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学士学位论文学士学位论文 设计设计 文 献 综述 题 目 植物体细胞杂种的线粒体遗传组分研究 姓 名 汪晶 学 号 20020609031 专 业 园艺 指导教师 蔡兴圭 职 称 讲师 中国 武汉 二 六 年 五 月 植物体细胞杂种的线粒体遗传组分研究 摘 要 体细胞杂交技术能有效克服远缘有性杂交不亲和 雌雄配子不育等生物学障碍 而且能实现核 基因及胞质基因的重组与转移 为利用野生资源的优良基因开辟了一条新途径 研究体细胞杂交中胞质 基因组的遗传规律 是植物体细胞杂交的后续实验中十分重要的一部分 它不仅能为体细胞杂种的鉴定 提供可靠的证据 而且 细胞质基因中的线粒体基因已被证明与细胞质雄性不育 植株形态异常等性状 密切相关 本文就体细胞杂种线粒体基因组的遗传规律及研究方法进行了概述 关键词 体细胞杂种 线粒体基因组 mtDNA 分子标记 植物原生质体融合能够实现作物的远缘重组 有效克服有性杂交不亲和 花器官败育 花期不遇 生殖隔离等障碍 因此在理论和生产实践中有着重大意义和作用 该技术为解决有性生殖造成的胞质遗 传基础狭窄问题提供了新方法 创造了许多新的植物基因型 极大地丰富了植物种质资源库 人们已经 注意到细胞质基因组控制着植物的许多性状 如叶绿体与植物光合性能及某些抗性有关 叶绿体和线粒 体均与雄性不育 CMS 有关 体细胞杂交技术不仅可以使双亲的细胞核发生基因重组 还可以使双亲 的细胞质基因组重新组合 程运江 2003 近几年 体细胞杂种的叶绿体和线粒体遗传规律的研究越 来越引起重视 胞质遗传 cytoplasmic inheritance 已是现代植物生命科学研究中最为活跃的领域之一 1 植物线粒体基因组的结构 线粒体DNA mitochondrial DNA mtDNA 是一种细胞核外的遗传物质 通常是共价闭合环状双 链分子 同其它真核生物相比 植物线粒体基因组的结构和大小是高度变化的 植物mtDNA 分子的结 构为大小不同的环状和线状分子的复杂集合体 通常由一个主基因组和由它重组衍生出来的一系列分子 组成 来源于核基因组或叶绿体基因组的DNA 片段可与mtDNA 组成一些混杂的DNA 区段 植物 mtDNA 为裸露的双链DNA 分子 在不同作物中差异很大 一般在200 kb 油菜 至2500 kb 香瓜 之间 地钱和拟南芥线粒体基因组测序工作的完成 阐明了mtDNA 的编码冗余及外来片段重组是高等 植物线粒体基因组高度变异的原因 曹庆芹 2003 几乎在所有植物线粒体基因组中都检测到可发生 重组的活跃重复序列 这些序列将线粒体基因组分割成许多冗余的亚基因组分子 另外还有一种不活跃 的短序列 能在基因内部发生重组 形成新的开放读码框架 Andre et al 1992 2 原生质体融合中线粒体基因组的遗传 同叶绿体基因组的遗传相比 体细胞杂种和胞质杂种线粒体基因组的遗传表现出复杂的分离 重组 和重排 Cardi 等 1999 指出 两融合亲本的质体基因组只有细微的差别 而两个种之间线粒体的多 态性很大 融合再生植株中 细胞器发生了重新分配 线粒体发生了重排 例如 在普通马铃薯Solanum tuberosum tub 与其野生种S commeronii cmm 融合再生植株中 有75 的胞质杂种的线粒体表现出非 亲本的RFLP 带型 mtDNA 中cmm 占有一定区域而另一区域又是tub 的带型 可能是线粒体发生重组 所致 mtDNA 的多态性程度因区域而异 如cox3 rrn26 rrn3 rpl16 是高度保守的 而cox1 atp9 rrn18 rrn5 nad1 和其它区域是多变的 变异区域似乎不受基因拷贝数的影响 有些亲本中mtDNA 片 段在体细胞杂种中发生了共分离 暗示了要么是线粒体染色体的物理连锁 要么是生理上的需求 在杂 种中要有同一来源的基因产物 Wolters et al 1993 Kemble 等 1986 对马铃薯叶肉原生质体再生 植株的线粒体变异进行了研究 发现线粒体明显发生了两种变化 1 高分子量mtDNA 序列发生了变 化 2 小分子额外mtDNA 的出现 结果表明 原生质体操作能引起线粒体分子的多态性 Kemble 等 1986 发现 Solanum tuberosum Solanum brevidens 的体细胞杂种中 mtDNA 的一个区域发生了变 化 出现了从零到广泛的分子内和分子间重组 该重组涉及到线粒体基因组的许多 重组热点 recombination hotspots 并非所有来源于相同愈伤组织的再生植株都具有相同的线粒体基因组 表 明融合体系中线粒体的排除在植株再生阶段尚未完成 是一个长期的过程 有的则发生mtDNA 的重组 且能稳定遗传 再生植株中出现mtDNA 重组的有烟草 矮牵牛 胡萝卜 油菜 甘蓝和柑橘 程运江 2003 Kemble 等 1986 认为 线粒体的重排可能与原生质体融合是独立的 Kemgle 等研究的杂 种植株中有一半发生了mtDNA 重组或重排 因此认为原生质体融合体系提供了不相容mtDNA 的多样 性或种特异性mtDNA 编码性状的潜在机制 由于亲本mtDNA 的重组 杂种mtDNA 包含有各亲本的特 异性序列和一些新的限制性片段 Pelletier et al 1995 Xu 等 1993 对南美野生的二倍体马铃薯Solanum brevidens 和马铃薯栽培种S tuberosum 进行化学融合和电融合 并对得到的19个杂种植株的mtDNA 进 行了RFLP 分析 发现19 的RFLP 带型与亲本之一相同 其余的都表现出新的RFLP 带型 表明在体 细胞杂种中 mtDNA 重排的几率很高 而且可以看出 两种融合方式中mtDNA 重组或重排的几率无 明显差异 在体细胞融合中 除了mtDNA 重组 重排外 还有发现线粒体质粒丢失的报道 Roger 等 1988 通过原生质体融合创造出了新的核 线粒体 叶绿体组成的油菜植株 发现融合导致了mtDNA 质粒的丢失 几率为12 5 更为奇怪的是 一个原生质体群体中的线粒体被转移到另一群体中 几 率为6 1 而含有新DNA 组成的线粒体在再生植株中成为显性细胞器群体 通过广泛的有性世代研 究表明它们遵循严格的母性遗传 与线粒体基因组稳定性形成对比的是在某些油菜株系中的13 kb 线粒 体质粒在原生质体融合体系中是不稳定的 然而这种不稳定性证实了原生质体融合能够有选择性地转移 植物的线粒体 Roger et al 1988 细胞质杂种的产生是由于亲本细胞器基因组中的质体或线粒体的交 换或重组 程运江 2003 3 体细胞杂种线粒体遗传组分的研究方法 体细胞杂种胞质基因组的研究手段随着现代生物技术的发展而不断革新 上世纪中叶 人类利用组 织化学方法认识到细胞质基因组的存在 后来利用同位素示踪或生化标记 同工酶 方法对细胞质基因 表达产物进行研究 以推断胞质基因组结构特征 程运江 2003 随着分子生物学技术的发展 目前 有许多方法可以用来检测体细胞杂种中的胞质来源 采用分子标记分析体细胞杂种胞质遗传组分分析结 果有以下几种情况 第一 再生植株为双亲电泳谱带之和 从一个带型图上即能看出胞质遗传组成特性 第二 再生植株在某些酶 引物 探针的带型图上具有一个亲本的特异带 而在其它酶 引物 探针的带型图 上具有另一个亲本的特异带 结合起来才能看出杂种胞质遗传组成特性 第三 在一个酶 引物 探针的 带型图上能看到融合双亲的特异带 但还出现了新的带或发生了带的丢失 上述三种情况均可以认为再 生植株为胞质融和类型 第四 胞质未融合类型 即在酶 引物 探针的带型图上只能看到融合双亲某一 方的特异带 而看不到另一方的特异带 刘继红等 2004 以下主要就几种常见的分子标记方法进行比较分析 3 1 RFLP 分析 RFLP restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 是应用最早的DNA 分子 标记 其基本原理是 基因组DNA 经限制性内切酶消化后 通过琼脂糖凝胶电泳 Southern 印迹到尼 龙膜或硝酸纤维膜上 与同位素或生物素标记的特定探针杂交 以显示限制性DNA 片段大小差异的标 记方法 这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点之间DNA 区段发生突变引起的 RFLP 标记 是共显性标记 在植物细胞质基因组研究中 RFLP 标记是迄今使用最多 被公认为可靠性最高的分子 标记 RFLP 技术具有多态性好 重复性强 结果可靠等优点 但同时也存在对DNA 的质量要求比较高 且要求DNA 的量大 操作步骤繁琐 费用高等缺点 另外 RFLP 结果易受假基因的干扰 线粒体假 基因几乎都是完整的 如拟南芥中的rps14 和sdh4 基因 对这些基因只有通过序列测定才能鉴别 Adams et al 2002 这些都限制了RFLP 技术大范围的应用 3 2 AFLP 分析 AFLP amplified fragement length polymorphism 扩增片段长度多态性 实际上是RFLP 与PCR 相 结合的一种技术 其基本原理是基于PCR 技术扩增基因组DNA 限制性片段 基因组DNA 先用限制性 内切酶切割 然后将双链接头连接到DNA 片段的末端 接头序列和相邻的限制性为点序列 作为引物 结合为点 从而实现特异扩增 扩增产物利用测序凝胶放射自显影或银染方法检测多样性 AFLP 应用于体细胞杂种线粒体遗传组分分析的优点在于 1 DNA 用量较少 2 多态性检测 能力高 AFLP 既能检测酶切位点不同造成的多态性 又能检测随机选择碱基造成的多态性 3 简单 高效 AFLP 一次选择扩增就能比较几十甚至上百个位点 4 分辨率高 AFLP 扩增片段短 片段多 态性检出率高 5 可靠性好 AFLP 由于是特定引物扩增 退火温度高 因而假阳性低 重复性好 胞质AFLP 技术缺点在于 1 AFLP 技术受到专利保护 试剂盒昂贵 成本较高 2 须提取体 细胞杂种的mtDNA 且对mtDNA 的纯度和内切酶的质量要求较高 曹庆芹 2003 技术要求高 3 3 CAPS 分析 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequences 酶切扩增多态性序列 又称为PCR RFLP 标记 是特异引物PCR 与限制性内切酶相结合而产生的一种DNA 标记 当特异扩增产物的电泳谱带不表现多 态性时 可用限制性内切酶对扩增产物进行酶切 然后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离以显示多 态性 CAPS 标记的理论基础是由于植物胞质基因某些编码区域高度保守 非编码区存在丰富的变异 于 是开发了特异的PCR 引物 将PCR 技术运用于植物细胞质基因组的研究 另外 部分叶绿体和线粒体 PCR 引物跨物种使用成功 从而发展成为通用引物 universal primer 该引物的开发为其它胞质基因 组序列未知的作物开展胞质遗传分析提供了新方法 程运江 2003 CAPS 标记的最大优点在于 1 它是一种基于PCR 的标记 操作十分简便 DNA 用量极少 特别适合于植株的早期分析 2 它不涉及同位素 无需特殊的实验及防护设备 操作比较安全 CAPS 标记是一种比较大众化的分析方法 CAPS 分析的不足之处在于 1 CAPS 分析检测位点有限 一般扩增片段长度在3 kb 范围内 相对数百或上千kb 的植物胞质基因组 这一区域的代表性不够充分 2 对于胞质基因组序列未知的 作物 可供CAPS 分析的引物来源有限 3 限制性内切酶的筛选带有一定的盲目性 一些多态性好 的内切酶可能十分昂贵 4 CAPS 分析无法知道扩增区域的拷贝数 3 4 方法评价 RFLP 分析具有多态性好 重复性强 结果可靠等优点 AFLP 分析灵敏度高 结合了RFLP 和PCR 技术的优点 但这两种分析方法均要求分离和纯化植物的细胞器DNA 因而需要材料量大 操作烦琐 并且成本较高 使其应用受到限制 相比之下 CAPS 分析的主要优点在于 该方法易操作 低成本 直接用总DNA 进行扩增 无须 分离细胞器DNA 样品用量少 特别适合于对杂种进行早期遗传分析 Besnard 和 Bervill 2002 认为 在胞质基因组分析中 CAPS 等分子标记比 RFLP 标记揭示的多 态性更丰富 结论更可靠 参考文献 1 邓秀新 胡春根 园艺植物生物技术 北京 高等教育出版社 2005 8 2 牛屹东 李明 魏辅文 冯祚建 线粒体DNA用作分子标记的可靠性和研究前景 遗传 2001 23 6 593 598 3 齐小辉 马玺 赵凯 王世伟 马玉超 周东坡 线粒体DNA及其应用 生物技术通讯 2003 9 5 14 4 刘继红 邓秀新 粗柠檬与哈姆林甜橙二倍体体细胞杂种胞质基因组初步分析 植物学报 2000 42 1 102 104 5 刘继红 徐小勇 邓秀新 柑橘体细胞杂种及其核质遗传研究进展 农业生物技术学报 2004 12 3 237 246 6 曹庆芹 柑橘雄性不育资源线粒体DNA 的遗传多型性研究 博士学位论文 武汉 华中农业大学 图书馆 2003 7 曹庆芹 伊华林 邓秀新 两种柑橘线粒体 DNA 的获得与 AFLP 分析 园艺学报 2003 30 4 389 393 8 程运江 郭文武 邓秀新 印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析 遗传学报 2002 294 364 369 9 程运江 柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR 引物开发研究 博士学位论文 武汉 华中农业大学图 书馆 2003 10 舒常庆 体细胞杂交在植物育种中的应用研究进展 经济林研究 1995 13 4 69 72 11 蔡兴奎 原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析 博士学位论文 武汉 华中 农业大学图书馆 2002 12 Adams K L Qiu Y L Stoutemyer M Palmer J D Punctuated evolution of mitochondrial gene content High and variable rates of mitochondrial gene loss and transfer to the nucleus during angiosperm evolution Proc Natl Acad Sci USA 2002 99 15 9905 9912 13 Andre C Levy A Walbot V Small repeated sequences and the structure of plant mitochondrial genomes Trends Genet 1992 8 128 132 14 Besnard G and Bervill A On chloroplast DNA variations in the olive Olea europaea L complex comparison of RFLP and PCR polymorphisms Theor Appl Genet 2002 104 1157 1163 15 Bastia T Scotti N Cardi T Organelle DNA analysis of Solanum and Brassica somatic hybrids by PCR with universal primers Theor Appl Genet 2001 102 1265 1272 16 Cardi T Bastia T Monti L Earle E D Organelle DNA and male fertility variation in Solanum spp and interspecific somatic hybrids Theor Appl Genet 1999 99 819 828 17 Kemble R J Barsby L Wong R S C Shepard J F Mitochondrial DNA Rearrangements in somatic hybrids of Solanum tuberosum and Solanum brevidens Theor Appl Genet 1986 72 787 793 18 Pelletier G Ferault M Lancelin D Boulidard L Engineering of cytoplasmic male sterility in vegetables by protoplast fusion Acta Hort 1995 293 11 17 19 Roger J K Tina L B and Stephen A Y Transformation of plant mitochondria with mitocjondroal DNA plasmids via protoplast fusion Mol Gen Genet 1988 213 202 205 20 Wolters A M A Vergunst A C Van Der Werff F Koornneef M Analysis of nuclear and organellar DNA of somatic hybrid calli and plants between Lycopersicon spp and Nicotiana spp MolGeneral Genetics 1993 241 5 6 707 718 21 Xu Y S Jones M G K Karp A Pehu E Analysis of the mitochondrial DNA of the somatic hybrids of Solanum brevidens and S tuberosum using non radioactive digoxigenin labelled DNA probes Theor Appl Genet 1993 85 1017 1022 学士学位论文学士学位论文 题 目 马铃薯种间体细胞杂种线粒体遗传组分分析 姓 名 汪 晶 学 号 20020609031 专 业 园 艺 指导教师 蔡兴奎 职 称 讲 师 中国 武汉 二 六 年 五 月 华中农业大学学士学位论文 设计 I 目 录 摘 要 II 关键词 II Abstract II Key words II 1 前言 3 1 1 课题的提出 3 1 2 前人的研究进展 3 1 2 1 植物线粒体基因组的结构 3 1 2 2 体细胞杂种线粒体基因组的遗传 4 1 2 3 体细胞杂种线粒体遗传组分的研究方法 4 1 3 本研究的目的和内容 5 2 材料与方法 5 2 1 实验材料 5 2 2 实验方法 5 2 2 1 植物材料的繁殖 5 2 2 2 马铃薯基因组 DNA 小量抽提法 5 2 2 3 线粒体通用引物 5 2 2 4 PCR 反应体系与程序 6 2 2 5 亲本扩增片段的回收 6 2 2 6 差异片段的 A T 克隆转化测序 6 2 2 6 1 连接反应 7 2 2 6 2 转化 7 2 2 6 3 转化子的筛选与测序 7 3 结果与分析 7 3 1 线粒体通用引物筛选 7 3 2 利用线粒体通用引物直接扩增结果 8 3 3 两亲本线粒体扩增片段的克隆 测序与比较 12 4 讨论 14 4 1 CAPS 技术在胞质遗传组成分析中的应用 14 4 2 体细胞杂种的线粒体遗传组分 15 4 3 本研究的不足与展望 15 参考文献 16 致 谢 17 华中农业大学学士学位论文 设计 II 马铃薯种间体细胞杂种线粒体遗传组分分析 摘 要 本实验以马铃薯栽培种 中薯二号 的无性系 3 8 与野生种 Solanum Chacoense 叶肉原生质体 融合再生的体细胞杂种株系及其亲本植株为材料 筛选能区分两融合亲本线粒体基因组 mitochondrial DNA mtDNA 的特异的 CAPS 引物并应用于 116 份再生体细胞杂种的线粒体遗传组分分析 总共筛 选了 7 对线粒体通用引物 其中 Primer3 和 Primer4 能重复稳定扩增出栽培种亲本特征带型 用这 2 对 引物检测了 116 份体细胞融合后代 结果显示 2 对引物均能扩增出栽培种亲本 mtDNA 的占 44 8 均未扩增出栽培种亲本 mtDNA 的占 37 1 另有 18 1 用 2 对引物扩增结果不相符 此外 还有少数 株系有新的带型出现 将两亲本的差异片段进行测序 扩增片段序列经 NCBI National Center for Biotechnology Information 基因库 Blastn 检索结果表明 回收的扩增片段与烟草 Nicotiana tabacum 线粒体基因组 DNA 具有最高同源性 并且与本实验克隆的差异片段具有较高同源性的序列 均为线粒 体基因组序列 由此确定扩增片段确为马铃薯线粒体基因组 DNA 关键词 马铃薯 体细胞杂种 线粒体 DNA CAPS The analysis of mitochondrial genome in interspecific somatic hybrids of potato Abstract In the present study 116 somatic hybrids derived from the two fusion parents potato clones 3 and 8 2n 4x 48 which were derived from c v Zhongshu 2 by pollination inducing and diploid species Solanum chacoense 2n 2x 24 was analyzed by cleaved amplified polymorphic sequence CAPS Of the 7 pairs of selected mitochondrial DNA mtDNA universal primers only 2 Primer3 and Primer4 generated stable and repeatable bands of cultivated specie By testing the 116 somatic hybrids with the 2 primer pairs it is shown that 44 8 of the hybrids have inherited the mtDNA of cultivated specie parent 37 1 not and the other 18 1 cannot give an accordant result In addition new bands have been found in some of the hybrids The differently amplified mtDNA fragments of the parents were cloned and sequenced It is indicated that the specific bands of the two fusion parents both have a high similarity to mtDNA of Nicotiana tabacum All the sequences homologous analysis demonstrated that the amplified fragments in the present research were truly mtDNA of potato Key words Potato Somatic hybrid mtDNA CAPS 华中农业大学学士学位论文 设计 文献综述 3 1 前言 1 1 课题的提出 马铃薯 Solanum tuberosum L 是茄科茄属的草本块茎植物 因其具有产量高 适应性强 营 养丰富 粮菜兼用 综合加工用途广泛等特性 成为世界上仅次于小麦 水稻 玉米的第四大粮食 作物 在我国 马铃薯不仅是主要的粮食作物 而且是全国的大宗蔬菜 牲畜饲料和重要加工原料 现我国已成为世界上第一大马铃薯生产国 发展马铃薯生产具有重要的战略意义 青枯病 Ralstonia solanacearum 是马铃薯的毁灭性土传病害 被称为植物的 癌症 至今生 产上对马铃薯青枯病还没有有效的防治措施 一般的化学药剂及农业综合防治 效果都不明显 综 合防治措施虽可以起到一定的效果 但难以大面积推广 化学防治不但增加生产成本 污染环境 同时还会导致抗药生理小种的产生 实践证明 只有培育抗病品种才是最经济有效的途径 并且利 用抗病品种已在烟草和花生等作物的青枯病防治上取得了理想效果 Fock et al 2000 育种上的突破性进展往往依赖于特殊种质资源的发掘与利用 马铃薯种质资源研究表明 目前 的四倍体普通栽培种 S tuberosum 中没有青枯病的抗源 而在野生种 S chacoense S microdontum 以及原始栽培种 S phureja 等资源中存在青枯病的抗性或耐病基因 Tung et al 1990 这些抗病种 质均为二倍体 由于种间倍性水平和胚乳平衡数的差异 这些野生资源很难直接与栽培种杂交 限 制了野生资源的优良基因的利用 Laferriere 等 1999 Fock 等 2000 利用体细胞杂交技术 分 别将二倍体野生种 S commersonii 和原始栽培种 S phureja 与栽培种双单倍体融合 获得了部分抗 青枯病的四倍体杂种株系 现有的资料显示 马铃薯青枯病抗性是由多基因控制的 Grimley 和 Hanson 1998 等认为 至少有四个主效基因参与了马铃薯抗青枯病反应 对于转移这种多基因控 制的抗病性性状 甚至存在胞质基因参与调控的情况下 利用体细胞杂交技术将更为有效 蔡兴奎 2002 体细胞杂交技术能有效克服远缘有性杂交不亲和 雌雄配子不育等生物学障碍 舒常庆 1995 而且 与有性杂交相比 不仅能实现核基因的重组 而且能够实现线粒体和叶绿体等胞质基因控制 的性状转移和重组 为利用野生资源的优良基因开辟了一条新途径 到目前为止 对马铃薯体细胞杂交的研究大多数仍停留在融合技术及杂种鉴定等方面 缺乏对 杂种植株线粒体遗传组分的分析 细胞质基因中的线粒体基因已被证明与细胞质雄性不育 植株形 态异常等性状密切相关 刘继红和邓秀新 2000 但与马铃薯青枯病抗性的关系尚不清楚 本研究 拟在本实验室通过体细胞杂交技术创造一批抗青枯病的马铃薯新种质基础上 通过 CAPS 技术开展 马铃薯体细胞杂种胞质遗传研究 分析马铃薯青枯病抗性与其核质互作关系 有助于明确马铃薯青 枯病抗性遗传规律 为马铃薯抗青枯病育种提供可供利用的抗性种质 1 2 前人的研究进展 1 2 1 植物线粒体基因组的结构 线粒体DNA mitochondrial DNA mtDNA 是一种细胞核外的遗传物质 通常是共价闭合环状 双链分子 同其它真核生物相比 植物线粒体基因组的结构和大小是高度变化的 植物线粒体DNA 为 大小不相同的环状和线状分子 主环与次环的复杂集合体 不同植物线粒体基因组的大小差异很大 介于186kb 地钱 2400kb 甜瓜 之间 曹庆芹 2003 线粒体基因组中含有叶绿体DNA 的片 段 大约占基因组的1 Unseld et al 1997 多种植物存在线粒体类质粒或质粒 增加了线粒体 DNA 的多态性 Levings and Brown 1989 几乎在所有植物线粒体基因组中都检测到可发生重组 的活跃重复序列 这些序列将线粒体基因组分割成许多冗余的亚基因组分子 另外还有一种不活跃 的短序列 能在基因内部发生重组 形成新的开放读码框架 Vedel et al 1994 华中农业大学学士学位论文 设计 文献综述 4 1 2 2 体细胞杂种线粒体基因组的遗传 叶绿体DNA的多态性主要来自于点突变 线粒体DNA 多态性则主要来自于重复序列引起的基 因重排 Palmer and Herbon 1988 杂种线粒体的遗传组成受核背景的影响 异源四倍体体细胞杂 种较二倍体胞质杂种的线粒体的遗传组成更为复杂 双亲共有的线粒体区域很容易传递给杂种后代 另外 线粒体的传递能力与亲本的基因型有关 在起源与进化中越古老的品种 将其线粒体传递给 后代的能力越强 程运江 2003 与叶绿体基因组的遗传相比 体细胞杂种线粒体基因组的遗传表现出复杂的分离 重组和重排 Cardi 等 1999 指出 两融合亲本的质体基因组只有细微的差别 而两个种之间线粒体的多态性 很大 融合再生植株中 细胞器发生了重新分配 或 和 线粒体发生了重排 在普通马铃薯S tuberosum tub 与其野生种S commeronii cmm 融合再生植株有75 的胞质杂种的线粒体表现出非 亲本的RFLP 带型 mtDNA 中cmm 占有一定区域而另一区域又是tub 的带型 可能是线粒体发生 重组所致 在体细胞融合中 除了mtDNA 重组 重排外还有发现线粒体质粒丢失的报道 Roger 等 1988 通过原生质体融合创造出了新的核 线粒体 叶绿体组成的油菜植株 发现融合导致了 mtDNA 质粒的丢失 几率为12 5 Xu 等 1993 对南美野生的二倍体马铃薯S brevidens 和马 铃薯栽培种S tuberosum 进行化学融合和电融合 并对得到的19个杂种植株的mtDNA 进行了RFLP 分析 发现19 的RFLP 带型与亲本之一相同 其余的都表现出新的RFLP 带型 表明在体细胞杂种 中 mtDNA 重排的几率很高 这些结果表明体细胞杂种的线粒体基因组很可能发生了重组或重排 细胞质杂种的产生是由于亲本细胞器基因组中的质体或线粒体的交换或重组 程运江 2003 1 2 3 体细胞杂种线粒体遗传组分的研究方法 体细胞杂种胞质基因组的研究手段随着现代生物技术的发展而不断革新 上世纪中叶 人类利 用组织化学方法认识到细胞质基因组的存在 后来利用同位素示踪或生化标记 同工酶 方法对细 胞质基因表达产物进行研究 以推断胞质基因组结构特征 程运江 2003 随着分子生物学技术的发展 目前有许多方法可以用来检测体细胞杂种中的胞质来源 采用分 子标记分析体细胞杂种胞质遗传组分 分析结果有以下几种情况 第一 再生植株为双亲电泳谱带之 和 从一个带型图上即能看出胞质遗传组成特性 第二 再生植株在某些酶 引物 探针的带型图上具 有一个亲本的特异带 而在其它酶 引物 探针的带型图上具有另一个亲本的特异带 结合起来才能看 出杂种胞质遗传组成特性 第三 在一个酶 引物 探针的带型图上能看到融合双亲的特异带 但还出 现了新的带或发生了带的丢失 上述三种情况均可以认为再生植株为胞质融和类型 第四 胞质未 融合类型 即在酶 引物 探针的带型图上只能看到融合双亲某一方的特异带 而看不到另一方的特异 带 刘继红等 2004 早期对线粒体遗传组分的研究主要是RFLP 分析或内切酶 线粒体探针组合 然而这两种方法均 要求分离和纯化线粒体DNA 需要材料量大 操作烦琐 使其应用受到限制 蔡兴奎 2002 目前 基于PCR 的CAPS 技术已得到越来越广泛的运用 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequences 酶切扩增多态性序列 又称为PCR RFLP 标记 是特异引物PCR 与限制性内切酶相结合 而产生的一种DNA 标记 当特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时 可用限制性内切酶对扩增产 物进行酶切 然后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离以显示多态性 CAPS 标记的理论基础是由于植物胞质基因某些编码区域高度保守 非编码区存在丰富的变异 程运江等 2002 于是开发了特异的PCR 引物 将PCR 技术运用于植物细胞质基因组的研究 另外 部分叶绿体和线粒体PCR 引物跨物种使用成功 从而发展成为通用引物 universal primer 该引物的开发为其它胞质基因组序列未知的作物开展胞质遗传分析提供了新方法 CAPS 技术与RFLP 技术相比具有诸多优点 易操作 低成本 直接用总DNA 进行扩增 无须 分离细胞器DNA 样品用量少 特别适合于对杂种植株进行早期遗传分析 华中农业大学学士学位论文 设计 文献综述 5 1 3 本研究的目的和内容 本实验室选用具有青枯病抗性的野生种 S chacoense 和栽培种 中薯二号 的无性系 3 8 作 为融合亲本 进行体细胞杂交 获得了 116 个体细胞杂种系 经过青枯病抗性鉴定 筛选出不同抗 性水平的体细胞杂种株系群 在此基础上 采用 CAPS 技术分析杂种株系的线粒体遗传组成 比较 分析马铃薯青枯病抗性与其线粒体基因组之间的关系 本实验旨在建立有效的马铃薯线粒体基因组 遗传组分分析方法 研究结果将为明确马铃薯青枯病抗性的遗传规律及青枯病抗性与其线粒体基因 组之间的关系奠定良好基础 主要研究内容如下 a 筛选能区分两融合亲本线粒体基因组的特异的 CAPS 引物 b 将筛选出的特异引物应用于再生体细胞杂种的线粒体遗传组分分析 c 对 CAPS 引物扩增结果的可靠性进行验证 2 材料与方法 2 1 实验材料 以马铃薯栽培种 中薯二号 的无性系 3 8 与野生种 S chacoense 叶肉原生质体融合再生 的体细胞杂种株系为材料 由华中农业大学马铃薯课题组提供 无性系 3 和 S chacoense 融合再生 杂种株系 3C1 1 3C1 2 3C1 5 3C2 1 3C2 3 3C39 1 共 53 份 无性系 8 和 S chacoense 融合再生杂种株系 8C1 1 8C2 2 8C5 1 8C6 1 8C75 1 共 63 份 具体材料见表 3 本 实验使用的菌株为大肠杆菌 Escherichia coli DH 5 菌株 质粒为 pUCm T 载体 质粒购于上海 生物工程技术服务有限公司 2 2 实验方法 2 2 1 植物材料的繁殖 体细胞杂种及其亲本材料均采用单茎段繁殖 培养基为MS基本培养基附加4 蔗糖和0 8 琼脂 pH 5 8 培养条件为温度20 1 光照16 h d 光强3000 4000 lx 相对湿度60 左右 2 2 2 马铃薯基因组 DNA 小量抽提法 1 取10 50 mg试管苗植株或者叶片组织 放入1 5 mL离心管中 用钝头玻璃棒研磨至匀浆状 2 加入600 L DNA抽提缓冲液 Tris HCl 100 mmol L pH 8 0 NaCl 500 mmol L EDTA 50 mmol L 0 7 L mL 巯基乙醇 上下颠倒混匀 静置40 min 3 于13 000 r min室温离心10 min 将上清液转至另一离心管中 加入5 L RNase 10 mg mL 37 水浴1 h 4 分别用等体积苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 和氯仿 异戊醇 24 1 抽提一次 5 于13 000 r min室温条件下离心10 min 将上清液转至另一离心管中 加入等体积异丙醇 1 10 体 积的3 mol L NaAc 20 沉淀过液 使DNA 沉淀充分 6 13 000 r min 4 离心15 min 用70 乙醇浸泡20 min 倒出乙醇 晾干DNA 加入50 L 无菌 水溶解DNA 2 2 3 线粒体通用引物 线粒体通用引物对的序列 来源及扩增片段长度见表1 由上海生工生物工程公司合成 表1 线粒体通用引物的序列 扩增片段大小和文献来源 Table 1 mtDNA universal primer sequences size of amplified fragments and references 引 物 名称 扩 增 区 域 引 物 序 列 目标片段 大 小 退火温 度Tm 文 献 来 源 华中农业大学学士学位论文 设计 文献综述 6 Primers Region Primer Sequences 5 3 Expected Size bp References GCATTACGATCTGCAGCTCA Primer1 nad1exonB nad1exonC GGAGCTCGATTAGTTTCTGC 1184 55 Demesure et al 1995 CAGTGGGTTGGTCTGGTATG Primer2 nad4 exon1 nad4 exon2 TCATATGGGCTACTGAGGAG 2100 55 Demesure et al 1995 TGTTTCCCGAAGCGACACTT Primer3 nad4 exon2 nad4 exon3 AACCAGTCCATGACTTAACA 2840 55 Demesure et al 1995 CACGGGTCGCCCTCGTTCCG Primer4 nad4 exon2 nad4 exon4 GTGTGGAGGATATAGGTTGT 1640 57 5 Demesure et al 1995 GTGTTGCTGAGACATGCGCC Primer5 18SrRNA 5SrRNA ATATGGCGCAAGACGATTCC 1177 55 Al Janabi et al 1994 TTTTTTCGGACGTTTTCTAG Primer6 nad5 1 nad5 2r TTGGCCAAGTATCCTACAA 2258 55 Dumolin Lapegue et al 1997 ACCTCAACATCCTGCTGCTC Primer7 nad7 1 nad7 2r CGATCAGAATAAGGTAAAGC 1064 55 Dumolin Lapegue et al 1997 2 2 4 PCR 反应体系与程序 PCR仪为Whatman公司生产的Biometra Uno 型扩增仪 PCR扩增反应体系 20uL 含200 mol L dNTP 1 5 mmol L MgCl2 0 5 mol L 引物 1 0 U Taq 聚合酶 20 ng基因组总DNA PCR扩增反 应程序 94 5 min 94 1 min 55或60 1 min 72 90s 36个循环 72 10 m in 扩增产物用 1 0 琼脂糖凝胶 含0 5 g ml 溴化乙锭 电泳 经凝胶成像系统检测 2 2 5 亲本扩增片段的回收 参照 UNIQ 10 柱式通用 DNA 纯化试剂盒说明操作进行 略作改动 试剂盒购于上海生工 在 紫外灯下 用洁净的刀片将两亲本在琼脂糖凝胶上的扩增片段小心切下 放入 1 5 mL 离心管中备用 1 在每离心管中加入 400 L Binding Buffer 置于 50 60 水浴 10 min 使凝胶彻底融化 加热时 每 2 min 混匀一次 2 将融化的胶溶液转移到套放于 2 mL 收集管的 UNIQ 10 柱中 室温放置 2 min 使 DNA 与 UNIQ 10 柱膜结合 8 000 r min 室温离心 1 min 适当降低离心转速有利于提高 DNA 结合率 3 取下 UNIQ 10 柱 倒掉收集管中废液 再加入 500 L Wash Solution 10 000 r min 室温 30 秒 4 重复以上第三步骤一次 5 取下 UNIQ 10 柱 倒掉收集管中废液 将 UNIQ 10 柱放回 10 000 r min 室温 15 s 6 将 UNIQ 10 柱放入另一干净 1 5 mL 离心管中 在柱膜中心加 30 L Elution Buffer 室温下放置 2 min 55 60 水溶洗膜 90 s 7 10 000 r min 室温离心 1 min 离心管中的液体即为回收的 DNA 片断 可立即使用或保存于 20 备用 2 2 6 差异片段的 A T 克隆转化测序 按照 pUCm T 载体试剂盒说明略加改动 pUCm T 载体根据高温 DNA 聚合酶扩增的 PCR 产 物在 3 末端后带有一个突出的碱基 A 这样的 PCR 产物可以用 3 末端后带有一个突出碱基 T 的载 体方便地进行克隆 华中农业大学学士学位论文 设计 文献综述 7 2 2 6 1 连接反应 a 在一个标准的 10 L 连接反应体系中 加入表 2 中的各成分 表 2 连接反应体系 Table 2 Reaction system of ligation 反应成分 Reaction ingredient 体积 volume L 10 ligation buffer 1 0 pUCm T vector 1 5 PCR amplified products 3 0 ddH2O 3 5 T4 DNA ligase 1 0 Final volume 10 0 b 20 连接过夜 2 2 6 2 转化 a 200 L 感受态细胞 置于冰上 完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮 b 加入 10 L 连接液 轻轻混匀 冰上放置 30 min c 42 水浴热激 90 s 然后冰上放置 2 min d 加 400 L LB 培养基 37 250 r min 振荡培养 1 h e 室温下 4 000 rpm 离心 5 min 用枪头吸掉 400 L 上清液 用剩余的培养基将细胞悬浮 f 将细菌涂布在预先用 5 L IPTG 100 mM 和 40 L X gal 20 mg mL 涂布的氨苄青霉素 50 mg L 平板上 g 平板在 37 下正向放置 1 h 以吸收过多的液体 然后倒置培养过夜 16 24 h 2 2 6 3 转化子的筛选与测序 选择在 IPTG X gal 平板上生长的白色菌落 用牙签或无菌枪头挑至附加 50 mg L 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中 37 培养过夜 抽提质粒 DNA 用 PCR 扩增鉴定是否含有目的片段 选择阳性 克隆进行测序 3 结果与分析 3 1 线粒体通用引物筛选 以两个融合亲本即栽培种 中薯二号 无性系与野生种 S chacoense 的总 DNA 为模板 筛选本 实验中所合成的 7 对线粒体通用引物 扩增结果如图 1 所示 在筛选的 7 对线粒体通用引物中 只 有 Primer3 的扩增片段大小 1300 bp 与预计扩增片段 2840 bp 相差较大 其余 6 对引物扩增片段与预 计扩增片段大小相符 而 Primer4 和 Primer6 除了扩增出预计大小的片段外 还扩增出两条较小的条 带 幸运的是 Primer3 和 Primer4 通用引物直接扩增结果就显示了栽培种亲本特征带型 经重复试验 证明两引物扩增结果可靠 具有很好的重复性和稳定性 其他 5 对通用引物 Primer1 Primer2 Primer5 Primer6 Primer7 虽然扩增带型在两亲本内没有差异 有可能通过合适的内切酶酶切能够 显示出亲本差异 bp Primer3 8 cha Primer4 8 cha Primer5 8 cha Marker Primer7 8 cha Pr