根霉曲的制备 杨从举 104120300.doc

本科学生综合性实验报告学号 104120300 姓名 杨从举 学院 生命科学学院 专业、班级10 应用生物教育B班 实验课程名称 发酵工程学实验 教师及职称 唐湘华 （实验师） 开课学期 2012 至 2013 学年 下 学期 云南师范大学教务处编印一、实验设计方案实验序号： 1、2 实验名称：根霉曲的制备及糖化能力的测定 实验时间：2013年3月20日、3月27日实验室：学院1231、实验目的: 掌握固体发酵的基本操作步骤；了解根霉曲制作工艺和基本原理；了解糖化酶的测定方法；对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算；了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。2、实验原理固体发酵的一般流程保藏菌种 原料 斜面活化 预处理 固体三角瓶培养 蒸料 固体浅盘培养 冷却 接种 培养通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系；通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖。淀粉是由葡萄糖通过-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万。淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。3、实验器材、材料1器材 天平、烧杯、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、培养箱水浴锅、离心机、722分光光度计、移液枪等。2材料麦麸、 根霉AS3.866、自来水柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉。4、实验步骤根霉曲的制备： （1）、培养基的配制与灭菌（约60%含水量）麦麸20g20ml水 /人 放入烧杯拌匀（以组为单位） 分装于三角瓶包上纱布（至少6层）包牛皮纸（一层）包 扎120灭菌1h 摇动打散瓶内培养基冷却至约30 （2）、接种（ AS3.866 ）液体接种，接种量5% 无菌操作进行接种摇匀在瓶壁上写上姓名、接种日期（3）、培养接种后的三角瓶倾斜平放 28培养24h 扣瓶 （本周四） 继续培养约2448h 出料（烘干、磨碎） 根霉曲酶液的制备：取1克根霉曲溶解到10毫升缓冲液中，混合搅拌10分钟，纱布过滤，取过滤液备用。绘制标准曲线的方法：先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。0.1%葡萄糖标准曲线的制作取7支试管，编号，按照下表进行操作：葡萄糖溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖含量（）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容总体积(ml)15151515151515OD（540nm）糖化酶酶活测定：取酶液按照下表要求操作测定酶活； 操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液步骤250保温5分钟50保温5分钟50保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫升加入待测酶液0.2毫升步骤450精确保温10min50精确保温10min50精确保温10min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色OD =（A+B）/ 2淀粉酶的液化效果试验:取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50预热5分钟，加入酶液1毫升，反应5分钟，取5毫升稀碘液检测淀粉显色情况。5、实验现象、结果0.1%葡萄糖标准曲线的制作原理：3， 5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。糖化酶酶活测定： 5人/大组 2人/小组 3人/小组 管号样品管A1样品管B1样品管A2样品管B2吸光度0.5580.5230.1240.167吸光度计算：OD =（A+B）/ 2 第一小组OD=（0.558+0.523）/ 2=0.5405 第二小组OD=（0.124+0.167）/ 2=0.1455 淀粉酶的液化效果试验 第一小组的两支试管加入碘液都呈无色。 糖化酶的酶活力：是指在PH=6.5，反应温度为50的条件下，每分钟降解0.1淀粉产生1葡萄糖所需的酶量。 糖化酶酶活力单位（IU）： = 9.485 注：5为测定OD值前的稀释倍数；分子中的10为根霉曲的稀释倍数；分母中的10为反应时间10min;0.2为所取的酶量；1为本实验所取得根霉曲的量。 二、实验总结1、注意事项培养基的配制过程中一定要摇匀、拌匀，避免部分地区结成团。在封口过程中一定要按照相关规范进行，避免包扎不严或厚度不够。充分保证灭菌的时长和效果，以免杂菌干扰。灭菌时一定要熟练高压蒸汽灭菌锅的操作，不得违规操作。准备接种时，一定要让培养基冷却至30以下才能接种，以免杀死菌种。使用超净工作台前进行2030分钟的紫外杀菌消毒，使用过程中严格遵守相关操作流程。接种完成后，一定要充分摇动打散瓶内培养基，之后才能放入培养箱中培养。28培养24h后要进行扣瓶，以使菌种更好的生长和繁殖。酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试