(课用)肝糖原的提取与.ppt

实验四肝糖原的提取与鉴定 刘曼TEL mail manna liu 实验报告问题 字如其人结果无分析照抄 糖原的结构特点 糖原是一种高分子化合物 分子量约为400万 微溶于水 无还原性 与碘作用生成红色 1 葡萄糖单元以 1 4 糖苷键形成长链 2 约10个葡萄糖单元处形成分枝 分枝处葡萄糖以 1 6 糖苷键连接 分支增加 溶解度增加 实验原理 肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一 储存量虽然不多 但在代谢过程中 它是维持血糖平衡及体内糖的重要来源之一 其合成或分解 对血糖浓度的调节起着重要的作用 肝脏 蛋白质 沉淀 糖原 上清 糖原沉淀 与碘液反应 斑氏试剂 三氯乙酸 95 乙醇 离心 HCl水解 加H2O溶解 肝糖原 棕红色 砖红色沉淀 实验试剂 实验试剂 实验器材 实验步骤一 肝糖原的提取 实验步骤二 肝糖原的鉴定 注意事项 取肝脏组织时 吸去其附着血液 因血液可能含还原性葡萄糖 会影响后面糖原的鉴定 研磨应充分 使细胞破裂 肝糖原释放出来 研磨不充分会得不到糖原或含量很少 影响后面的鉴定 研磨后匀浆转入离心管离心可用滴管转移 如果采用倒入 不能洒落管外 应尽量转移干净 离心时与另一组的离心管平衡 对称放入离心机 上清液加入95 乙醇后 注意混匀 防止分层 可用滴管吹吸混匀 或玻璃棒搅拌混匀 调节pH 必须调至中性 糖原会在浓盐酸在沸水浴下分解成小分子化合物 其中有还原性的麦芽糖和葡萄糖 还原性糖会在碱性条件下 班氏试剂与其在沸水浴下生成砖红色Co2O沉淀 班氏试剂为碱性溶液 所以须用20 NaOH溶液中和至中性 过酸 Cu2 会变得较为稳定 不容易发生反应 所以不能进行试验 如果溶液中还原糖含量较低 产生的氧化亚铜便会相应减少 因此试验后可能只会出现绿色 混浊的黄色或橙色沉淀物 班氏试剂中有CuSO4 NaCO3和柠檬酸钠 CO32 提供碱性环境 柠檬酸钠为络合物 帮助Cu2 与葡萄糖反应 沸水浴下 Cu2 变为Cu 即Cu2O Cu2O为砖红色沉淀 葡萄糖被氧化为糖酸 麦芽糖亦如此 糖原储存于细胞内 采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎 低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性 破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质 而糖原仍稳定地保存于上清液中 从而使糖原与蛋白质等其它成分分离开来 糖原不溶于乙醇而溶于热水 故先用95 乙醇将滤液中糖原沉淀 再溶于热水中 糖原水溶液呈乳样光泽 遇碘呈红棕色 这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色 糖原还可被酸水解为葡萄糖 利用呈色反应和葡萄糖的还原性 可判定肝组织中糖原的存在 CuSO4十2NaOH Na2SO4 Cu OH 2 2Cu OH 2十C6H12O6 2CuOH十氧化型葡萄糖 H2O2CuOH Cu2O 红色 H2OCu OH 2 CuO 黑色 H2O 提取糖原时 首先将新鲜的肝组织与石英砂及三氯乙酸共同研磨 这样当肝组织被充分破碎后 其中的蛋白质会被三氯乙酸所沉淀 而糖原仍留在溶液中 然后离心除去沉淀 滤液中的肝糖原可通过加入乙醇而沉淀下来 将乙醇沉淀的糖原溶于水 一部分用做碘的颜色反应 另一部分经酸水解成葡萄糖后 用斑氏试剂进行检验 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关 葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色 20 30个之间使碘呈现