脂蛋白亚组份分析及其用于动脉粥样硬化的研究.doc

计划类别：社会发展指令计划行业代码：生命健康专项科技计划项目申报书社会发展项目名称：脂蛋白亚组份分析及其用于动脉粥样硬化的研究承担单位：南通大学附属医院单位地址：南通市西寺路20号单位性质：事业单位组织机构代码： 46600264-9项目联系人：王惠民电话： 85052102主管部门： 南通市科技局邮编： 226001申报日期： 2009 年 3 月 26 日南 通 市 科 学 技 术 局二九年三月制编写说明： 1、本设计书适用于南通市社会发展科技计划。 2、主管部门一般是县（市）、区科技主管部门（项目科技经费配套单位），市区主管局科技管理部门，市直和驻通单位科技管理部门。3、各单位请认真研究本年度南通市科技计划项目申报指南和要求，针对项目特点选报适合的计划类别，编写好“科技计划项目申报书”、“科技项目综合信息表”与附件材料一起装订成册（A4幅面）一份，签字盖章，连同项目申报电子文档，报送主管部门，同时网上填报无误后提交。4、本申报书附件（电子文件）：单位上一年度财务报表电子文件；组织机构代码证书电子文件、经济普查报表电子文件、特殊行业（生产）许可证电子文件、专利证书电子文件、环评证书电子文件、科技成果鉴定证书电子文件、安全生产许可证电子文件、合作协议书电子文件、工程中心批件电子文件等。5、随本申报书同时报送的附件材料：单位上一年度财务报表复印件；组织机构代码证书复印件、经济普查报表复印件、特殊行业（生产）许可证复印件、专利证书复印件、环评证书复印件、科技成果鉴定证书复印件、安全生产许可证复印件、合作协议书复印件、工程中心批件复印件等。项目申报书编写提纲一、 立项依据近年来我国动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）呈明显上升趋势，尤其是冠心病（coronary heart disease，CHD）死亡率每年已超过百万，其中3050岁男性CHD患病率和死亡率增加最迅速。因此，预防和治疗CHD已成为我们必需解决的一个严重而艰巨的课题。AS所致的各种疾病均为血管病变所导致。传统上动脉血管病变的评价主要通过创伤性检查方法：动脉造影，它只能显示血管腔轮廓长轴影像，无法了解血管壁的结构和粥样斑块的特征；血管内超声（IVUS）能早期发现血管壁结构变化，这两种方法都具创伤性，很难作为常规筛查措施。虽然有一些无创伤的检测方法如回波跟踪技术、脉搏波传导速度评价等。但这些都需要特殊设备和高水平技术支持、高昂费用等，难以普及开展。因此如何在血管发生病变早期就能检测，继而施行干预，阻止其进一步病变，一直是困扰临床的重大难题。目前研究比较明确的结论是血液内脂类代谢紊乱是血管病变的始动因素和主要参与者，血清脂蛋白分析对于动脉粥样硬化的危险评估和防治具有重要意义。血液中主要有两种脂蛋白参与血管病变， 低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）为致动脉粥样硬化因子，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）为抗动脉粥样硬化因子。2004年美国胆固醇教育计划（National Cholesterol Education Program，NCEP）成人教育组第三次指南（Adult Treatment Panel III，ATP III）修订报告将降低LDL-C水平作为CHD防治方案中的重点治疗目标，因此LDL-C是评价AS的最重要的无创伤指标。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明仅仅测定LDL-C并不能完全估计LDL致AS危险，通过对LDL亚组份的研究发现LDL是一种颗粒大小与组成不均一的脂蛋白，主要分为小而密LDL（small，dense low-density lipoproteins，sdLDL）和大而轻LDL（large，buoyant LDL，lbLDL）。体内外实验都证明sdLDL比lbLDL有更强的致AS作用，以冠状动脉造影观察AS斑块进展或退缩时，发现AS病变进展的主要因素是sdLDL。在sdLDL增高患者急性心肌梗塞发病率是对照组的35倍，目前已将sdLDL增多、三酰甘油增高与HDL-C降低三者同时存在称为“血脂异常三联症”，作为AS的高度危险因素。目前测定sdLDL的方法主要有：密度梯度超速离心、梯度凝胶电泳、质子核磁共振光谱等，由于这些方法十分繁杂，前二者需24小时以上，后者需十分昂贵的仪器。因此这些方法尚处于实验室研究阶段，并未在临床推广使用。芯片毛细管电泳（chip-based capillary electrophoresis）是20世纪90年代发展起来的集色谱与电泳技术优势与一体的一种新型分析技术，具有快速、微量、分辨率高、重复性好等优点，近年来已成为分析化学与生命科学领域的研究热点。本课题组从2003年起已连续在3个“国家863课题”的资助下，完成了芯片毛细管电泳用于尿蛋白和同工酶的分离，在2005年省社会发展项目的资助下完成了HDL与LDL的芯片电泳分离。近二年来我们已初步通过芯片电泳将血清脂蛋白成功分离为VLDL、HDL、lbLDL与sdLDL，目前尚未见国内外有类似的报道。如何使测定方法进一步优化，提高检测的稳定性和重复性，常规用于临床诊断和疗效判断，是目前迫切需要解决的问题。据了解美国Agilent公司与日本有关公司正在加快这方面的研究。早日研制出可用于sdLDL常规分离方法，不但有着明显的社会经济效益，而且可使我国在AS的生化检测方面处于国际先进水平。主要参考文献1. Dyslipidaemia and lipoprotein pattern in systemic lupus erythematosus(SLE) and SLE-related cardiovascular disease, Hua X,Su J,Svenungsson E,Hurt-Camejo E,Jensen-Urstad K,Angelin B,Bavenholm P,Frostegard J., Scand J Rheumatol.2009 Jan;22:1-6.Epub ahead of print.2. Combined effects of small apolipoprotein (a) isoforms and small,dense LDL on coronary artery disease risk, Zelikovic A,Bogavac-Stanojevic N,Jelic-lvanovic Z,Spasojevic-Kalimanovska V,Vekic J,Spasic S.,Arch Med Res.2009 Jan;40(1):29-35.3. Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults: executive summary of the third report of the national cholesterol education program (NCEP) Expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult treatment panel )C. JAMA, 2001;285:24862497.4. Navab M, Anantharamaiah GM, Reddy ST, et al. Mechanisms of disesse: proatherogenic HDL-an evolving field J. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2006;2(9):504511.5. Anatol Kontush , Patrice Therond , Amal Zerrad , et al. Preferential sphingosine-1-phosphate enrichment and sphingomyelin depletion are key features of small dense HDL3 particles : Relevance to antiapoptotic and antioxidative activities J. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27:1 8431849.二、 研究开发内容和主要任务 1、项目重点研究开发内容和主要工作任务；1.1低成本微流控芯片的工程化研制1.1.1 石英微流控芯片制造石英玻璃由于其具有优良的光学性能和微加工性能，以及其表面特性也比较清楚，但成本相对较高，为了降低成本，适合一次性使用，尽量使芯片制备规模化、标准化，批量制造，以降低成本。1.1.2 聚合物微流控芯片的工程化制造为进一步降低微流控芯片的制造成本，可选用SU-8和PDMS聚合物做基片材料，采用聚合物微加工技术进行制造，同时开发与之相配套的分析试剂并优化分析条件，芯片和分析试剂盒一起作为消耗品提供给用户配合仪器使用，进一步扩大芯片的使用范围。1.2血清脂蛋白sdLDL分离分析方法的研究1.2.1 适合于脂蛋白sdLDL检测的微通道内壁的处理方法采用表面自组装技术对微通道及微储液池内壁进行修饰处理，尽量减少或消除内壁对蛋白质的吸附作用，降低对检测结果的影响。1.2.2 适合于临床脂蛋白sdLDL样本分型的电泳缓冲体系及优化在前期研究的基础上，对缓冲液体系（TBE、TAE、PBS、巴比妥等）进行优化选择，主要考虑缓冲体系的电介质浓度、pH值、添加剂（如乙二胺、SDS）等对电泳结果的影响；在此基础上优化得出能够满足临床血清脂蛋白sdLDL有效分离的电泳缓冲体系。1.2.3 适合于血清脂蛋白sdLDL检测的微流控芯片电泳方法根据设计的微流控芯片参数（管道长度、尺寸及进样口形状等）和分析仪性能，拟采用门进样和夹流进样两种方式实现样品进样过程，电泳参数（进样/分离电泳和时间）均通过控制程序完成。同时研究微流体的控制调节，包括流速、体积、温度、溶液混合，探索生物大分子在微系统中的特殊运动规律等。1.3临床应用研究1.3.1 健康人群sdLDL研究：对健康人群脂蛋白sdLDL进行分析研究，初步建立本地区该指标的参考区间；1.3.2 风险人群评估：主要针对吸烟、肥胖等人群进行临床跟踪研究，对此类人群进行冠心病及动脉粥样硬化的风险评估；1.3.3 动脉粥样硬化相关疾病研究：主要研究冠心病、糖尿病合并冠心病、糖尿病、糖尿病肾病等相关患者sdLDL水平，明确其临床应用价值。 2、必须解决的关键技术和可能面临的技术困难；2.1聚合物微流控芯片用于临床血清脂蛋白sdLDL检测技术有文献报道采用聚合物微流控芯片用于脂蛋白标准品的分析，但由于血清脂蛋白成分的复杂性，目前尚未见聚合物微流控芯片用于临床血清脂蛋白特别是sdLDL分析的报道。为了降低成本，宜选用聚合物做基片材料，并应用于血清脂蛋白sdLDL检测，因此该项技术是本课题拟解决的关键所在。对芯片制作的每一个参数和流程进行标准化控制，使得芯片具有良好的一致性，同时批量化降低成本，满足一次性使用要求，研究对聚合物芯片管道内壁进行修饰，选择合适的缓冲体系和电泳条件，实现血脂蛋白sdLDL的有效分离检测。2.2血清脂蛋白sdLDL芯片电泳分析的稳定性和重复性问题针对血清脂蛋白sdLDL特定荧光检测和分析的要求，进行分析仪的集成化和便携式设计和制造，自主开发数据分析软件，实现电泳谱图的显示、组分相对含量的计算等功能，实现临床样品检验的简单化和智能化。通过对微流控芯片、电泳系统的最佳化和稳定性研究，使该系统的检测结果具有良好的重复性和稳定性，满足大范围推广的临床要求。正是由于血清脂蛋白成分的复杂性，在分析过程中的影响因素很多，而又必须满足临床对检测结果能够重现的要求，因此血清脂蛋白sdLDL芯片电泳分析的稳定性和重复性问题也是本课题拟解决的关键技术。可通过标准品的研究优化各种影响因数以及严格规范操作过程，实现这一目的。 3、项目主要的技术创新之处（包括：委托开发内容）；通过本项目的研究可获得创新性成果在于：具有自主知识产权的微流控芯片、血清脂蛋白亚型分析试剂盒和分析仪。3.1基于芯片技术的血清脂蛋白亚型检测方法3.2适合于血清脂蛋白亚型检测的高pH值无胶筛分体系3.3基于片电泳技术分离检测血清亚型用于动脉粥样硬化性相关疾病的分析。4、项目设计总目标和主要技术、经济指标。建立及优化脂蛋白组份（sdLDL）检测方法（有良好的重复性，变异系数CV10%）；研究脂蛋白亚型与冠心病风险程度的相关性，以达到冠心病风险预测的目的。完成论文34篇，其中SCI收录论文12篇。三、 实施计划进度和阶段考核目标计划实施年限2009年7月2011年6月第一阶段 2009年7月2009年12月1. 微流控芯片的标准化制作；2. 详细制定研究对象的资料收集方案；3. 芯片电泳分离脂蛋白亚型方法学摸索；4. 开始收集正常健康成人、AS等相关疾病患者的样品及有关资料。第二阶段 2010年1月2010年12月1. 微流控芯片电泳分离脂蛋白亚型方法学优化；2. 继续收集正常健康成人、AS等相关疾病患者的样品及有关资料；3. 完成所收集标本的测试及数据分析。第三阶段 2011年1月2011年6月1. 完成论文；2. 课题结题。四、 研究试验方法、技术（工艺）路线及工作方案采取的研究方案流程见图1。图1研究方案流程图五、 现有研究开发基础和承担单位所具备的优势条件 1、技术研究开发背景和现有技术基础；芯片电泳集色谱与毛细管电泳技术与优势于一体，具有成本低、高度集成化、快速高效等众多的优点，是目前分析界研究的热点，在临床医学特别是医学检验中的应用越来越广泛，在小分子如DNA、药物等方面的应用较为常见，是国际上研究的热点，也是国家科技部重点资助的方向。目前本课题组已在芯片电泳用于尿蛋白、酶、HDL与LDL的分离方面完成了3项国家“863”课题（2002AA404310、2003AA404200、2004AA404250），1项省社会发展项目，发表相关论文20多篇，在芯片电泳用于临床检验方面积累了丰富的经验。由于目前冠心病的发病率及易患人群都在不断上升，而冠心病的危险因子sdLDL目前没有很好的检测方法，因此我们针对这种情况进行了一系列的预实验，方法学已初步构建完成，并对部分健康人群进行了检测，效果较为理想，如图2和图3。 图2 冠心病人血清脂蛋白电泳检测图sdLDL-C浓度（mmol/L）0.390.14mmol/L频率图2 预实验结果图谱图3 正常人群sdLDL-C浓度分布分布目前已完成的论文1. 王惠民，丛辉，孙承龙，等.微流控芯片电泳快速检测脂蛋白方法的建立J.化学学报，2006，64:705-708.2. 汪骅，王惠民，金庆辉，等.微流控芯片电泳分离血清中小而密低密度脂蛋白的研究J.分析化学，2008，11：1531-1534.3. Hua Wang，Hui-Min Wang，Qing-Hui Jin，et al.Microchip-based small, dense low density lipoproteins assay for coronary heart disease risk assessmentJ. Electrophoresis，2008，29：1932-1941.4. 丛辉，王惠民，刘杰.小而密低密度脂蛋白与动脉粥样硬化性相关疾病J.中华老年医学杂志（2009年4月份出版）. 已经申请或已被批准的相关专利1. 微流控芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法，中华人民共和国国家知识产权局，申请号：200710019778.7，申请时间：2007年2月.2. 脂蛋白微流控芯片电泳检测方法，专利号：ZL 2005 1 0040296.0，公布日期：2007年12月26日.已具备的仪器设备目前本课题研究已具有微流控电泳仪器、Hitachi7600-020全自动生化分析仪器、Backman-Coulter毛细管电泳仪等仪器设备，能保证本课题的顺利进行。2、项目负责人情况和承担单位所具备优势条件（包括协作单位情况）；申请者：王惠民，男，1955年出生，1987年毕业于镇江医学院检验系，主任技师、硕士研究生导师、南通大学附属医院检验医学中心主任。江苏省卫生厅科教兴卫医学重点学科“实验诊断学”学科带头人。担任中华医学会检验分会委员、中华医院管理协会临床实验室管理委员会委员、江苏省医学会检验分会副主任委员、江苏省中西医结合学会实验医学分会副主任委员、南通市医学会检验分会主任委员、临床检验杂志副主编，2001年8月被评为“南通市专业技术拔尖人才”，同年被省政府授予“江苏省有特殊贡献中青年专家”荣誉称号，发表论文论著二百余篇、部，其中SCI收录论文多篇，参加国际学术交流6次。自1998年以来获南通市科技进步一等奖3项、二等奖5项，江苏省科技进步三等奖2项，国家发明专利2项，申报国家发明专利多项。近8年来一直从事“微流控芯片在临床检验中的应用”方面的课题研究，主持参与相关国家“863”课题2项、省市级课题多项。发表的与本课题有关主要论文：1. 王惠民，孙承龙，王跃国，等.微流控芯片电泳在快速分离尿蛋白中的临床应用价值J.中华检验医学杂志，2004，9：551-554. 2. 丛辉，王惠民，王跃国，等.毛细管电泳法分离血清中乳酸脱氢酶同工酶J.中华检验医学杂志，2005，11：1143-1145.（通讯作者）3. 宋宏伟，王惠民，丛辉，等.石英芯片电泳分离检测尿中蛋白的研究J.分析测试学，2006，4：32-35.（通讯作者）4. 王惠民，丛辉，孙承龙，等.微流控芯片电泳快速检测脂蛋白方法的建立J.化学学报，2006，64:705 -708.5. 丛辉，王惠民，宋宏伟，等.控制微流控芯片电泳中的蛋白质吸附J.检验医学，2006，5：449-452.（通讯作者）6. Hua Wang，Hui-Min Wang，Qing-Hui Jin，et al.Microchip-based small, dense low density lipoproteins assay for coronary heart disease risk assessmentJ. Electrophoresis，2008，29：1932-1941.（通讯作者）7. 汪骅，王惠民，金庆辉，等.微流控芯片电泳分离血清中小而密低密度脂蛋白的研究J.分析化学，2008，11：15311534.（通讯作者）8. 丛辉，王惠民，鞠少卿，等.芯片毛细管电泳检测痕量酶活性的初步探讨J.生物化学与生物物理进展（已录用）.（通讯作者）9. 丛辉，王惠民，刘杰.小而密LDL与动脉粥样硬化性相关疾病J.中华老年医学杂志（已录用）.（通讯作者）申请专利：1. 微流