生物化学实验指南.doc

实验一 糖的呈色反应和定性鉴定目的要求(1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。(2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。. Molish反应-萘酚反应实验原理糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。试剂Molish试剂：取5g -萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。. 蒽酮反应实验原理糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。试剂蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。待测糖溶液，同Molish试验。操作方法取试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。. 酮糖的Seliwanoff反应实验原理该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。试剂Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2OHCl=21）(V/V)中，临用前配制。1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。操作方法取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。. Fehling试验实验原理费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。试剂试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，各加入Fehling试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2 3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。. Benedict试验实验原理Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。试剂Benedict试剂：将170g 柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠溶于800mL水中；另将17g硫酸铜溶于100mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。 该试剂可长期使用。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入2mL Benedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。. Barfoed试验实验原理在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。试剂Barfoed试剂：16.7g 乙酸铜溶于近200mL水中，加1.5mL冰醋酸，定容至250mL即可。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入2mL Barfoed试剂和2 3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜色变化。注意事项（1）Molish反应非常灵敏，0.001葡萄糖和0.0001蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释后再做。（2）果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间较长，且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色至蓝色产物。（3）酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。（4）糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应速度慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来判断。（5）Barfoed 反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现。思考题1. 列表总结和比较本实验六种颜色反应的原理和应用。2. 运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。实验二 氨基酸的纸层析目的要求（1）学习纸层析的原理。（2）掌握纸层析法分离混合氨基酸的操作方法。实验原理纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。Rf= 纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收2025%的水分；且其中67%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。层析溶剂要求：（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.050.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。试剂和器材一、试剂0.1%（W/V）茚三酮丙酮液。溶剂系统：正丁醇甲酸水1532（V/V）；二、测试样品缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸、（组氨酸、谷氨酸、亮氨酸）混合物、（缬氨酸、甘氨酸）混合物。三、器材层析缸2540cm（2）；培养皿15cm（2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸1212cm；铅笔，尺。操作方法一、点样取层析滤纸一张（1212cm），在距纸边2cm处用铅笔划一基线，在此线上标出七个点，每个点相距2cm，标上顺序。以毛细管吸取七种氨基酸样品溶液，（注意次序不能混淆），样品量约10-20uml，点的直径控制在2mm左右，不可过大。用电吹风将斑点吹干，待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。二、展层在层析缸中平稳的放入装有层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一端接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。三、显色 用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65烘箱内，烘30分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。（3）整个实验操作应戴手套进行。思考题1纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白目的要求（1）学习醋酸纤维素薄膜电泳原理；（2）掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白的操作技术。实验原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。它具有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析检测，是医学和临床检验的常规技术。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有白蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中白蛋白的泳动速度最快，其余依次为1、2、及球蛋白。这些区带经洗脱后可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。试剂和器材一、试剂巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.07）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4冰箱保存，备用。染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。漂洗液：含95乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀。二、材料新鲜血清（未溶血）三、器材醋酸纤维薄膜（28cm），培养皿，点样器，电泳仪，玻璃板，粗滤纸，铅笔和直尺，竹镊子操作方法1. 浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别光泽面和无光泽面，并在角上用笔做上记号），小心平放在盛有缓冲液的平皿中，浸泡30min左右。2点样：将浸透的薄膜从缓冲液取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），使其底边与模板底边对齐。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，再将点样器轻轻地印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。点样区距阴极端1.5cm处。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）3电泳：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥。将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。通电，调节电流强度0.40.6mA/cm膜宽度，电泳时间约11.5小时。醋酸纤维薄膜电泳装置示意图1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板4染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡10min。5漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机将薄膜吹干。6透明：将脱色吹干后的薄膜浸入透明液中，浸泡23分钟后，取出紧贴于洁净玻璃板上，两者间不能有气泡，干后即为透明的薄膜图谱（见下图）。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图注意事项（1）市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。（2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。（3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。（4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。（5）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。（6）操作过程为防止指纹污染，应戴手套。思考题1. 根据人血清中各蛋白组分的性质，如何估计它们在pH8.6的巴比妥巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度？2简述醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点。 实验四 温度、pH对酶活性的影响温度对酶活性的影响目的要求通过检验不同温度下唾液淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响。实验原理酶的催化作用受温度影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10，反应速度增加一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可使蛋白质变性，导致酶失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为3740，植物酶的最适温度为5060。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，而且容易被微生物污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。唾液淀粉酶 碘淀粉H2O 蓝色糊精 红色糊精 无色糊精 麦芽糖 葡萄糖试剂和器材一、试剂显色剂：KI-I2溶液二、器材（1）试管和试管架（2）吸量管（1、2ml）（3）烧杯（500、100ml）（4）锥形瓶（100ml）（5）水浴锅（6）铁三脚架（7）煤气灯（8）恒温水浴操作方法1、取唾液1ml，稀释200倍。2、取3只支试管，编号并各注入2mL淀粉溶液；3、将第1，2号管置于37，第3号管置于冰浴中保温5分钟。4、向1号管加入1ml煮沸15分钟后的稀释唾液淀粉酶液，2，3号管加入常温等量酶液。5、 静置20分钟，向各试管滴2滴KI-I2溶液。6、 观察实验现象并记录思考题1.什么是酶的最适温度？有体实践意义？2.酶在干燥的状态下与水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同？这个性质对酶的保存有体意义？3.酶反应的最适温度是酶的特征物理常数吗？它与哪些因素有关？pH对酶活性的影响目的要求1.了解pH对酶活性的影响。2.学习测定酶的最适pH的方法实验原理酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性降低。不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5 ，胰蛋白酶的最适pH为8等。应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲溶液性质的影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。试剂和器材一、试剂（1）0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 新鲜配制、需加热至无浊状 （2）稀释200倍的新鲜唾液（3）0.2M磷酸氢二钠溶液（4）0.1M柠檬酸溶液（5）碘化钾-碘溶液：取碘化钾2g 、碘1g溶于10ml水中，用时稀释10倍。二、器材（1）试管和试管架；（2）吸量管（0.5、1、2、5、10ml）；（3）锥形瓶（50、100ml）；（4）烧杯（100ml）；（5）量筒（100ml）；（6）玻璃漏斗；（7）吸量管架；（8）白瓷板；（9）恒温水浴；（10）滴管；（11）秒表；（12）滤纸。操作方法取8个50ml锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0-8.0的8种缓冲溶液。锥形瓶号0.2M磷酸氢二钠（ml）0.1M柠檬酸（ml）缓冲液pH15.154.855.025.804.205.636.313.696.046.923.086.457.722.286.868.691.317.279.360.647.689.720.288.0取9支干燥的试管，编号。将8个锥形瓶中不同pH的缓冲液各取3ml，分别加入相应号码（18）号的试管中。然后，再向每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml。第9号试管与第5号试管的内容物相同。向第9干燥的试管中加入稀释200倍的唾液2ml,摇匀后放入37恒温水浴中保温.每隔1min由第9号试管中取出一滴混合液,置于白瓷板上,加1滴碘化钾-碘溶液,检验淀粉的水解程度,待结果呈检黄色时,取出试管,记录保温时间。注意，掌握第9号试管的水解程度是本实验成败的关键之一。以1min的间隔，依次向第1至第8号试管中加入稀释200倍的唾液2ml，摇匀，并以1min的间隔依次将8号支试管放入37恒温水浴中保温。然后，按照第9号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入碘化钾-碘溶液2滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH。思考题1.PH对酶活性有何影响？什么是酶反应的最适pH？2.酶反应的pH是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义？3.通过几个酶学实验，你对下面问题如何认识：（1）酶作为生物催化剂具有哪些特性？（2）进行酶的实验必须注意控制哪些条件？为什么？生物化学实验教学大纲课程名称：生物化学实验英文名称：EXPERIMENT OF BIOCHEMISTRY 面向专业：生命学科相关专业实验指导书名称：现代生物学基础实验指导 出版单位：四川大学出版社出版日期：2002年 主编：林宏辉等一、课程学时学分课程总学时：51 课程总学分：2实验总学时：51 实验总分学：2二、实验的地位、作用和目的生物化学实验课程是生命科学教学中重要的基础课,它使学生通过本门课程的学习,掌握生物化学实验的基本理论基本知识以及基本实验技能,培养学生分析问题和解决问题的能力,培养学生具有一定的科学实验能力及严格认真的科学学风,加深理论知识和感性认识,注重培养学生的创新意识。三、基本原理及课程简介生物化学实验课程包括滴定、比色、层析、电泳、生化物质的分离、制备、分析和鉴定等基本实验技术及原理，包括实验方法、操作技术和一些基本仪器的原理及使用，分析糖、脂、蛋白质、核酸、酶、维生素等生物化学物质（定量、定性分析）及某些代谢过程（如脂肪酸的-氧化、氨基