微生物基因重组.ppt

Genomeshuffling 李宏思2100659韩建帅2100667 目录 CompanyLogo 一 基因重组技术的历史 进入21世纪 面对石化资源 能源危机和环境危机日益加剧 以可再生生物资源为原料的生物技术产业展现出前所未有的竞争力 推动了工业菌株育种技术的发展 传统育种技术工程量巨大 耗时长 且难于获取复杂表型 近十几年里 工业菌株改造主要集中在代谢工程 一 基因重组技术的历史 将同源的DNA用DaseI进行消化成片段 然后将得到的随机片段无引物PCR 使之重新随机装配 从而获得了多种排列组合的突变基因库 最后利用设计好的引物PCR 得到预期的重组体 该方法是通过传统诱变与原生质体融合技术相结合 对微生物细胞进行基因组重排 从而大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度 使人们能够快速选育出高效的正向突变菌株 通过多亲本之间的DNA重组和全基因组片段交换 将优良表型重组在一起的过程 二 定义及原理 定义 基因重组 基因重组技术 PleasewritedownofcontentsexplanationforBusinessArea 是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合 形成新的DNA分子的过程 就是人类按照自身的需要和意愿 用类似工程设计的方式 将DNA在体外或体内进行组合 然后把组合后的DNA有目的的通过基因克隆 基因表达等方式形成人们所需要的新生物种或类型 二 定义及原理 定义 微生物n 基因重组微生物目前尚无权威性概念 专家于2007年1月在经充分讨论后认为 是指运用遗传学 基因工程和分子生物学技术 人工合成或对某种微生物的基因进行操作和修饰 并能表达 存活 从而使原有微生物的性状 功能等发生变化 而产生的新的生物体 基因重组 二 定义及原理 原理Genomeshuffling是一项对整个微生物全基因组进行重排的定向育种技术 它把传统微生物诱变育种技术与细胞融合技术结合 通过诱变手段获得若干正性突变株 并采用细胞融合方式使之全基因组发生重组 经过递推式多次融合 使基因组在较大范围内发生交换和重排 将引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中 最终获得具有多重正向进化标记的目标菌株 三 主要步骤 三 主要步骤 一 亲本菌株的选择亲本菌株基因的多样性可以扩大融合菌的基因型 在递归融合中促使不同优良表型汇集到融合菌中故基因组重排技术过程的首要任务是创造亲本基因型的多样性 一般手段是传统诱变育种技术 使菌株产生更多的基因型 作为筛选亲本菌株的一般准则是亲本菌株必须具有理想的目的表型 如具备特殊环境高耐受力 产物高产率和菌株高生长率 三 主要步骤 二 原生质体递归融合基因组重排技术是基于原生质体融合技术之上的多轮递归融合 多轮递归融合确保了不同细胞之间的基因高转移频率 还保持了基因组重排的高效性 在原生质体递归融合过程中 首先要制备原生质体 制备原生质体主要参考的因素有菌龄 酶解浓度 酶解时间及温度 酶的种类 脱壁辅助溶剂的选择和渗透压缓冲剂及再生培养基的设计等 递归融合的要义在于进行第一轮融合后筛选的融合菌株作为出发菌株 必须进入下轮融合 三 主要步骤 目前 诱导原生质体融合的方式主要有生物病毒法 化学法和电处理融合法 化学法和电处理融合法是当前最主要的方法 三 主要步骤 随着科学技术的不断发展 一些新的工具开始运用于诱导细胞融合 Gong等用激光诱导红发夫酵母进行细胞融合 Skelley等运用微流体芯片技术作为诱导细胞融合的技术平台 明显提高了融合效率 三 主要步骤 三 融合子的筛选目的融合菌的筛选与分离是整个基因组重排技术流程最为关键的步骤 基因组重排技术提高菌株对环境耐受性 可以方便设计含有高浓度的底物或产物的选择培养基 三 主要步骤 对于一些产酶的菌株可以采用较为直观的方法 如水解圈法 灿烂绿法 琼脂平板法等进行初筛 再对初筛获得的优良菌株进行较精细的复筛 其中复筛可能会进行几次 例如二次或三次复筛 并且每次复筛的方法都可能根据实验的不同而有所不一样 三 主要步骤 对于其它菌株可以采用对某些条件的耐受性进行筛选 但对于一些生产周期长的产胞内次级代谢产物的菌株 仍没有有效的筛选方法 目前已经开发了一些应用于DNA改组的高通量筛选方法 如 荧光激活细胞分类法 96孔板结合微板分光光度计进行高通量筛选 三 主要步骤 四 特点及其应用 基因组重排技术充分结合了细胞工程和代谢工程的优势 不仅可以进行菌种表型快速高效优化 还可为不同种类的微生物复杂的代谢和调控网络提供了信息来源 四 特点及其应用 基因重组技术的特点 能提高子代菌株的遗传多样性 该技术简单实用 容易推广 无需菌种背景知识 比传统诱变选育更快速有效 四 特点及其应用 1 比传统诱变选育更快速有效传统诱变通常是将每一轮产生的突变体库中筛选出的最优的1株菌作为下一轮诱变的出发菌株 而Genomeshuf fling则是将一次诱变获得的若干正性突变株共同作为出发菌株 经过递推式的多轮融合实现较大范围内的基因重组 效率更快更高 并可以基本避免诱变选育中因多次诱变导致的 钝化 反应和 饱和现象 在一定程度上克服了诱变选育存在的缺点 四 特点及其应用 2 能提高子代菌株的遗传多样性基因组改组技术源于原生质体融合技术 但两者最大区别在于基因组改组技术使用多亲本 而非双亲本 并且进行多轮递推式融合 能产生各种各样的突变组合 这将大大增加子代筛选群体内遗传多样性 从而提高了获得优良性状的菌株的几率 四 特点及其应用 3 该技术简单实用 容易推广 应用该技术对设备要求不高 费用较低 一轮基因组改组的费用略相当于一轮理化诱变的费用 同时该技术易于实施 不需要对工业微生物基因的结构和功能作详细了解 也不需要以工业微生物的代谢路线图及其代谢调控机制等理论作基础 因此 普通的育种工作人员在一般实验室条件下就可以运用该技术开展相关实验 容易广泛推广 四 特点及其应用 4 无须对菌种遗传背景十分清楚 有效地对由 多基因 调控的性状进行改良 Genomeshuffling技术在工业微生物菌种选育中的应用 四 特点及其应用 1Genomeshuffling技术改组细菌 在乳酸发酵生产中 乳酸菌同时具有底物抑制和产物抑制的发酵特征 因此通过提高乳酸菌的耐糖性和耐酸性 进而提高乳酸产量是乳酸生产中的一个重要研究方向 实例 于雷等对鼠李糖乳杆菌MEE539进行2轮基因组改组 获得1株改组菌株F2 2 在含15 葡萄糖的YE培养基中摇瓶发酵36h产酸能达到135 6g L 表明该改组菌在高糖条件下仍能有较高的产酸量 表现出很好的葡萄糖耐受性 1Genomeshuffling技术改组细菌 梁惠仪等从豆豉里面筛选得到1株具有纤溶酶活性的枯草芽孢杆菌DC 12 进行2轮基因组改组 从第1轮改组菌株中获得6株正突变株 与原始菌株DC 12一起作为亲本 进行第2轮改组筛选获得5株酶活在1600U mL以上 最高酶活2600U mL 的正突变株 较亲本菌株提高了4 5倍 表明在基因组改组过程中 结合原始菌株进行下一轮改组能获得很好的效果 2Genomeshuffling技术改组放线菌 朱惠等在改组纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌SG 1的过程中 对常规的改组技术操作路线作了改进 将第1轮shuffling再生菌落 包括融合体和亲本 不经过筛选 而直接用于制备原生质体后进行下一轮shuffling 最终仍筛选得到14株高产改组菌株 其中1株S gilvosporeusGS 74的纳他霉素产量为3574mg L 是产量最高的亲本菌株的1 5倍 比原始出发菌株SG 1提高1 17倍 改进后的技术路线既高效可行 又节省了时间和工作量 值得推广 3Genomeshuffling技术改组酵母菌 最近的研究表明 酵母菌耐高温和耐酒精的生化机理十分复杂 涉及到大量的基因产物及其相关的代谢途径因此用基因工程等正性育种手段 很难同时提高酵母菌的耐高温和耐乙醇性能 王灏等以3株酿酒酵母菌f4 f5 f6作为出发菌株 分别进行原生质体紫外诱变 通过在不同温度含不同乙醇浓度的一系列平板筛选 获得耐高温或耐乙醇性状有较大提高的7株正突变菌株 以这些菌株作为出发菌株 进一步用硫酸二乙酯诱变 获得了2株乙醇耐受性能较高的菌株 以上述9株优势菌为出发菌株 进行2轮shuffling 3Genomeshuffling技术改组酵母菌 筛选获得14株耐高温和耐乙醇浓度都较出发菌株有了较大提高的菌株 期摇瓶发酵过程中发酵液中的最高乙醇浓度为12 93 vol 比原始出发菌株f4 35 的发酵液中最高乙醇浓度8 11 vol 提高了约5 vol 证明通过Genomeshuffling的方法能将酵母菌耐高温和耐高乙醇的性能集中于同一菌株 从而选育出既耐受较高温度又耐受较高乙醇的菌株 该思路对于采用基因组改组技术选育同时具有多种性状的优良菌株有指导意义 具有潜在的应用价值 4Genomeshuffling技术改组霉菌 酱油是深受人们喜爱的大宗调味品 其酿造涉及到一个复合酶系 其中中性蛋白酶是主要的代表酶 因而提高菌种的中性蛋白酶酶活对酱油酿造是很有益的 李立风等对分离自曲精的曲霉BI进行2轮基因组改组 从第1 2轮shuffling的F1和F2代融合株中分别筛选到6株和7株酶活较高的菌株 分析发现F2代菌株的平均酶活更高 不过酶活最高的菌株是F1 103 表明在改组过程中 对于个体来说 优良表型的获得有一定的不确定性 但是就整体而言 基因组改组过程中正性突变的累计效应是很明显的 4Genomeshuffling技术改组霉菌 同时 该技术路线在原生质体灭活和融合等各个环节均体现出随机性 以增加基因组交换和重组的机率 无形中增大了获得优良菌株的概率 结果表明这种思路是可行的 五 两面性 五 两面性 贡献 医药产业 农业 工业 环境保护 能源开发 21世纪人类进入知识经济时代 随着医学科学 生物技术 药学科学的发展 世界医药界将发生新的转变 医疗模式将由治疗为主向预防为主转化 制药将由以化学药为主向生物技术药物和天然产物综合利用开发转变 以生物技术开发未来药物已成为制药企业新药开发的重要手段 增长最快的为基因重组药物 疫苗居第2位 治疗范围包括肿瘤 类风湿关节炎等 从生物技术药物制备及使用分析看 具有环境污染少 不受资源限制 临床使用毒副作用低等特点 显示了强大的生命力 将成为21世纪药物市场重要的组成部分 1 医药产业 2 农业 植物转基因技术开辟了植物改良的新时代 自1983年人类首次获得转基因烟草和马铃薯以来 转基因动 植物研究和开发势不可挡 转基因技术可提高育种目标的准确性 实现超远缘育种 缩短一半育种时间 1986年转基因农作物获得批准进入田间试验以来 截止2000年 经济合作与发展组织 OECD 国家共批准10313例转基因生物进入田间试验 其中植物占总数的98 4 细菌占1 0 病毒占0 3 真菌0 2 动物占0 1 3 工业 采用基因工程和蛋白质技术构 基因工程菌 己经生产出许多可供人 畜食用的糖类 氨基酸 蛋白质 调味剂 食用色素 酒类等产品 在可再生资源的开发 清洁生产 控制污染 减少成本等方面起着重要作用 对于缓解 粮食问题 对土地的压力具有重要意义 传统发酵工业罐中 由菌种生产的发酵产品数量大 应用广 对全球经济影响十分巨大 例如抗生素 氨基酸 有机酸 酶制剂 醇类和维生素等 这些菌种基本上都经过长期的诱变或重组育种 生产性能很难再会大幅度提高 要打破这一局面 必须使用基因工程手段才能解决 目前在氨基酸 酶制剂等领域已有大量成功的例子 4 环境保护 在环境保护方面利用基因工程可培育同时能分解多种有毒物质的遗传工程菌 这类新型遗传工程菌在防治污染 保护环境方面有很大潜力 此外 通过DNA操纵得到不同类型的基因工程菌 可在贫矿中提取金属 随着人们环境保护意识的日益增强 生物农药因其不污染环境 对人和动植物安全 选择性强 不伤害害虫天敌 害虫难以产生抗药性 而受到世界各国的高度重视 被誉为 绿色农药 是未来农药发展的方向 微生物农药在生物农药中占有重要地位 它是利用微生物本身或其代谢产物防治病 虫 杂草的制剂 已知的昆虫微生物病原体1000多种 细菌1o多种 真菌750多种 其余为病毒 线虫 原生动物等 这些病原体都可作为防治病虫的资源开发利用 5 能源开发 生物能源将成为未来人类能源中的一个重要组成部分 目前利用微生物发电 制造氢气 生物柴油和燃料乙醇已成为现实 成为解决未来能源问题的一条重要出路 美国 日本研究人员建构的 工程光合细菌 达到较高的产氢率 近几年来 科学家已经发现30一40种化能异养菌可以发酵糖类 醇类 有机酸等 从而产生氢气 在光合细菌中 人们发现了13一18种紫色硫细菌和紫色非硫细菌能够产氢气 据 大众科技报 报道 早在1900年 英国植物学家发现有几种细菌的培养液能够产生电流 于是就以铂作电极 放入大肠杆菌或普通酵母菌的培养液 成功地制造出世界上第一个细菌电池 1984年 美国科学家设计了一种可供太空飞船使用的细菌电池 其电极的活性物质是航天员的尿液和活细菌 不过这种装置放电率较低 我国科学家也在实验室成功的用异化金属还原菌把有机酸和糖类物质所含有的能量转化为电能 CompanyLogo 基因治疗的安全性问题 对生物多样性和环境的影响 实验室泄露或意外事故等安全隐患 生物恐怖和生物武器的威胁 超级致病微生物 的出现 五 两面性 可能引起的生物威胁 超级致病微生物 的出现 随着生物高技术门槛的降低 微生物作为一类模式生物 除在医药 农业 工业等领域具有广阔的应用前景外 对基础研究的贡献也十分重要 因此 许多实验室都在开展微生物的基因重组和基因改造的研究工作 而在研究过程中 可能意外研制出威胁巨大的新型人工病原体 如2001年 澳大利亚科学家将白细胞介素4基因插入鼠痘病毒 意外发现该病毒可以导致实验鼠的大量死亡 美国科学家在军方的支持下改进了该实验 可使疫苗失效 造成实验动物全部死亡 超级致病微生物 的出现 此外 随着基因工程的不断发展和广泛应用 基因重组技术由于可以使动物 植物 微生物甚至人的基因进行相互转移 转基因生物已经突破了传统的界 门概念 具有普通物种不具备的优势特征 加之微生物具有代谢活跃 容易变异 繁殖快等特点 若释放到环境 如发生基因漂移或载体介导的外源基因发生横向转移 重组出新的菌株 则可产生新的致病微生物 由于GEMs不断地被释放进入自然环境 而环境中微生物间的基因转移十分普遍 以大肠杆菌为例 据估计其10一16 的遗传物质源于基因转移 超级致病微生物 的出现 有研究结果表明 在土壤中接种产乙醇的植生克雷伯菌sDF20可存活8周以上 它可以引起某些食真菌线虫增长并导致引种的小麦死亡 还有报道表明 基因的转移能够在农作物与微生物之间自然发生 许多转基因作物中都含有抗抗生素的基因 这些基因可能会随着作物残茬或共生作用而转入细菌 从而使相应抗生素对这类细菌失去作用 导致 超级致病微生物 的出现而引起传染病的暴发 CompanyLogo 随着科学技术的不断发展 国际社会普遍认为生物恐怖和生物武器的潜在威胁已大大增加 其主要原因 是相对于核 化武器 生物武器研究和生产可繁可简 成本低廉容易大批量生产 且隐蔽性高 携带方便 易于造成大面积恐慌 是以美国炭疽事件为标志生物恐怖对国际安全已经构成了现实威胁 是一些国家和地区可能仍在继续研发生物武器 今后生物战将会以人或动 植物的疫情突发为主要战争样式 是生物技术的迅速发展大大增强了生物武器的潜在威胁 生物技术的发展使基因武器和种族基因武器成为现实 生物恐怖和生物武器的威胁 实验室泄露或意外事故等安全隐患 微生物学实验室管理上的疏漏和意外事故不仅可以导致实验室工作人员的感染 也可造成环境污染和公众感染 1990年后 世界各地有多个实验室报道了 例布氏杆菌引起的实验室感染 结核菌实验室感染也较多 2000年美国2个实验室各发生1例流行性脑膜炎球菌感染 2001年美国在 邮件事件 发现的炭疽芽抱粉末 根据其纯度 粒径及在空中漂浮分散的性能分析 应该来自于非常专业的实验室 2003年9月 12月和2004年4月新加坡 台湾和我国国家的专业实验室均发生了SARS的实验室感染 对生物多样性和环境的影响 基因重组微生物由于经过遗传修饰和改造 具有普通物种不具备的优势特征 若释放到环境 可能会改变物种间的竞争关系 破坏原有自然生态平衡和自然界的生物基因库 对生物多样性或环境产生危害 如基因工程作物的Bt持续而不可控制地产生大剂量的Bt毒蛋白 能大规模消灭害虫 这就可能造成这些害虫的天敌数量下降 威胁生态平衡 对生物多样性和环境的影响 由于环保工程菌必须直接进入自然环境才能发挥作用 而基因改造后的用于环境治理的工程菌极易繁殖 极易进入其它生物体 且对极端环境的耐受力和发生变异的机率也较高 一旦释放入自然环境将很难控制 隐藏着极大的危险性 例如利用工程技术制备的高效纤维素降解工程菌 对于造纸废水治理是很有价值的 但如果不能确保这种工程菌只降解废物而不降解有价值的原材料 将会给森林带来灾难性的后果 用于基因治疗的病毒载体目前尚未有载体导致靶细胞恶变的报道 但存在细胞毒作用引起免疫反应的可能 也可能发生突变而引起新的肿瘤 如腺病毒具有免疫原性 容易引起细胞和体液免疫反应 疙疹病毒 HSv 载体的基因表达产物对宿主细胞具有毒性 也会引起严重的免疫反应 基因治疗的安全性问题 五 两面性 基因重组微生物生物安全威胁的特点 一 生物安全威胁的不确定性 1 生物安全威胁性质和来源的不确定性 2 生物安全威胁的判断的不确定性 3 生物安全威胁应对机制 管理机制 的不确定性 五 两面性 二 生物安全威胁的扩散难以预防 1 生物技术的两用性 2 管理机制的不统一性 三 生物安全威胁造成的危害难以消除 1 基因污染难以消除 2 生物危害具有长期性 特点及其应用 Genomerearrangementshavebeenstudiedin30c proteobacterialcompletegenomesbycomparingtheorderofareducedsetofgenesonthechromosome Thissetincludedthosegenesfulfillingseveralcharacteristics 应用举例 Theduplicatedgeneevolvedfasterthantheoriginalgene probablyleadingtoaspecializationoffunctionoftheduplicatedcopy 六 存在的问题及展望 仍然存在的问题 基因组重排技术应用菌种改良 由于基因组片段重组也是随机的并不具备定向性 如何高效筛选目的表型融合菌存在着一定的困难和挑战 基因组重排技术目前普遍运用于同种双亲细胞内 对于不同种亲本细胞之间的报道还是很少 同源性越差 重