动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MSMS定量分析方法.pdf

56 一 背景 氯霉素 Chloramphenicol 是一种广谱抗生素 其对伤寒杆菌 流感杆菌 副流感杆菌和百日咳杆菌的 作用良好 对立克次体感染如斑疹伤寒也有效 但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素 氯霉素对人类 的毒性较大 它会引起再生障碍性贫血 新生儿灰色综合症等疾病 尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致 病菌的耐药性 食品中氯霉素的残留不但对人体造成危害 而且该药已在国外较多国家禁用 严重影响我国食 品的出口 因此准确测定食品中氯霉素的残留量具有重要意义 目前 GB T 22338 2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 中详细介绍了水产品 畜牧产品 和畜牧副产品中氯霉素类化合物残留量的气相色谱 质谱和液相色谱 质谱法 方法中采用内标法定量检测氯 霉素 以及外标法对甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定量 本文中将详细介绍采用AB SCIEX 3200 QTRAP LC MS MS检测氯霉素 并且经实验证实AB SCIEX API 4000 系列 API 5000 以及API 5500 系列同样 适用于该方法 二 化合物信息 动物源性食品中氯霉素类药物的LC MS MS定量分析方法 表1 化合物基本信息 化合物 英文通用名 分子量 CAS 分子式 氯霉素 Chloramphenicol 323 1 56 75 7 C11H12Cl2N2O5 甲砜霉素 Thiamphenicol 355 0 15318 45 3 C12H15Cl2NO5S 氟甲砜霉素 Florfenicol 357 0 73231 34 2 C12H14Cl2FNO4S 三 前处理方法 GB T 22338 2008 1 样品提取 1 1 动物组织 肝 肾除外 与水产品 称取试样5 g 精确至0 01 g 置于50 mL离心管中 加入100 L氯霉素氘代内标 氯霉素 D5 工作 溶液和30 mL乙腈 匀浆 离心5 min 将上清液转移至250 mL分液漏斗中 加入15 mL乙腈饱和的正己烷 振荡5 min 静置分层 转移已经层至100 mL棕色心形瓶中 残渣中再加入30 mL乙腈 振摇3 min 离心 5 min 取上清液转移至同一分液漏斗 振荡5 min 静置分层 转移乙腈层至同一棕色心形瓶中 向心形瓶中 加入5 mL正丙醇 于40 水浴中旋转蒸发近干 用氮气吹干 加5 mL丙酮 正己烷 1 9 溶解残渣 1 2 动物肝 肾组织 称取试样5 g 精确至0 01 g 置于50 mL离心管中 加入30 mL乙酸钠溶液 均质2 min 加入300 L 葡萄糖醛酸苷酶 于37 温育过夜 消解样品中加入100 L氯霉素氘代内标 氯霉素 D5 工作溶液和 20 mL乙酸乙酯 乙醚 75 25 振荡2 min 离心5 min 取上层有机层入心形瓶中 在40 水浴中旋转蒸 发近干 用氮气吹干 加5mL丙酮 正己烷 1 9 溶解残渣 1 3 蜂蜜 称取蜂蜜试样5 g 精确至0 01 g 置于50 mL离心管中 加入100 L氯霉素氘代内标 氯霉素 D5 工作溶液 5 mL水混匀 再加入20 mL乙酸乙酯 振摇2 min 离心5 min 移取有机层到100 mL棕色心形瓶 中 于离心管中在加入20 mL乙酸乙酯 振摇2 min 离心5 min 合并有机层至同一棕色心形瓶中 于40 水浴中旋转蒸发至干 加3 mL水溶解残渣 混匀 57 动物源性食品中氯霉素类药物的LC MS MS定量分析方法 2 净化 2 1 动物组织与水产品 用5 mL丙酮 正己烷淋洗LC Si硅胶小柱 弃去淋洗液 将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上 弃去流出 液 用5 mL丙酮 正己烷 6 4 洗脱 收集洗脱液于心形瓶中 40 水浴中旋转蒸发近干 用氮气吹干 加 1 mL水定容 定容液过0 45 m滤膜至进样瓶 待测定 2 2 蜂蜜 分别用5 mL甲醇 5 mL水活化EN固相萃取住 将提取液转移上柱 用5 mL水淋洗 用玻璃棒压干 1 min 用3 mL乙酸乙酯洗脱 洗脱液用氮气吹干 用1 mL水定容 定容液过0 45 m滤膜至进样瓶 待 测定 四 实验方法 1 液相条件 色谱柱 Phenomenex Aqua 2 0X50mm 5 m 柱温 45 流速 400 L min 流动相 A 水 B 乙腈 梯度洗脱 洗脱条件见表2 2 质谱条件 离子源 Turbo V 离子源 扫描模式 负离子 采集模式 多反应监测MRM 表2 液相色谱条件 时间 min A B 0 75 15 0 5 75 15 4 50 50 5 50 50 5 2 75 15 8 75 15 表3 氯霉素类化合物MRM离子对 化合物名称 母离子 子离子1 子离子2 氯霉素 321 152 257 甲砜霉素 354 185 290 氟甲砜霉素 356 336 185 氯霉素 D5 内标 326 157 58 2 定性线性曲线 2 1 氯霉素 0 005 1 ng mL y 1 03850e6 x 895 10620 r 0 99809 weighting 1 x 2 Levels 已知浓度 ng mL 实测浓度 ng mL 准确度 10 0050 005102 6 20 0100 01098 7 30 0200 01891 8 40 0500 050100 2 50 1000 102101 9 60 2000 19597 3 70 5000 48797 3 81 0001 101110 2 2 2 氟甲砜霉素 0 005 1 ng mL y 1 10818e6 x 921 19434 r 0 99873 Weighting 1 x 2 Levels 已知浓度 ng mL 实测浓度 ng mL 准确度 10 0050 005104 6 20 0100 00991 1 30 0200 02097 8 40 0500 052103 9 50 1000 101100 8 60 2000 19698 2 70 5000 511102 2 81 0001 015101 5 五 定量质谱数据 1 色谱图示例 59 2 3 甲砜霉素 0 01 1 ng mL y 3 59685e5 x 683 73073 r 0 99913 weighting 1 x 2 Levels 已知浓度 ng mL 实测浓度 ng mL 准确度 10 0100 01097 8 20 0200 021102 8 30 0500 051102 8 40 1000 105105 3 50 2000 19396 5 60 5000 48797 5 71 0000 97497 4 10 0100 01097 8 六 重现性数据 鱼肉基质样品连续6针进样峰面积的重现性 氯霉素氟甲砜霉素甲砜霉素 浓度平均值 ng mL 0 0060 860 94 平均峰面积 RSD 6 765e3 4 6 9 538e5 1 8 3 406e5