11分子荧光和磷光.ppt.Convertor.doc

第十二章 分子发光分析12-1 分子发光分析概述激发态分子以辐射跃迁形式释放能量产生分子发光一、分子发光类型 光致发光，如分子的荧光和磷光 激发模式 化学发光 荧光激发态类型 磷光二、分子发光分析法特点灵敏度高。选择性比高。试样量小，操作简便，工作曲线线性范围宽。在光学分子传感器以及生物医学、药学和环境科学等方面有其优越性。12-2 荧光与磷光基本原理一、荧光和磷光的产生电子激发态分子：物质分子吸收入射光子的能量后，价电子从较低能级跃迁到较高能级，这时分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；激发态基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；电子激发态的多重性电子激发态的多重性：M = 2S + 1 ，S 为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态； 激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9s，第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s； 第一激发三重态的最低振动能级基态；无辐射跃迁振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。 系间窜跃： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。 辐射跃迁:荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。多为 S1 S0跃迁寿命为10-7 10 -9s，由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106109s-1。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。 T1 S0 跃迁磷光寿命为10-4 10s，由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；二、 激发光谱和发射光谱2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l 2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光效率分子产生荧光必须具备的条件（1）具有能吸收一定频率紫外光的特定结构；（2）具有一定的荧光量子产率（荧光效率）。 荧光量子产率（j）表示物质发射荧光的本领：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，则不出现荧光发射；因此，只有那些具有共轭双键，尤其是具有刚性、平面和多环结构的分子有利于发光。分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光也愈强。能强烈发光的分子几乎都是通过吸收*跃迁而到达电子激发态的。四、荧光与分子的结构关系具有强荧光性的物质，一般具有以下特征：（1）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移.（2）刚性平面结构：具有刚性平面结构的分子，可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，有利于荧光的发射。荧光素有很强荧光，但酚酞无，是由于荧光素的刚性可减少分子振动，这就减少了体系间跨越跃迁到三重态和碰撞去活化的可能性。（3）取代基效应： 给电子取代基增强荧光（p-p共轭），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等； 吸电子基降低荧光，如 COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等； 重原子降低荧光但增强磷光五、影响荧光强度的环境因素1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；溶剂极性增强使物质的荧光波长红移，荧光强度大。2. 介质酸碱性的影响 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变，需严格控制溶液pH3. 介质 温度和黏度的影响 温度增加，荧光强度下降（因为使激发态分子的振动弛豫和内转化作用增加), 因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。介质黏度增加也有利于提高荧光或磷光的强度。4. 有序介质的影响 表面活性剂可在荧光物质周围形成胶束，提高荧光效率。 六、荧光的猝灭发光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用，引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。猝灭剂：与发光分子相互作用而使发光强度下降的物质动态猝灭：猝灭剂和发光物质的激发态分子之间发生的相互作用而使发光强度下降静态猝灭：猝灭剂和发光物质的基发态分子之间发生的相互作用而使发光强度下降 七、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光强度Ia与荧光量子产率j If = j Ia据Beer定律： Ia = I0 - It = I0(1- e -e l C)代入上式得： If = j I0(1- 10 -e l c) = j I0(1- e -2.3e l c)整理得： If =2.3 j I0 elc在一定条件下： If = K c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比（但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当elc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系）12-3 荧光和磷光分析仪器日立 F2500型分子荧光仪一、荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、试样池、单色器、检测系统。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。光源：高压氙灯汞灯、及固态光源、激光光源。单色器：荧光计：滤光片；荧光分光光度计：光栅试样池：长、宽各为1cm的柱型石英池。检测器：由光电管和光电倍增管作检测器。二、磷光分析仪器荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。12-4、荧光的常规测定方法直接测定：分析物本身发荧光，可通过测量其荧光强度而测定浓度。间接测定：分析物本身不发荧光，或因荧光量子产率太低而无法直接进行测定。可采用荧光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法。多组分混合物的荧光分析 荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析 见下表 二、 磷光的测定方法 1、低温磷光分析 由于激发三重态的寿命长，激发态分子与周围的溶剂分子间发生碰撞和能量转移过程的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失，通常在低温下测量磷光。 低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却剂。溶剂在液氮温度（77K）下应具有足够的粘度，对所分析的试样应具有良好的溶解特性。最常用的溶剂是EPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2：5：5混合而成。2、室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。（1）固体基质室温磷光法（SS-RTP）（2）胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTP）（3）敏化室温磷光分析（S-RTP)磷光分析法的应用 1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见下页表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 mg/cm-3 3.药物分析和临床分析 见下页表12-5 化学发光分析一、概述 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。 二、基本原理在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + hn（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 DE=170300 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。三、化学发光的类型（1）气相化学发光反应主要有O3，NO和S的化学发光反应，可用于检测空气中的O3，NO ，NO2，H2S，SO2和CO等气体。在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；一氧化氮和二氧化氮 在富氢火焰中NO + H HNO* HNO * HNO + hn 发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：690nm； 在富氢火焰中： NO2 2H NO H2O 该反应十分迅速；（2）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、V4+、 Mn2+、Co2+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3） 间接测定某些生物试样氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶四、 化学发光的测量仪器装置流程：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；五