的DNA的产率 通过CTAB法提取的DNA的A260nm A280nm平均值为 1 67 说明采用CTAB法提取的板栗DNA含有大量 杂质 纯度较低 通过SDS法提取的DNA的A260nm A280nm平均值为1 86 基本排除了酚类 多糖 蛋白质 等次生物质的干扰 RNA去除得干净 获得的DNA 溶液质量高 采用SDS法提取的板栗DNA的产率 为采用CTAB法提取的1 37倍 纯度也较高 获得 的模板DNA的质量和纯度完全能够满足PCR扩增 的要求 2 2DNA的琼脂糖凝胶电泳分析结果 图1 图2分别是采用SDS法和CTAB法提取 的DNA在琼脂糖凝胶上的电泳图谱 由图1可知 各个样品均有一条单一信号强度的主带 主带清 晰 完整性好 降解少 几乎没有弥散条带 样品孔 不发亮 说明RNA和蛋白质已去除干净 所得DNA 的质量较高 由图2可知 采用CTAB法提取的 DNA降解较多 完整性差 条带均弥散 但仍能提取 板栗果实的DNA 2 3双酶切和AFLP分析结果 以八月红板栗 羊毛栗 乌壳栗 中果早栗 六 月苞板栗 玫瑰红板栗 中迟栗 油栗为试验材料 采用SDS法提取DNA 并将双酶切后的DNA样品 连接接头后进行PCR扩增 然后取适量扩增产物在 1 5 的琼脂糖凝胶中电泳 每个样品均呈现出弥散 的带型 说明采用SDS法提取的DNA能被Eco R 表2采用SDS法所得DNA的吸光度及其比值 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 A260nm 0 798 0 326 0 286 0 798 0 756 0 786 0 453 0 367 A280nm 0 434 0 173 0 144 0 434 0 409 0 434 0 243 0 201 A260nm A280nm 1 84 1 88 1 99 1 84 1 85 1 81 1 86 1 83 表1采用CTAB法所得DNA的吸光度及其比值 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 A260nm 0 591 0 253 0 293 0 224 0 102 0 591 0 224 0 253 A280nm 0 349 0 151 0 176 0 135 0 062 0 349 0 135 0 151 A260nm A280nm 1 69 1 68 1 66 1 66 1 65 1 69 1 66 1 68 3102 第14期 责任编辑田宇曦 和Mse 两种限制性内切酶完全切割 并且AFLP 分析的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱条带清晰 带数 多 如图3所示 扩增条带信号强度一致性很好 条 带分布均匀 能够得到稳定 清晰 分辨率较高的指 纹条带 可进行板栗的遗传变异分析 3讨论 1 在分子水平的研究中 保证DNA的纯度很 重要 也是最基本的 它直接关系到后续试验能否 顺利进行 板栗果实研磨较难 耗时太长将影响 DNA的品质 在提取之前须先碎成小块再加液氮 板栗果实中的蛋白质 色素 蔗糖等成分含量较高 试验多次用氯仿提取能够有效除去样品中的蛋白 质 加速有机相与液相的分离 去除板栗果实中的 色素 蔗糖等 试验结果显示SDS比CTAB法更有 效 采用20 g L SDS和体积分数为2 的 巯基乙 醇提取后 再采用氯仿提取 所得DNA样品的纯度 高 所含蛋白质等小分子杂质少 符合随机扩增长 度多态性 AFLP 分析的要求 沉淀时间和温度对 DNA的产量和纯度都有影响 试验在 20 沉淀20 min 既使DNA充分沉淀又保证了纯度 由于DNA 是多聚阴阳离子的水溶性化合物 在沉淀时加入适 量的NaAc有助于DNA析出并且不会变性 7 2 在提取过程中 需要尽量保证板栗DNA的 完整性 主要从几个方面防止板栗DNA的降解 板栗果实质地较为坚硬 研磨较难 加液氮研磨时 要迅速 动作要轻柔 温和 尽可能将它研碎 温 育40 min时裂解还不够充分 DNA得率较低 温育 1 h才看到DNA絮状沉淀 因此 对板栗而言 在样 品研得很细的前提下 至少需要1 h才有足够的 DNA产生 由于板栗含有大量的色素和酚类物 质 提取的物质容易褐化 试验在缓冲液中加入体 积分数为2 的 巯基乙醇和20 g L聚乙烯基吡 咯烷酮 PVP 提取的DNA完全为白色絮状沉淀 没有出现褐化的迹象 提取物符合后续试验要求 而且试验还发现 最终将DNA溶于TE缓冲液中比 溶于去离子水中保存的时间更长 更不易降解 参考文献 1 周连第 兰彦平 曹庆昌 板栗基因组AFLP银染反应体系的建 立 J 果树学报 2006 23 1 17 20 2 陈旭辉 高玉葆 朱敏杰 小叶锦鸡儿基因组DNA的提取及 AFLP反应体系的建立 J 植物研究 2009 29 5 529 533 3 黄绍辉 方炎明 改进的SDS CTAB法提取濒危植物连香树 DNA J 武汉植物学研究 2007 25 1 98 101 4 DOYLE J J DOYLE J L A rapid DNA isolation procedure for small quantities of f