乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定.pdf

收稿日期 2011 05 24 基金项目 国家自然科学基金资助项目 编号 81070077 省部共建重点教育部心血管重塑相关疾病重点实验室项目 编号 110267 首都医科大学基础 临床合作基金重点项目 编号 11JL09 作者简介 辛毅 1968 女 北京市人 学士 主管技师 主要从事细胞生物学研究 通讯作者 李温斌 1965 男 河南焦作人 博士 主任医师 博士生导师 主要从事心脏外科的基础与临床研究 欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁 欁欁 欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁 欁欁 氉 氉 氉 氉 本文引用 辛毅 许秀芳 黄益民 等 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 J 新乡医学院学报 2011 28 5 541 547 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 辛毅1 许秀芳2 黄益民2 张颖1 李温斌3 1 首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所实验中心 北京 100029 2 首都医科大学附属北 京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室 北京100029 3 首都医科大学附属北京安贞医院心外 科 北京100029 摘要 目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离 培养及鉴定的技术方法 方法 乳小鼠心脏剪成组织块 用 型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞 再通过差速贴壁分离法分别收集 培养乳 小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞 光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化 并对 2 种 细胞行苏木素 伊红 HE 染色 用第2 代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定 而原代心肌细胞行 横纹肌肌动 蛋白 心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定 结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养 90 min 基 本贴壁 贴壁较早 培养第 3 5 代细胞生长良好 72 h 心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达 97 而心肌 细胞贴壁较晚 24 h 贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象 48 h 后细胞逐渐展开 72 h 后逐渐形成细胞簇并出现 同步搏动 心肌肌球蛋白重链 心肌横纹肌肌动蛋白 心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为 95 93 95 结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞 此方法成熟 稳定 有效 为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型 关键词 心肌成纤维细胞 心肌细胞 原代培养 乳小鼠 免疫荧光 中图分类号 Q95 33 Q2 33文献标志码 A文章编号 1004 7239 2011 05 0541 07 Isolation primary culture and identification of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes of neonatal mouse XIN Yi1 XU Xiu fang2 HUANG Yi min2 ZHANG Ying1 LI Wen bin3 1 Beijing Anzhen Hospital Capital Medical University Department of Experimental Center Beijing Institute of Heart Lung and Blood Vessel Diseases Beijing 100029 China 2 Beijing Anzhen Hospital Capital Medical University Department of Molecular Biology Beijing Institute of Heart Lung and Blood Vessel Diseases Beijing 100029 China 3 Department of Cardiac Surgery Beijing Anzhen Hospital Affiliated to Capital Medical University Beijing 100029 China Abstract ObjectiveTo build the isolation culture and identification techniques of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes of neonate mouse MethodsThe heart of neonate mouse was cut into pieces then type collagenase plus trypsi nase digestion method were used for isolating cell and then cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were collected and cultured by different speed adherence The basic shape change of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were observed under the opit ical microscope and the two kinds cells were given hematoxylin eosin staining The second generation cardiac fibroblasts were assayed by vimentin immunofluorescence and cardiac myocytes were assayed by sarcomeric actin cardiac troponin and cardi ac myoglobulin heavy chain immunofluorescence ResultsFibroblasts were adhered after 90 minutes of primary culture by the method of different speed adherence and the third generation to the fifth generation cells growth well The expression of vimen tin of 97 fibroblasts were positive after 72 hours culture But cardiac myocytes were adhered after 24 hours of culture and there was spontaneous beating phenomenon of part cardiac myocytes The cells gradually spread after 48 hours The cells clus ters were formed and there was synchronous pulsation after 72 hours The positive expression rate of cardiac myoglobulin heavy chain sarcomeric actin and cardiac troponin was 95 93 95 respectively after 72 hours culture ConclusionDiffer ent speed adherence method and immunoflurescence were effective and stable to isolate the cardiac fibroblasts and cardiac myocytes This method provide an ideal experimental model for the basic and clinical research of heart disease Key words cardiac fibroblasts cardiac myocytes primary culture neonatal mouse immunoflourescence 145 第 28 卷第 5 期 2011 年 9 月 新乡医学院学报 Journal of Xinxiang Medical College Vol 28No 5 Sep 2011 随着分子 细胞生物学的发展 细胞水平的研究 日益受到重视 国内外诸多学者开展了心肌细胞的 生理 病理 药理 代谢等方面的基础研究 1 体外 培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点 并具有自发性节律搏动 不传代 且心肌细胞的培养 具有不受体内神经体液因素的影响等特点 成纤维 细胞是结缔组织中最常见的细胞 可合成和分泌胶 原纤维 弹性纤维 网状纤维及有机基质 并且在外 伤等因素刺激下 部分纤维细胞可重新转变为幼稚 的成纤维细胞 其功能活动也得以恢复 参与组织损 伤后的修复 实验研究中由于心肌细胞和成纤维细 胞在原代细胞培养时均是贴壁细胞 故需要建立一 种技术方法将 2 种细胞分离开并保持各自的纯度 差速贴壁纯化法是根据成纤维细胞和心肌细胞在培 养皿表面贴壁时间不同而进行分离的 操作简单 对 细胞影响小 分离纯度高 本实验参照 Simpson 等 2 3 心肌细胞的培养方法并作了部分改进 用 型 胶原酶 胰蛋白酶联合消化法替代单一胰蛋白酶消 化提高心脏组织的消化效率 并结合 90 min 差速贴 壁及心肌细胞专用培养基 cardiac myocyte medium CMM 的应用 从根本上提高心肌细胞的存活率和 纯度 同时又能分离培养纯度很高的心肌成纤维细 胞 为研究心脏疾病提供理想的实验模型 1材料与方法 1 1材料 1 1 1实验动物乳小鼠 C57BL 6 雌雄不限 1 3 日龄 体质量 1 2 1 5 g 来源于北京维通利 华实验动物技术有限公司 1 1 2主要试剂高糖 杜尔伯科改良伊格尔培养 基 high glucose dulbecco modified eagle medium HG DMEM 胎牛血清 fetal bovine serum FBS 青 霉素 链霉素均为美国 Gibco 公司产品 型胶原 酶 胰蛋白酶 4 6 联脒 2 苯基吲哚 4 6 diamidino 2 phenylindole DAPI 3 4 5 二甲基 2 噻唑 2 5 二苯基溴化四氮唑蓝 3 4 5 dimethyl 2 thiahiazo 2 5 diphenyltetrazolium bromide MTT 二甲基亚砜 dimethyl sulfoxide DMSO 均为美国 Sigma 公司产 品 波形蛋白 Vimentin 兔抗小鼠 一抗 美国 Santa Cruz 异硫氰酸罗丹明 tetraethyl rhodamine isothiocyanate TRITC 标记的羊抗兔 IgG 二抗 美 国 Jacson 心肌肌钙蛋白 Troponin I Tn I 羊抗人 人与鼠有交叉反应性 一抗 美国 Santa Cruz TRITC 标记的兔抗羊 IgG 二抗 美国 Jacson 小鼠 腹水单克隆抗体 横纹肌肌动蛋白 sarcomeric actin SA 美国 Sigma EA 53 TRITC 标记的羊抗 鼠 IgG 二抗 美国 Jacson 肌球蛋白重链 myosin heavy chain MHC 小鼠单克隆抗体 英国 Abcam 3 48 CMM 为美国 ScienCell 公司产品 细胞培养 板 离心管 培养皿等耗材购自美国 Corning 公司 1 1 3主要仪器荧光倒置显微镜 德国 Leica 4000B 型 荧光正置显微镜 日本 OlympusBX 51 CO2细胞培养箱 日本三洋公司产品 酶标检测仪 德国 Beckman 超净工作台 北京昌平长城净化 空气仪器厂 离心机 上海安亭科学仪器厂 TGL 16C 1 2方法 1 2 1取材将乳鼠于体积分数 75 乙醇缸中浸 泡 10 s 转移至超净台 将乳鼠固定于左手掌中 右 手用无菌棉签蘸体积分数 75 酒精消毒胸 腹部皮 肤 3 次 用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上 开胸后 用剪子压住胸骨右缘 使心脏自然跳出 用 弯镊子勾住心尖根部 取出心脏 置于装有预冷 0 01 mol L 1 磷酸盐缓冲溶液 phosphate buffered solution PBS 的培养皿中 将鼠心脏全部取出后 剪去心房 剔除心脏上结缔组织 脂肪及血管 于预 冷 0 01 mol L 1 PBS 含双抗 清洗 3 次 去除血 污 将心脏剪成约 1 mm 1 mm 1 mm 的组织块 备用 1 2 2双酶消化分离培养法组织碎块放入100 mL 锥形 瓶 中 再 加 入 2 g L 1 型 胶 原 酶 和 2 5 g L 1胰蛋白酶 1 1 联合消化液体积为心肌 组织的10 15 倍 置37 80 r min 1水浴摇床消 化 20 min 后 吸管轻轻吹打组织块2 min 分散细胞 此时消化液变混浊 小部分组织块变成白色 用吸管 吸取细胞悬液放入 15 mL 的离心管中 加入含体积 分数 10 FBS HG DMEM 终止消化 收获细胞 在 其余未完全消化的组织块中加入联合消化液 为上 次消化液总体积的 1 2 余步骤同前 重复消化 4 次 所有的细胞悬液过 200 目铜网 1 2 3细胞培养吸取细胞悬液入15 mL 离心管 1 000 r min 1离心 5 min 弃上清 细胞沉淀中加入 含体积分数 10 HG DMEM 10 mL 吹打均匀后放 入 100 mm 培养皿 置体积分数 5 CO2 37 培养 箱中培养 放置 90 min 差速贴壁 最先贴壁为心肌 成纤维细胞 将未贴壁的细胞悬液 含有心肌细胞 收集到 15 mL 离心管中 1 000 r min 1离心5 min 弃上清 加入含体积分数10 FBS HG DMEM 1 mL 245 新乡医学院学报http www xxyxyxb com 2011 年第 28 卷 重悬细胞 用台盼蓝染色法计数调整细胞浓度 将其 调成细胞浓度为 1 0 108 4 0 108L 1后接种于 6 孔板中 置体积分数 5 CO2 37 培养箱中继续 培养 再 加 入 10 mL 含 体 积 分 数 10 FBS HG DMEM于 100 mm 培养皿 继续培养心肌成纤维 细胞 第 2 天 6 孔板中的 HG DMEM 换成 CMM 培 养基 100 mm 培养皿换成新鲜的10 mL 含体积分数 10 FBS HG DMEM 每 2 d 换液 1 次 1 2 4分离纯化心肌成纤维细胞和心肌细胞在 细胞培养中 心肌成纤维细胞具有分裂增殖能力 且 生长迅速 贴壁较早 依据成纤维细胞与心肌细胞贴 壁时间不同的原理做差速分离 待成纤维细胞生长 到培养皿的50 60 时 加入0 01 mol L 1 PBS 洗 1 次 用2 5 g L 1胰蛋白酶消化 在显微镜下观 察消化程度 细胞形态由长梭形逐渐变成圆形 加入 含体积分数 10 FBS HG DMEM 终止消化 将细胞 悬液收集到 15 mL 离心管中 1 000 r min 1 离心 5 min 弃 上 清 加 入 含 体 积 分 数 10 FBS HG DMEM 1 3 传代 可传 6 代 细胞 5 代以后逐 渐衰老 最后贴壁的是心肌细胞 它不具分裂增殖能 力 且对胰蛋白酶比较敏感 在显微镜下严格控制消 化时间 一般为 1 2 min 待细胞的突起 触角逐渐 回缩时 加入 FBS 使细胞终止消化 轻轻吹打培养 皿底部 使细胞悬浮 把细胞悬液收集到15 mL 离心 管中 1 000 r min 1 离心 5 min 弃上清 CMM 重 悬 调整细胞数接种于不同的培养皿 培养板中 进 行后续实验的应用 1 2 5心肌成纤维细胞和心肌细胞活力测定 1 2 5 1MTT 法测定心肌成纤维细胞增殖活力 取生长良好的心肌成纤维细胞 以每孔约 2 103个 细胞等量接种于 96 孔板中 每孔加入 100 L 培养 液 置 37 体积分数 5 CO2细胞培养箱内孵育 每隔 24 h 向其中 5 孔加入 5 g L 1 的 MTT 溶液 20 L 孵育 4 h 后吸弃培养液 加入 150 L 的 DM SO 置于37 体积分数5 CO2孵育10 min 每日 测 5 孔 连续测 7 d 设立平行对照孔 加入培养 液 不加细胞 并调零 用酶标仪在 490 nm 波长处 测定各孔的光密度值 D490 nm MTT 法连续 7 d 测定心肌成纤维细胞增殖及存活能力 1 2 5 2心肌细胞活力测定在原代心肌细胞培 养第 3 天 观察心肌细胞搏动的节律 并在高倍视野 下计数有自发搏动的细胞 20 个 记录每分钟搏动频 率 进行统计学比较 1 2 6心肌成纤维细胞和心肌细胞形态学观察 1 2 6 1倒置光学显微镜观察观察心肌成纤维 细胞和心肌细胞生长状态 形态变化 心肌细胞搏动 的节律 并在高倍视野下计数有自发搏动的细胞个 数 进行摄像 1 2 6 2苏木素 伊红 hematoxylin eosin HE 染 色观察取传2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞 以105个接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板 2 3 d 后 用0 01 mol L 1PBS 洗 3 次 每次 2 min 40 g L 1 多聚甲醛固定20 min 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每 次2 min 苏木素染色2 5 min 水洗 2 min 5 g L 1 盐酸分化至细胞核染色清晰 水洗 并浸于水中至核 变蓝 伊红液染色 1 2 min 水洗 2 min 体积分数 80 乙醇浸洗 1 min 体积分数 90 乙醇 无水乙醇 浸洗1 min 二甲苯浸洗5 min 取出盖玻片后中性树 胶封片并在显微镜下观察 1 2 7心肌成纤维细胞和心肌细胞的免疫荧光法 鉴定 1 2 7 1心肌成纤维细胞 Vimentin 抗原的鉴定 取传 2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞以 105个 接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板 2 3 d 后用 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 40 g L 1 多聚甲醛固定 20 min 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次2 min 3 g L 1聚乙二醇辛基苯基醚 Triton X 100 室温封闭 30 min 用 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 200 L FBS 室温封闭 1 h 滴加 1 100 稀释 200 L 兔抗小鼠 Vimentin 一抗 室温 孵育 1 5 h 用 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 然后加 1 100 TRITC 标记的羊抗兔 IgG 二 抗200 L 室温避光孵育 1 h 用 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 最后用 DAPI 染核 室温避光孵 育15 min 同时做同型对照 不加一抗 余步骤同前 在荧光显微镜下观察 统计阳性细胞数 1 2 7 2心肌细胞 MHC Tn I 和 SA 抗原的鉴定 取传2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞以 105 个接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板内制作细胞爬片 2 3 d 后取出爬片 0 01 mol L 1PBS 洗 3 次 每次 2 min 40 g L 1 多聚甲醛 pH 7 2 固定40 min 0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 3 g L 1 Triton X 100 室温封闭 30 min 用0 01 mol L 1 PBS 洗3 次 每次 2 min 200 L FBS 室温封闭 1 h 取 200 L 1 100 稀释的 MHC 一抗滴到接种有心肌 细胞的盖玻片上 室温孵育 1 5 h 用0 01 mol L 1 PBS 洗 3 次 每次 2 min 1 100 TRITC 标记羊抗鼠 IgG 二抗室温避光孵育2 h 用 0 01 mol L 1PBS 洗 345 第 5 期辛毅 等 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 3 次 每次 2 min 最后用 DAPI 染核 室温避光孵育 15 min 在荧光显微镜下观察细胞 统计阳性细胞 数 随机取 10 个高倍视野计数阳性细胞及细胞总 数 阳性细胞率 阳性细胞数 细胞总数 100 一抗分别用 200 L 1 100 稀释羊抗人 Tn I 人与 鼠有交叉反应性 和 1 100 稀释兔抗羊 IgG 二抗 200 L 1 100 稀释的 SA 一抗和 1 100 TRITC 标记的羊抗小鼠 IgG 二抗做免疫荧光染色 同时做 同型对照 不加一抗 余步骤同前 2结果 2 1心肌成纤维细胞和心肌细胞的生物学特性 原代分离培养中刚分离的混合细胞呈大小不一的球 形 培养 90 min 细胞开始陆续贴壁生长 最先贴壁 的为心肌成纤维细胞 细胞呈不规则形或椭圆形 后 变为长梭形 图 1A 培养 2 3 d 观察 可见明显增 殖 2 3 d 即可呈融合状态 细胞排列紧密 有的交 叉重叠生长 无自发性搏动 细胞生长达到 70 80 可传代 5 代之后会出现明显衰老 将 90 min 后 未贴壁的心肌细胞悬液 图1B 接种于6 孔板中 第 2 天待心肌细胞贴壁后 换成 CMM 培养基替代化学 抑制纯化法 继续培养 2 3 d 观察 未见增殖 视野 中绝大多数细胞为已开始自发性搏动的心肌细胞 图 1C A 培养90 min 心肌成纤维细胞 贴壁 B 培养90 min 心肌细胞 悬 浮 C 培养 3 d 心肌细胞 贴壁 图 1光镜下原代培养成纤维细胞和心肌细胞形态 Fig 1Shape of fibroblasts and cardiac myocytes under light microscope 2 2心肌成纤维细胞和心肌细胞活力测定结果 心肌成纤维细胞生长前2 d 与3 d 比较 其细胞活力 差别有统计学意义 P 0 01 表 1 提示增殖能 力较弱 3 7 d 变化较为显著 提示此段时间内细 胞增殖较为旺盛 两两比较差别无统计学意义 P 0 05 可进行传代 心肌细胞原代培养 2 3 d 部分 开始搏动 第 3 天开始呈现有规律 不同步搏动 第 7 天后细胞融合形成细胞簇或团 细胞呈现同步搏 动 其搏动由周缘向心搏动 收缩明显而有力 故活 力测定从第 3 天开始 随机计数 20 个细胞搏动频率 表 2 搏动频率多为 70 100 次 min 1 同一培 养板中细胞间的搏动频率可不同 培养第 3 天与第 15 天心肌细胞搏动频率比较差别无统计学意义 P 0 05 说明培养的心肌细胞3 15 d 无论细胞 形态还是细胞活力都良好 在此期间可进行实验研 究 第 17 天后与培养 15 d 前心肌细胞搏动频率比 较差别有统计学意义 P 0 01 说明心肌细胞第 17 23 天心肌细胞活力开始下降 搏动次数减少 其搏动由周缘向心搏动变为从两端向中心方向收 缩 颇似肌纤维束的收缩 细胞出现衰老状态 表 1培养心肌成纤维细胞活力测定 Tab 1Vitality test of cultured fibroblasts 珔x s n 5 培养时间 d 光密度值 D490 nm 10 064 0 006 20 077 0 009 30 126 0 012a 40 138 0 010a 50 203 0 010a 60 230 0 019a 70 219 0 018a 与 2 d 前比较aP 0 01 表 2培养心肌细胞活力测定 Tab 2Vitality test of cultured cardiac myocytes 珔x s n 20 培养时间 d 搏动 次 min 1 385 30 3 34 585 70 3 62 784 10 2 23 984 20 4 00 1182 20 4 89 1381 80 5 32 1580 00 4 64 1762 70 5 10a 1948 30 16 00a 2127 20 12 04a 238 40 2 95a 与 15 d 前比较aP 0 01 2 3心肌成纤维细胞和心肌细胞 HE 染色观察结 果差速贴壁法最先贴壁的为心肌成纤维细胞 细 胞平坦 胞质透明 颜色淡 显得很薄 细胞核较大 椭圆形 经常含有 2 3 个核 图 2A 心肌细胞胞 质颜色较深 有颗粒样物质 略显粗糙 细胞核小 椭 圆形 颜色较深 通常为 1 个核 有自发性搏动 图 2B 445 新乡医学院学报http www xxyxyxb com 2011 年第 28 卷 A 心肌成纤维细胞 B 心肌细胞 图 2心肌成纤维细胞和心肌细胞 HE 染色 200 Fig 2Cardiac fibroblasts and cardiac myocytes HE stai ning 200 2 4心肌成纤维细胞和心肌细胞的纯度鉴定培 养的成纤维细胞 Vimentin 抗原表达呈阳性反应 阳 性细胞率为 97 图 3A 同时做心肌细胞对照实 验 呈阴性反应 图 3B 培养的心肌细胞 72 h 后行 MHC 免疫荧光鉴定抗原表达阳性 阳性细胞率为 95 图 4A 同时做心肌成纤维细胞 MHC 对照实 验 免疫荧光呈阴性反应 图 4B 72 h 后心肌细胞 行 Tn I 免疫荧光鉴定抗原表达阳性 阳性细胞率为 95 图 5A 同时做成纤维细胞 Tn I 对照实验 免 疫荧光呈阴性反应 图 5B 72 h 后心肌细胞行 SA 免疫荧光鉴定抗原表达阳性 阳性细胞率为 93 图 6A 同时做成纤维细胞 SA 免疫荧光鉴 定抗原表达阴性 图 6B A 心肌成纤维细胞 B 心肌细胞 图 3心肌成纤维细胞和心肌细胞 Vimentin 抗原表达情况 免疫荧光染色 200 Fig 3Vimentin antigen presentation of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes immunofluorescence staining 200 A 心肌细胞 B 心肌成纤维细胞 图 4心肌细胞和心肌成纤维细胞 MHC 抗原表达情况 免 疫荧光染色 200 Fig 4MHC antigen presentation of cardiac myocytes and cardiac fibroblasts immunofluorescence staining 200 A 心肌细胞 B 心肌成纤维细胞 图 5心肌细胞和心肌成纤维细胞免疫荧光 Tn I 抗原表达 情况 免疫荧光染色 200 Fig 5Troponin I antigen presentation of cardiac myocytes and cardiac fibroblasts immunofluorescence staining 200 A 心肌细胞 B 心肌成纤维细胞 图 6心肌细胞和心肌成纤维细胞免疫荧光 SA 抗原表达 情况 免疫荧光染色 200 Fig 6The SA antigen presentation of cardiac myocytes and cardiac fibroblasts immunofluorescence staining 200 3讨论 心脏是由心肌细胞和非心肌细胞组成 其中心 肌细胞约占心脏组织的 25 近 75 的细胞是非心 肌细胞 如成纤维细胞和血红细胞 心肌成纤维细 胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂很强的增殖能 力 很容易生长成优势细胞 心脏成纤维细胞构成 心肌层绝大多数的非心肌细胞 对心肌功能的正常 运作起着重要作用 4 一方面心肌成纤维细胞通 过产生细胞外基质 如胶原蛋白和纤维连接蛋白 构 成了心肌细胞的机械框架 另一方面 心肌成纤维细 胞还可以产生心室重构过程中所需的金属蛋白酶 各种生长因子和细胞因子 临床上 心肌成纤维细 胞的增殖参与了高血压左心室肥厚 缺血性心脏病 扩张型心肌病及充血性心力衰竭等多种心血管疾病 的病理过程 研究心肌成纤维细胞对于现代心血管 疾病的研究也具有重要意义 基础与临床实验需要 将心肌细胞和成纤维细胞完全分离开来 体外培养时非心肌细胞的快速生长与体内的情 况完全不同 可能使心肌细胞生长出现密度抑制的 现象 因此 获得纯度高的心肌细胞培养模型对研究 方法的科学性及结果的可靠性具有重要意义 545 第 5 期辛毅 等 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 在以往的乳鼠心肌细胞原代培养中 分离心肌 细胞的方法有机械收集法和酶消化法 用吸管反复 吹打的机械分离方法 吹打不易控制 极易损伤心肌 细胞 成活细胞率较低 单一胰蛋白酶消化法主要 用于分解组织间质的蛋白质 作用强 对细胞膜 细 胞内微丝及微管损伤较大 而且组织经过胰蛋白酶 处理后会释放出大量的胶原蛋白 胶原蛋白呈絮状 使上清很难分离开 获得的心肌细胞数量少而且活 力差 影响心肌细胞获得率 而胶原酶作用缓和 主 要用于消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细 胞 因此 本研究采用较低浓度的胰蛋白酶和较高浓 度的 型胶原酶的混合消化酶消化心肌组织 既能 很好地将心肌细胞和成纤维细胞分离出来 又不损 伤心肌细胞 也能很好地收集心肌细胞 消化酶作用 时间对心肌细胞的获得影响很大 消化时间过长 胰 蛋白酶对心肌细胞损害增加 消化时间过短 胶原酶 起不到消化作用 因此 每次消化时间不应过长 最 佳时间为 10 20 min 且多次重复消化及时终止 本研究用改良法成功地进行了新生小鼠心肌成 纤维细胞和心肌细胞分离 依据心肌成纤维细胞贴 壁速度很快 而心肌细胞相对较慢 通过差速贴壁 90 min 可以比较有效地分离心肌成纤维细胞和心 肌细胞 5 7 在心肌细胞体外培养中 传统的培养基 使用含 0 1 mmol L 1 5 溴脱氧尿嘧啶 HG DMEM 培养基 近年来有学者发现高糖能诱导心肌细胞凋 亡 8 10 可能通过氧化应激诱导心肌细胞凋亡 11 还有可能通过影响凋亡相关基因的表达而诱导心肌 细胞凋亡 12 CMM 的应用替代化学抑制纯化法 前者使心肌细胞纯度高 细胞存活率高 细胞贴壁 快 搏动早且操作简便 重复性好 而后者利用化学 物质对非心肌细胞的生长进行抑制或破坏作用来分 离纯化心肌细胞 不适于培养较长时间的实验 同时 加入化学物质会对心肌细胞活力产生一定影响 细胞骨架包括微管 微丝和中间纤维 中间纤维 家族中包含 Vimentin 角蛋白等许多成员 其中 Vim entin 是间质细胞中最主要的中间纤维 它存在于中 胚层起源的细胞中 如成纤维细胞 内皮细胞和白细 胞等 13 并与微管 微丝共同形成了一个细胞支架 网络而维持细胞完整性 实验表明成纤维细胞表达 Vimentin 阳性 可根据 Vimentin 表达阳性来鉴定成 纤维细胞 成纤维细胞的数量大约是心肌细胞的 2 倍 分 裂增殖能力旺盛 14 研究发现成纤维细胞 Vimen tin 与线粒体功能有关 Vim 小鼠和 Vim 小鼠 的成纤维细胞中线粒体的数量 形态和活性均有所 差异 有学者在研究 Vimentin 和线粒体的关系发 现 多次传代后的 Vim 成纤维细胞的线粒体 DNA 拷贝数是传代前的 215 倍 线粒体 DNA 与线 粒体质量比高达 415 并且线粒体 DNA 出现明显缺 失 说明 Vim 成纤维细胞对线粒体 DNA 的调控 能力较低 导致线粒体 DNA 容易发生改变 15 Tol stonog 等 16 研究发现 在细胞永生化过程中 与 Vim 成纤维细胞相比 Vim 成纤维细胞转变成 永生化细胞的比例很低 而且需要较长的时间才能 形成数量较多的单层永生化细胞 更为重要的是 在 Vim 成纤维细胞中 线粒体呼吸链和氧化磷酸化 偶联过程比正常细胞弱 细胞核及核周区域中有大 量的活性氧簇产物进行性地积聚 由此可见 Vim entin 不仅能够引发细胞永生化 而且在成纤维细胞 老化过程中发挥保护作用 保护其不发生退行性变 化 Vimentin 还能与细胞核 DNA 分子结合 影响基 因的修复和重组 也有助于细胞获得永生化的能力 心肌细胞增殖能力低 多数实验来源于心肌细 胞的原代培养 原代培养的成功与否直接关系到实 验的进程 提高心肌细胞的存活率和纯度是心肌细 胞培养成功的关键 肌组织分骨骼肌 心肌和平滑 肌 3 种 前 2 种属横纹肌 肌动蛋白是细胞的一种 重要骨架蛋白 是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白 成分 也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分 肌动蛋白具有收缩功能 分布广泛 在细胞分泌 吞 噬 移动 细胞质环流和细胞质分裂等生命活动中起 重要作用 Tn 由 Tn I T C 3 个亚基构成 和原肌球 蛋白一起通过调节钙离子对 ATP 酶的活性来调节 肌动蛋白和肌球蛋白相互作用 Tn 是组成横纹肌 细丝的结构蛋白 可调节钙介导的肌动蛋白和肌球 蛋白之间的相互反应 本身为多肽 其亚单位 I T 和 C 组成复合物 其中 Tn I 是肌原纤维 ATP 酶的抑 制单位 可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合 阻止肌肉 收缩 故本实验用 SA Tn I 和心肌肌球蛋白重 链 17 单克隆抗体来荧光标记心肌细胞 心肌细胞呈 阳性反应 总之 本研究通过长时间的实验证实 利用低浓 度的胰蛋白酶与胶原酶联合应用 多次消化心脏组 织 通过差速贴壁 90 min CMM 培养基的使用 并通 过特异性免疫荧光鉴定 能够建立一种较为理想的 心肌成纤维细胞和心肌细胞原代培养方法 以满足 心血管疾病发生 发展机制及心血管药物和心脏组 织工程学的研究及多种生理生化实验的要求 645 新乡医学院学报http www xxyxyxb com 2011 年第 28 卷 参考文献 1 邸美仙 李应东 乳鼠心肌细胞的培养 J 中华中医药学刊 2007 25 4 691 692 2 Simpson P Savion S Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nomyocardial cells J Circ Res 1982 50 1 101 116 3 张乃菊 陈天平 祝晓光 等 乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞 的原代培养 J 蚌埠医学院学报 2010 35 6 558 561 4 Baudino T A Carver W Giles W et al Cardiac fibroblasts friend or foe J Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006 291 3 1015 1026 5 Dosenko V E Nagibin V S Tumanovskaya L V et al Postcondi tioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death inculture J Fiziolohichny Zhurnal 2005 51 3 12 17 6 Kim K H Kim T G Bruce K et al Dynamic expression patterns of leucine rich repeat containing protein 10 in the heart J Dev Dyn 2007 236 8 2225 2234 7 王宁 李应东 乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进 J 中国心 血管病研究 2007 5 12 920 922 8 Singh V P Le B Khode R et al Intracellular angiotensinII produc tion in diabetic rats is correlated with cardiomyocyte apoptosis oxi dative stress and cardiac fibrosi J Diabetes 2008 57 12 3297 3306 9 Shen E Li Y Li Y et al Rac1 is required for cardiomyocyte apop tosis during hyperglycemia J Diabetes 2009 58 10 2386 2395 10 Li Y Li Y Feng Q et al Calpain activation contributes to hyper glycaemia induced apoptosis in cardiomyocytes J Cardiovasc Res 2009 84 1 100 110 11 Cai L Wang Y Zhou G et al Attenuation by metallothionein of early ca