植物组织培养试验要点小结.doc

植物组织培养试验要点小结 导读：62 2018, Vol.38, No.02农业与技术 农业科学植物组织培养试验要点小结陈洪燕 沈鸿云 胡双珍（乐昌市农业科学研究所，广东 乐昌 512200）摘 要：在无菌和人工控制的环境条件下 , 利用适当的培植物组织培养试验要点小结62 2018, Vol.38, No.02农业与技术 农业科学植物组织培养试验要点小结陈洪燕 沈鸿云 胡双珍（乐昌市农业科学研究所，广东 乐昌 512200）摘 要：在无菌和人工控制的环境条件下 , 利用适当的培养基 , 对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养 , 使 其再生细胞或完整植株。关键词：植物组织培养；灭菌；接瓶；组培苗；移栽中图分类号：Q943.1文献标识码：ADOI：10.11974/nyyjs.20180133052乐昌每年种植香芋 1334 万 m2，马蹄 933.8 万 m2，是 农民种植的主要经济作物之一，香芋和马蹄都是通过留种 无性繁殖，种性退化问题较为突出，抗病性和抗逆性减退， 利用组织培养的方法解决品种退化问题，在许多园艺作物 上都得到了成功应用，因此乐昌市农业科学研究所从今年 3 月开始研究植物组织培养技术，为日后组培香芋、马蹄 苗做准备。现就本所组培试验要点小结如下。1 外围准备碟子和所有器械清洗完毕后将水擦干，用报纸捆包 好，再放灭菌锅内灭菌。需灭菌的器械有：镊子、剪刀、 解剖刀，碟子（8 个包一包），玻璃杯 2 个和纱布（纱布 用手撕成小块，不能用剪刀剪，否则用于擦试工作台等 容易留下剪刀口布屑）。培养基可不经过煮制，将所有物质称量好，琼脂粉 等需要溶解的物质溶解，之后混合定容调 pH 值，再倒入 灌装机分装，分装时需不停的搅拌培养基，灌装时勿将 培养基滴洒在瓶口，否则需用抹布擦干净或换玻璃瓶。灭菌锅在消毒前先预热，将夹层压力上升，减少煮 制时间，煮完后手动慢慢放气（使湿热蒸汽趁热散去而 不打湿防潮物）让压力下降，10min 左右让室内压力降至 0（避免闷锅时间长导致培养基不凝固），后取出后趁热 迅速拧紧瓶盖，待冷却后移至缓冲室平放，使培养基平 铺在瓶底凝固。外植体取材：取当年生萌动状态的饱满嫩枝芽作为 外植体，先用 5% 洗衣粉浸泡 5min，用刷子轻轻刷，用 流水冲洗，时间视材料清洁程度而定，蒸馏水冲洗 35 次， 可去除较多泥尘和微生物，最理想的清洗物质是表面活 性物质 吐温，之后将外植体切割成适当大小，灭菌容 器能放入为宜，移至酒精擦试好的带盖无菌瓶子内，放 入无菌操作台备用。2 内围接瓶将所有需要摆上无菌操作台的东西用酒精擦试表面 后摆好，需用酒精擦试的物品（包括：工作台面，台周 围玻璃和母瓶，新培养基瓶，酒精灯，搁置架，打火机等）， 母瓶和新培养基放左上方，酒精灯放左下方，身体正前 方放碟子，右上方靠左放器械搁置架，右上方靠右放接 种器械灭菌器，左下方放打火机和半瓶 70% 酒精，后开 紫外灯 20min，再通风 20min 后开始操作。工作人员进入无菌接种室前，应先将手表、手镯、 戒子等放室外，将手和手腕用肥皂清洗干净后，用酒精 纱布擦拭双手、双腕，之后换工作服，包括更换拖鞋， 穿白大褂，接种人员还要扎好头发，戴好帽子和口罩，指甲需剪短，将手和手臂用酒精擦试后戴手套操作，在 组培室内不得高声喧哗、打闹，接种时不得随意谈话、 说笑，以免造成污染，台外人员走动要轻，动作要小。打开无菌操作台玻璃门之前先用酒精雾喷，使悬浮 在无菌操作台周围的灰尘颗粒沉降，操作时将搁置架在 酒精火焰上方灼烧一下，打开包装好的碟子（注意手一 定不能接触碟子边沿），镊子、解剖刀从报纸取出后， 先用酒精擦试一下，再放在酒精灯火焰上灼烤 1 遍（工 具的每 1 点在火焰上灼烤时间不得少于 5s），之后开始 接（转）苗。外植体的消毒用酒精和次氯酸钠（钙）， 最优消毒为：既有污染的，也有消毒好没被污染的，也 有褐化的。取苗：瓶子在打开之前瓶口都需在火焰上灼烧 710s， 正式取苗时，瓶口不要斜向外或直立向上，以免空气中 微生物落入瓶中。转苗时一次取苗不可太多，以免风干。 切苗：碟子放在离风窗 1020cm 处，镊子和手术刀不可 太热，在操作过程中，手要在碟子斜上方操作，不可在 其正上方操作，更不能交叉过碟子上方操作，切苗过程 中产生的垃圾堆放在碟子一侧。注意操作操作人员的头、 胳膊等不得进入台内。接苗：将未接瓶的培养基瓶口在 酒精灯火焰上灼烤 710s，烤完瓶口后再接苗，接苗时， 镊子不要与瓶口接触，一瓶内一般接 56 棵苗，动作迅速， 组培苗在瓶内排放均匀整齐，美观。封口、记录，接好后用酒精火焰灼烧瓶口封口，后 迅速盖好瓶盖扭紧。碟子 1 瓶母瓶用 1 个，用完之后用 镊子挑起拿开，接好的瓶苗随手放到无菌操作台外面推 车上，工作过程中所产生的垃圾及时清理，防止交叉污染。 下台前把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日 期标示到瓶上。接好后将工作台擦试干净，把接种过程 中产生的垃圾清理掉，台上的物品摆放整齐，用消毒粉 兑水拖接种室和培养室地面，后开紫外灯照射。工作人 员进出组培室随手关门。培养室需密闭，避免虫子进入， 室温控制在 25左右，保证植物培养最适温度。3 灭菌一经发现就随即灭菌处理，大量的进行高压锅灭菌， 少量的加入工业酒精在室外进行处理。室内空气灭菌： 每四周用高猛酸钾和甲醛（或臭