反向遗传操作技术.pdf

生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 1 反 反向 向遗 遗传 传操 操作 作技 技术 术 生 生 生生物 物 物物秀 秀 秀秀搜 搜 搜搜集 集 集集整 整 整整理 理 理理 w ww ww w b bb bi io oo o c co om m 反向遗传操作技术反向遗传操作技术 reverse genetics 与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思 与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思 路相反 路相反 是指通过构建是指通过构建 RNA 病毒的感染性分子克隆 病毒的感染性分子克隆 在病毒在病毒 cDNA 分子水平上对其进行体 分子水平上对其进行体 外人工操作 也被称为 病毒拯救外人工操作 也被称为 病毒拯救 the rescue of virus 反向遗传学是相对于经典遗传学而言的 反向遗传学是相对于经典遗传学而言的 经典遗传学是从生物的性状 表型到遗传物质 经典遗传学是从生物的性状 表型到遗传物质 来研究生命的发生与发展规律来研究生命的发生与发展规律 反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上 反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上 通 通 过对靶基因进行必要的加工和修饰过对靶基因进行必要的加工和修饰 如定点突变如定点突变 基因插入基因插入 缺失缺失 基因置换等 基因置换等 再按组成 再按组成 顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组 让其装配出具有生命活性的个体 让其装配出具有生命活性的个体 研究生物体基 研究生物体基 因组的结构与功能 以及这些修饰可能对生物体的表型 性状有何种影响等方面的内容因组的结构与功能 以及这些修饰可能对生物体的表型 性状有何种影响等方面的内容 与 与 之相关的研究技术称为反向遗传学技术 之相关的研究技术称为反向遗传学技术 RNA病毒的反向遗传学病毒的反向遗传学 是采用病毒的遗传材料是采用病毒的遗传材料 在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病 在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病 毒或类似病毒物质毒或类似病毒物质 能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆 一般是在细菌质粒中含有整个 一般是在细菌质粒中含有整个 病毒基因组的病毒基因组的 cDNA 拷贝拷贝 使得使得 cDNA 本身或从本身或从 cDNA 体外转录所得的体外转录所得的 RNA 具有感染性 具有感染性 RNA 病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列 检测被拯救的人工改造病毒的表 检测被拯救的人工改造病毒的表 型型 可以在体内可以在体内 in vivo 有效地研究病毒基因结构有效地研究病毒基因结构 功能和病毒 功能和病毒 宿主相互作用 自宿主相互作用 自 1978 年 年 第一例第一例 RNA 病毒病毒 Q 噬菌体的成功拯救以来 噬菌体的成功拯救以来 各类各类 RNA 病毒的分子生物学研究取得了长足 病毒的分子生物学研究取得了长足 的进展的进展 这主要归功于各种这主要归功于各种 RNA 病毒反向遗传系统的建立和发展病毒反向遗传系统的建立和发展 该技术的核心是首先构建 该技术的核心是首先构建 RNA 病毒的全长病毒的全长 cDNA 分子 分子 并使之受控于并使之受控于 RNA 聚合酶启动子 聚合酶启动子 通过体外转录过程再次得 通过体外转录过程再次得 到病毒到病毒 RNA 然后将该转录物然后将该转录物 RAN 转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒 转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒 由于这种拯救病毒 由于这种拯救病毒 是来自全长是来自全长 cDNA 分子分子 因此可以在因此可以在 DNA 水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造 然后通 然后通 过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果 从而达到对病毒基因组表达调控机制从而达到对病毒基因组表达调控机制 病 病 毒致病的分子机理等进行研究的目的毒致病的分子机理等进行研究的目的 甚至还可以得到减毒毒株甚至还可以得到减毒毒株 开发新型的疫苗 开发新型的疫苗 目前已有 目前已有 许多许多 RNA 病毒的全长感染性病毒的全长感染性 cDNA 克隆构建成功克隆构建成功 俺就是搞流感病毒的反向遗传的 俺就是搞流感病毒的反向遗传的 而且 而且 现在搞得非常的溜 现在搞得非常的溜 拯救的成功率是拯救的成功率是 90 以上 以上 先贴上我的论文中对此领域的背景介绍 先贴上我的论文中对此领域的背景介绍 The earliest reverse genetics techniques for negative stranded RNA viruses were developed only for influenza A virus in deed Enami et al 1990 Luytjes et al 1989 But for a long time the fundamental research of this virus has been hampered by the lack of the efficient reverse genetics systems The rescue of 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 2 influenza virus entirely from cDNA was finished in 1999 Fordor et al 1999 Neumann et al 1999 Such plasmid driven synthesis of viral RNA and protein allows the recovery of infectious influenza virus without the need of helper virus infection In these reports Influenza virus was regenerated by transfection of eukaryotic cells 293 cell or cos 1 cell with a set of 12 or 17 plasmids encoding and expressing the viral nucleotide and proteins The efficiencies of virus production of 12 plasmid systems were relatively lower than the 17 plasmid systems with which only has 104plaque forming units PFU of influenza virus A WSN 33 per ml of transfected cell supernatant and the later has a virus titers up to 5 107 pfu ml In 2001 Hoffmann et al established eight plasmids systems for influenza virus rescue 2000 In their transfection system viral cDNA is inserted between the human RNA polymerase pol promoter and murine terminator sequences The entire transcription unit is also flanked by an RNA polymerase pol promoterand a polyadenylation poly A site The two transcription units allow the synthesis of negative senses viral RNA and positive sense mRNA from one viral cDNA templates So the less total plasmids in influenza virus rescue were needed longjinxue2002 目前用于流感反向遗传的目前用于流感反向遗传的 8 基因克隆的载体主要有基因克隆的载体主要有 12 和和 8 质粒系统质粒系统 而而 8 质粒系统具 质粒系统具 有非常好的效率有非常好的效率 因为 因为 这一由这一由 hoffmann 改造过的载体改造过的载体 PHW2000 具有转录和翻译的 具有转录和翻译的 双向功能 也就是基因片段克隆到载体上后 转染到细胞中可以进行病毒模板双向功能 也就是基因片段克隆到载体上后 转染到细胞中可以进行病毒模板 RNA 的转录 的转录 和基因蛋白的翻译两个功能 和基因蛋白的翻译两个功能 所以 所以 只要构建编码流感基因的只要构建编码流感基因的 8 个载体就可以满足启动流感 个载体就可以满足启动流感 病毒正常复制圈的所有条件 病毒正常复制圈的所有条件 这比这比 Fordor et al 1999 Neumann et al 1999 等建立的等建立的 12 质粒或者辅助病毒方法高效率和方便质粒或者辅助病毒方法高效率和方便 辅助病毒的病毒拯救方法虽然也高效 辅助病毒的病毒拯救方法虽然也高效 但是需 但是需 要强大的筛选手段要强大的筛选手段 本人就是使用本人就是使用 8 质粒系统 效果很好哦 质粒系统 效果很好哦 反向遗传最大的优点是可以在基因水平上对病毒或者其他生物进行改造 反向遗传最大的优点是可以在基因水平上对病毒或者其他生物进行改造 使之按人类的需 使之按人类的需 求进行求进行 进化 进化 比如流感病毒 比如流感病毒 我们可以在完善路线后 我们可以在完善路线后 对流感病毒的各基因功能进行全面 对流感病毒的各基因功能进行全面 的研究 这是过去的克隆基因出来才能进行功能研究的方法无法比拟的 而且 我们可以对 的研究 这是过去的克隆基因出来才能进行功能研究的方法无法比拟的 而且 我们可以对 强毒进行致弱 国内外已经完成了强毒进行致弱 国内外已经完成了 H5 流感病毒流感病毒 HA 裂解位点减去裂解位点减去 4 个碱性氨基酸 拯救出 个碱性氨基酸 拯救出 改造致弱的改造致弱的 H5 AIV 这是目前进行流感病毒疫苗后选株开发研究的最简捷有效的途径这是目前进行流感病毒疫苗后选株开发研究的最简捷有效的途径 基因功能研究的例子就更多了 比如 基因功能研究的例子就更多了 比如 1997 年香港年香港 H5 流感事件后 研究者发现的流感事件后 研究者发现的 PB2 的的 627 位氨基酸是决定位氨基酸是决定 H5 流感病毒宿主特异性的重要因素 流感病毒宿主特异性的重要因素 可以这么说 可以这么说 目前预防和控制流感病毒等方面的研究主要集中在反向遗传操作的应用上 目前预防和控制流感病毒等方面的研究主要集中在反向遗传操作的应用上 也是热点 国内已经有好几家单位在做了也是热点 国内已经有好几家单位在做了 最突出的可能就是哈尔滨兽医研究所 他们已经 最突出的可能就是哈尔滨兽医研究所 他们已经 获获得了 得了 前述的致弱的前述的致弱的 H5 重组疫苗重组疫苗 据说好象得到了国家批文了 据说好象得到了国家批文了 发财啊 可要狠狠的 发财啊 可要狠狠的 发一笔了 发一笔了 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 3 大概谈谈反向遗传在流感病毒的应用 大概谈谈反向遗传在流感病毒的应用 流感病毒复制的基本要素是流感病毒复制的基本要素是 RNPS 和和 vRNA 最 最 初研究人员通过纯化初研究人员通过纯化 RNPS 蛋白蛋白 在来获得流感病毒 在来获得流感病毒 1989 年 研究人员通过辅助病毒 年 研究人员通过辅助病毒 获得了流感病毒 获得了流感病毒 1999 年 年 Fodor 首次通过首次通过 12 质粒系统拯救出流感病毒 其中质粒系统拯救出流感病毒 其中 8 个含人 个含人 源源 pol I 启动子和丁型肝炎病毒核酶序列调控的转录质粒启动子和丁型肝炎病毒核酶序列调控的转录质粒 transcription plasmid 分别克 分别克 隆出隆出 8 条流感条流感 vRNA 另 另 4 个表达质粒个表达质粒 pGT 表达出表达出 PB1 PB2 PA 和和 NP 蛋白蛋白 2000 年年 Hoffman 通过通过 8 个质粒共转染 个质粒共转染 成功地拯救出流感病毒 成功地拯救出流感病毒 主要方法是构建含有主要方法是构建含有 pol I pol II 双启动子的质粒载体 双启动子的质粒载体 在在 pol I 启动子与终止子间插入启动子与终止子间插入 pol II 启动子和多聚腺苷酸 再将病 启动子和多聚腺苷酸 再将病 毒基因插入该系统毒基因插入该系统 利用细胞酶系统拯救出流感病毒 利用细胞酶系统拯救出流感病毒 因此可以在拯救株上引入多个变异位点因此可以在拯救株上引入多个变异位点 减弱毒株活性 研制出安生性更好的弱毒疫苗 减弱毒株活性 研制出安生性更好的弱毒疫苗 哈兽研研制 的弱毒疫苗是具有人源内部基因的哈兽研研制 的弱毒疫苗是具有人源内部基因的 用 用 H1N1 PR8 株 株 这其实在国外是强 这其实在国外是强 烈反对的 因为大家知道这是危及人类健康 是个生物安全问题了 虽然具体制备的是灭火 烈反对的 因为大家知道这是危及人类健康 是个生物安全问题了 虽然具体制备的是灭火 油苗油苗 但是在病毒扩增的过程难免有泄露病毒危及社会之嫌疑 但是在病毒扩增的过程难免有泄露病毒危及社会之嫌疑 因此 目前 因此 目前 有关专家建议 有关专家建议 用全禽类的基因进行禽流感病毒疫苗后选株的研究开发 用全禽类的基因进行禽流感病毒疫苗后选株的研究开发 单股负链单股负链 RNA 病毒的反向遗传难点在于全长克隆的构建 因为长啊 所以 不能 病毒的反向遗传难点在于全长克隆的构建 因为长啊 所以 不能 也不 也不 可能一次可能一次 PCR 拉出 拉出 比如比如 NDV 是是 15186bp 或 或 15192bp 必须分段进行 必须分段进行 那么那么 很难 很难 找到合适的酶切位点进行拼接找到合适的酶切位点进行拼接 有的时候必须进行长片段 有的时候必须进行长片段 PCR 超过超过 3000bp 这样就很 这样就很 那获得正确的序列克隆 而序列的正确是病毒拯救至关重要的 尤其是引起了氨基酸变化 那获得正确的序列克隆 而序列的正确是病毒拯救至关重要的 尤其是引起了氨基酸变化 的突变是绝对不行的 的突变是绝对不行的 另外另外 单股负链 单股负链 RNA 病毒的反向遗传难点还在于转染关 因为质粒大 提取也难 容易断 病毒的反向遗传难点还在于转染关 因为质粒大 提取也难 容易断 裂 裂 转染的效率 转染的效率 有效进入细胞 也很低有效进入细胞 也很低 但是 工夫是不负苦心人的但是 工夫是不负苦心人的 目前 目前 NDV 的拯救已经有几个报道了 的拯救已经有几个报道了 lasota clone30 和和 C 株等弱株等弱 中强毒的中强毒的 NDV 的拯救成功 的拯救成功 最近还有即将报道的强毒的最近还有即将报道的强毒的 NDV 的针拯救成功 的针拯救成功 相 相 信难关就要攻克 信难关就要攻克 对于较长的单股负链对于较长的单股负链 RNA 病毒通常是常用分断克隆的方式来进行 插入质粒或者全裸 病毒通常是常用分断克隆的方式来进行 插入质粒或者全裸 的的 cDNA 通过电融合的方式转染细胞来获得感染性克隆通过电融合的方式转染细胞来获得感染性克隆 流感病毒的拯救质粒转染通过不是直接转染流感病毒的拯救质粒转染通过不是直接转染MDCK细胞 细胞 而是首先转染而是首先转染293T细胞或细胞或vero 细胞后 再细胞后 再 replicate in MDCK 细胞细胞 哪断话用中文不知应该怎么说为好哪断话用中文不知应该怎么说为好 这主要是利用这主要是利用 293T 细胞或细胞或 vero 细胞自身的酶系统与构建质粒的细胞自身的酶系统与构建质粒的 Pol 启动子作用强的特点 启动子作用强的特点 利于流感病 利于流感病 毒的拯救毒的拯救 就现在的资料来看正链随同负链相比 就现在的资料来看正链随同负链相比 显的要简单些 显的要简单些 因为不存在要形成因为不存在要形成 RNPS 蛋白这 蛋白这 一关一关 但对于全长感染性克隆特别是如冠状病毒的拯救就显特难度较大 毕竟它是基因组最 但对于全长感染性克隆特别是如冠状病毒的拯救就显特难度较大 毕竟它是基因组最 大的大的 RNA 病毒病毒 大多也是分段扩增后先亚克隆 大多也是分段扩增后先亚克隆 最后在逐段连接 但有的病毒特别是冠状 最后在逐段连接 但有的病毒特别是冠状 病毒的病毒的 ORF1a ORF1b 区存在有对细菌有毒的一段基因 区存在有对细菌有毒的一段基因 所以要想让全长感染性克隆分子于 所以要想让全长感染性克隆分子于 细菌中增殖是不行的 目前解决的办法是先做两段克隆 而后再酶切后连接再转染 我也还 细菌中增殖是不行的 目前解决的办法是先做两段克隆 而后再酶切后连接再转染 我也还 有好多还没弄明白 希望能有站友不惜赐教 特别是关于冠状病毒的拯救 有好多还没弄明白 希望能有站友不惜赐教 特别是关于冠状病毒的拯救 如引物设计的关 如引物设计的关 键等键等 COS 1 293T 细胞或细胞或 vero 细胞是哺乳动物细胞 细胞是哺乳动物细胞 不管是不管是 12 还是还是 8 质粒上的启动子 质粒上的启动子 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 4 都是人源的 也就是必须早哺乳类细胞才能提供相关的酶系统来启动转录和翻译 所以都是人源的 也就是必须早哺乳类细胞才能提供相关的酶系统来启动转录和翻译 所以 转 转 染的细胞必须用上述三种细胞染的细胞必须用上述三种细胞 而而 MDCK 是狗肾上皮细胞 是狗肾上皮细胞 是流感病毒比较敏感的细胞系 是流感病毒比较敏感的细胞系 虽然不能提供启动载体基因转录和翻译 虽然不能提供启动载体基因转录和翻译 但是 但是 一旦病毒拯救出来了 一旦病毒拯救出来了 就可以在其良好繁殖 就可以在其良好繁殖 因此因此 流感病毒的拯救一般才用 流感病毒的拯救一般才用 MDCK 与哺乳类细胞共培养的方法进行转染拯救 二者互 与哺乳类细胞共培养的方法进行转染拯救 二者互 补优劣 能大大提高转染效率补优劣 能大大提高转染效率 前面我说了 哈兽研研制开发的弱毒疫苗是具有人源内部基因的疫苗株 包括华南农业大学 前面我说了 哈兽研研制开发的弱毒疫苗是具有人源内部基因的疫苗株 包括华南农业大学 几位专家在内的有关人士就曾极力反对此类疫苗的生产应用 几位专家在内的有关人士就曾极力反对此类疫苗的生产应用 但是 根据可靠消息 已经通 但是 根据可靠消息 已经通 过了鉴定 已经开始 创造经济效益了 过了鉴定 已经开始 创造经济效益了 呵呵 呵呵 是祸是福留后人去评价了是祸是福留后人去评价了 但作为流感病毒目前最有力 但作为流感病毒目前最有力 的研究工具或方法的研究工具或方法 反向遗传肯定会义无返顾的继续向前发展 反向遗传肯定会义无返顾的继续向前发展 的的 也还有许多为知的领域需要去探索 最为紧迫的是 也还有许多为知的领域需要去探索 最为紧迫的是 H5 亚型禽流亚型禽流感会不会成为下一个 感会不会成为下一个 危害人类健康的烈性传染病 危害人类健康的烈性传染病 其宿主的改变机制是什么 其宿主的改变机制是什么 我们如何进行防治 我们如何进行防治 任重而道远啊 任重而道远啊 genediagnosis wrote 我想请教两个问题我想请教两个问题 请不吝赐教 请不吝赐教 1 正链正链 RNA 病毒拯救和负链的区别在哪里病毒拯救和负链的区别在哪里 该问题可能源于本人对不同该问题可能源于本人对不同 RNA 病毒的复制机制不太了解 病毒的复制机制不太了解 2 比较长比较长 RNA 的病毒需要分段克隆 的病毒需要分段克隆 那么它们是如何被连接起来的 如果片 那么它们是如何被连接起来的 如果片 段大的话 用酶切的可能性往往比较难 如果是两段 用同源重组还可能 如 段大的话 用酶切的可能性往往比较难 如果是两段 用同源重组还可能 如 果的多段怎么办 果的多段怎么办 1 正链正链 RNA 病毒自身的病毒病毒自身的病毒 RNA 就具有翻译能力 就具有翻译能力 即能直接利用细胞酶系统翻译成相应 即能直接利用细胞酶系统翻译成相应 的蛋白质 而负链的蛋白质 而负链 RNA 病毒需要反转录为病毒需要反转录为 cDNA 相当于相当于 mRNA 即正链 即正链 RNA 才具有翻 才具有翻 译能力 译能力 在病毒拯救过程中 病毒复制的要素包括在病毒拯救过程中 病毒复制的要素包括 vRNA 和相应的和相应的 virus protein 再利用转染 再利用转染 细胞酶系统获得需要的病毒株细胞酶系统获得需要的病毒株 正链病毒基因组即是正链病毒基因组即是 mRNA 并具有感染性 并具有感染性 因此简单地将含有病毒基因组的质粒或从 因此简单地将含有病毒基因组的质粒或从 质粒体外转录来的质粒体外转录来的 RNA 转染敏感细胞 转染敏感细胞 便可获得完整的有感染性的病毒 便可获得完整的有感染性的病毒 而负链而负链 RNA 病 病 毒裸露的基因组毒裸露的基因组 RNA 或由或由cDNA 克隆转录的克隆转录的RNA本身没有感染性本身没有感染性 因为负链因为负链 RNA 病毒的 病毒的 复制需要病毒核蛋白和聚合酶复制需要病毒核蛋白和聚合酶 才能表达和包装出活病毒 才能表达和包装出活病毒 2 至于较长的至于较长的 RNA 的全长克隆 其基本策略是利用分段克隆的方式 利用病毒基因自身的 的全长克隆 其基本策略是利用分段克隆的方式 利用病毒基因自身的 酶切位点 必要是可以引入酶切位点 再切割 链接 完成酶切位点 必要是可以引入酶切位点 再切割 链接 完成 NRA 的全长克隆 的全长克隆 至于多段 我想还是可以采用类似的策略至于多段 我想还是可以采用类似的策略 部分拼接后再拼接 部分拼接后再拼接 因为以前看过流感病毒相关的资料 了解一些这方面的知识 因为以前看过流感病毒相关的资料 了解一些这方面的知识 也来谈一下这方面的启发也来谈一下这方面的启发 在 在 我的记忆中 我曾经也分析过流感病毒的基因组 我的记忆中 我曾经也分析过流感病毒的基因组 也看过也看过 Neumann 和和 Erich Hoffmann 的文章 其中构建的的文章 其中构建的 pHW11 载体中使用的酶切位点是载体中使用的酶切位点是 BsmBI 然而我通过序列的酶切位 然而我通过序列的酶切位 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 5 点分析发现 点分析发现 在在流感病毒的大多数毒株中的部分基因都含有该酶切位点 流感病毒的大多数毒株中的部分基因都含有该酶切位点 但在但在 Neumann 和和 Erich Hoffmann 的文章中没有提到如何克服该酶切位点在构建感染性克隆中的解决方法 的文章中没有提到如何克服该酶切位点在构建感染性克隆中的解决方法 不知各位战友在 不知各位战友在 构建感染性克隆的过程中是如何解决该问题的构建感染性克隆的过程中是如何解决该问题的 还请各位提出宝贵的经验 还请各位提出宝贵的经验 在黄病毒属病毒的感染性克隆中也有一些困难 在黄病毒属病毒的感染性克隆中也有一些困难 关键性问题就是如何成功构建感染 关键性问题就是如何成功构建感染 性的病 性的病 毒 毒 特别其特别其 5 和和 3 端的精确序列 对于构建的病毒是否具有感染性十分重要 我知道的 端的精确序列 对于构建的病毒是否具有感染性十分重要 我知道的 武汉大学的张楚愉教授他们实验室现在已经成功的构建的猪瘟病毒的感染性克隆 并且主要 武汉大学的张楚愉教授他们实验室现在已经成功的构建的猪瘟病毒的感染性克隆 并且主要 想研究猪瘟兔化弱毒苗与强毒想研究猪瘟兔化弱毒苗与强毒苗的差别 苗的差别 以了解猪瘟兔化弱毒苗的致弱机制以了解猪瘟兔化弱毒苗的致弱机制 好象北京大学 好象北京大学 的一位教授也在进行该方面的研究 的一位教授也在进行该方面的研究 对于 对于 主任主任 yinhp01 的问题 本人有如下解决方案的问题 本人有如下解决方案 1 首先是替代酶的使用 也就是可以用 首先是替代酶的使用 也就是可以用 Bsa I 或者或者 Acr I 等替代等替代 BsmBI 2 可以进行突变去掉基因组中的 可以进行突变去掉基因组中的 BsmBI 酶位点酶位点 3 如果片段中只有一个如果片段中只有一个 BsmBI 位点 位点 而且位置相对适中而且位置相对适中 切后片段不小于 切后片段不小于 200bp 可以 可以 直接酶切回收纯化后进行直接酶切回收纯化后进行 3 分子连接分子连接 4 5 和 和 3 端的的正确序列当然是要做 端的的正确序列当然是要做 RACE 了 了 DNA 病毒和病毒和 RNA 病毒感染性克隆构建的策略是不同的 病毒感染性克隆构建的策略是不同的 对于对于 DNA 病毒 病毒 可以可以 PCR 扩 扩 增全长的序列 装入适当的载体中 获得感染性克隆 比如鸡传染性贫血病毒 增全长的序列 装入适当的载体中 获得感染性克隆 比如鸡传染性贫血病毒 CAV 的双 的双 DNA 感染性克隆 刘岳龙 感染性克隆 刘岳龙 MDV 的的 BAC 系统系统 杆状病毒 杆状病毒 DNA 整合进入整合进入 BAC 系统形成系统形成 BAC TO BAC 而对于 而对于 RNA 病毒而言 构建全长病毒而言 构建全长 cDNA 是获得感染性克隆的关键 是获得感染性克隆的关键 虽然非全长虽然非全长 cDNA 序列也可以得到感染性转录物 但大多数序列也可以得到感染性转录物 但大多数 RNA 病毒感染性克隆的获 病毒感染性克隆的获 得仍需要进行全长得仍需要进行全长 cDNA 的构建 的构建 基因组较小的基因组较小的 RNA 病毒容易获得全长病毒容易获得全长 cDNA 序列 序列 在体 在体 外也容易获得感染性转录物 外也容易获得感染性转录物 但是对于基因组较大的但是对于基因组较大的 RNA 病毒 病毒 这一过程就变的比较困难 这一过程就变的比较困难 1 是难以获得真实的 是难以获得真实的 cDNA 序列 序列 因为随着因为随着 RNA 序列的延长 序列的延长 RT PCR 的保真性也成比 的保真性也成比 例的下降 例的下降 而而 RNA 病毒的准种特性更加剧了这一困难 病毒的准种特性更加剧了这一困难 现在有高保真反转录酶和现在有高保真反转录酶和 DNA 聚合 聚合 酶 酶 极大地降低了极大地降低了 RT PCR 过程中可能出现的差错率过程中可能出现的差错率 2 由于人们对病毒基因组知识仍然存在局限性由于人们对病毒基因组知识仍然存在局限性 比如至今没有搞明白为什么一些毒力或不 比如至今没有搞明白为什么一些毒力或不 同区域的毒株基因组序列会有一些显著性差异 同区域的毒株基因组序列会有一些显著性差异 缺失或增加一些关键的序列缺失或增加一些关键的序列 比如鹅源比如鹅源 NDV 多多 6bp PCV 2 分为两种长度的基因组 之间仅差分为两种长度的基因组 之间仅差 1bp 另外 另外 长长 RNA 序列更有可能含有至今没有弄明白的毒性序列序列更有可能含有至今没有弄明白的毒性序列 这将使质粒中的 这将使质粒中的 cDNA 序列更加不稳定序列更加不稳定 宿主菌难以适应具有毒性序列的外源基因 宿主菌难以适应具有毒性序列的外源基因 而且细菌具有主动选择特定病 而且细菌具有主动选择特定病 毒序列的能力 因此所克隆到的序列不具有随机性毒序列的能力 因此所克隆到的序列不具有随机性 不能代表大多数的 不能代表大多数的 RNA 准种序列准种序列 为 为 了避免毒性序列对宿主菌的影响 可以先将病毒 了避免毒性序列对宿主菌的影响 可以先将病毒 如黄病毒 的如黄病毒 的 RNA 序列分成若干段段分 序列分成若干段段分 别克隆到载体上别克隆到载体上 在进行转录时再将其连接成全长在进行转录时再将其连接成全长 cDNA 序列 序列 这样毒性序列在细菌中的传 这样毒性序列在细菌中的传 代就得以避免代就得以避免 3 难以找到合适的能够容纳较大外源基因的载体难以找到合适的能够容纳较大外源基因的载体 所以目前国内大多数载体是借助于国外 所以目前国内大多数载体是借助于国外 实验室的 自行构建需要一定的时间 如目前国外在研究实验室的 自行构建需要一定的时间 如目前国外在研究 MDV 感染性感染性 DNA 时常使用细菌 时常使用细菌 人工染色体人工染色体 BAC 克隆大片段克隆大片段 DNA 或或 cDNA 150kb 这一载体基于这一载体基于 1997 年在年在 sci 上上 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 6 发表构建的系统 发表构建的系统 达到初步成熟 经过了达到初步成熟 经过了 3 年的时间 年的时间 谈谈一些基因组序列中的特点和难点谈谈一些基因组序列中的特点和难点 小 小 RNA 病毒属的心病毒和口疮病毒感染性克隆难以构建 病毒属的心病毒和口疮病毒感染性克隆难以构建 其原因在于这些病毒的基因 其原因在于这些病毒的基因 组中含有特殊的组中含有特殊的 poly C 序列序列 该结构对病毒的感染性有一定的影响 该结构对病毒的感染性有一定的影响 通过常规通过常规 RT PCR 方 方 法难以得到该序列 法难以得到该序列 还有些还有些 RNA 病毒具有病毒具有 poly A 尾巴尾巴 该结构不仅具有稳定该结构不仅具有稳定 RNA 基因组 基因组 结构的功能 而且对维持其感染性也有一定的作用结构的功能 而且对维持其感染性也有一定的作用 不同的病毒对 不同的病毒对 poly A 的长度有不同的 的长度有不同的 要求要求 但基本上都要求 但基本上都要求 A 残基的数目有一定的阈值残基的数目有一定的阈值 当低于阈值时转录物 当低于阈值时转录物 RNA 的稳定性和 的稳定性和 感染性都将受到影响 所以构建全长感染性都将受到影响 所以构建全长 cDNA 时要确保得到合理长度的时要确保得到合理长度的 poly A 转录物异质性的影响 转录物异质性的影响 这是由于在体外转录过程中并非得到的 这是由于在体外转录过程中并非得到的 RNA 转录物都是全长的转录物都是全长的 而是由各种长度 而是由各种长度 的的 RNAs 构成的一个类群构成的一个类群 该转录类群在宿主细胞中进行复制时该转录类群在宿主细胞中进行复制时 不完整的没有复制能力的 不完整的没有复制能力的 转录物与完整转录物会竞相与宿主发生作用 从而影响转录物的感染性 转录物与完整转录物会竞相与宿主发生作用 从而影响转录物的感染性 基因突变对转录物感染性的影响 基因突变对转录物感染性的影响 在构建全长 在构建全长 cDNA 以及产生转录物以及产生转录物 RNA 的过程中 的过程中 由于由于 DNA 聚合酶和聚合酶和 RNA 聚合 聚合 酶的不忠实性都有可能导致核苷酸的错配酶的不忠实性都有可能导致核苷酸的错配 基因突变的发生就难以避免 而且基因组的序列 基因突变的发生就难以避免 而且基因组的序列 越长越长 发生点突变的几率越大 发生点突变的几率越大 这些点突变有可能对转录物的感染性产生一定影响 已有的 这些点突变有可能对转录物的感染性产生一定影响 已有的 资料表明 这种影响有可能是负向的 即转录物的感染性降低或丧失 也有可能是正向的即 资料表明 这种影响有可能是负向的 即转录物的感染性降低或丧失 也有可能是正向的即 转录物的感染性增强 这种情况很少 转录物的感染性增强 这种情况很少 非病毒核苷酸的影响 非病毒核苷酸的影响 比较一致的观点是 比较一致的观点是 5 端的非病毒核苷酸对转录物感染性的影响较大 可使转录物 端的非病毒核苷酸对转录物感染性的影响较大 可使转录物 的感染性降低甚至丧失 的感染性降低甚至丧失 但有研究也表明 但有研究也表明 当在当在 cDNA 的的 5 端增加一个非病毒的核苷酸端增加一个非病毒的核苷酸 如如 G 时有可能增加转录物的感染性 时有可能增加转录物的感染性 与植物病毒相比 与植物病毒相比 动物病毒转录物的感染性受动物病毒转录物的感染性受 5 端非病 端非病 毒核苷酸的影响较小 已经构建成功的几种动物病毒的感染性克隆毒核苷酸的影响较小 已经构建成功的几种动物病毒的感染性克隆 5 端存在一定的非病毒 端存在一定的非病毒 核苷酸时仍具有感染性 核苷酸时仍具有感染性 3 端的非病毒核苷酸序列少于 端的非病毒核苷酸序列少于 7 个核苷酸时对转录物的感染性影 个核苷酸时对转录物的感染性影 响较小 如果再长就有可能导致转录物感染性的降低或丧失 响较小 如果再长就有可能导致转录物感染性的降低或丧失 Sarnow 等研究了等研究了 3 端非病 端非病 毒核苷酸序列对脊髓灰质炎病毒转录物感染性的影响 毒核苷酸序列对脊髓灰质炎病毒转录物感染性的影响 其研究结果表明在病毒基因组其研究结果表明在病毒基因组 poly A 尾下游存在尾下游存在 4 个多余的核苷酸时个多余的核苷酸时 转录物的感染性并不受影响转录物的感染性并不受影响 但是当存在但是当存在 17 个个 C 碱基时 碱基时 可以引起转录物感染性的下降 可以引起转录物感染性的下降 但也有相反的结论 但也有相反的结论 Dzianott 等的研究表明等的研究表明 BMV 转录物的转录物的 3 端含有 端含有 19 个非病毒核苷酸时其感染性比含有个非病毒核苷酸时其感染性比含有 6 7 个非病毒核苷酸时的感染性要高个非病毒核苷酸时的感染性要高 其 其 原因可能是较长的冗余序列在体内可能会更好的保护转录物对抗核酸酶的消化作用 原因可能是较长的冗余序列在体内可能会更好的保护转录物对抗核酸酶的消化作用 帽子结构的影响 帽子结构的影响 有些 有些 RNA 病毒基因组病毒基因组 5 端具有帽子结构 如果在人工转录物 端具有帽子结构 如果在人工转录物 RNAs 的的 5 端加 端加 上该结构 将能增加其稳定性上该结构 将能增加其稳定性 同时也保证了转录物感染性 同时也保证了转录物感染性 如果缺少该结构 转录物就可 如果缺少该结构 转录物就可 能没有感染性或感染性很低 能没有感染性或感染性很低 例如在构建例如在构建 PRRSV 的感染性克隆时 由于在体外转录过程中 的感染性克隆时 由于在体外转录过程中 添加了帽子结构类似物 体外转录物就获得了较好的感染性 添加了帽子结构类似物 体外转录物就获得了较好的感染性 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 7 目前 有两种方法可以克服特殊的目前 有两种方法可以克服特殊的 poly C 序列序列 1 是用人工合成的方法模拟 是用人工合成的方法模拟 poly C 序列 将其插入到序列 将其插入到 cDNA 序列中序列中 2 是利用末端转移酶在病毒基因组 是利用末端转移酶在病毒基因组 S 片段的片段的 3 端加上 端加上 poly C 结构结构 通过以上方法通过以上方法 已成功得到了脑心肌炎病毒 已成功得到了脑心肌炎病毒 口蹄疫病毒等的感染性克隆 口蹄疫病毒等的感染性克隆 感染性转录物的产生 有两种方法可以得到感染性克隆 感染性转录物的产生 有两种方法可以得到感染性克隆 体内转录 体内转录 即机械导入含有病毒即机械导入含有病毒 cDNA 的表达质粒 的表达质粒 使之在体内进行转录与复制得到具有感染性的 使之在体内进行转录与复制得到具有感染性的 转录物 转录物 关于体内生成感染性关于体内生成感染性 RNAs 的机理目前尚不清楚 的机理目前尚不清楚 推测是推测是 cDNA 运输到细胞核 运输到细胞核 在 在 核内被核内被 DNA 依赖性依赖性 RNA 聚合酶转录成聚合酶转录成 RNAs 这一途径得到的 这一途径得到的 RNA 感染性克隆具有以下 感染性克隆具有以下 优点优点 1 所获得的感染性所获得的感染性 RNA 比较稳定 不易降解 且可以在体内大量复制 比较稳定 不易降解 且可以在体内大量复制 2 避免了体外转录过程 避免了体外转录过程 对那些在体外难以获得高产量感染性对那些在体外难以获得高产量感染性 RNA 的病毒来说是一种理想 的病毒来说是一种理想 的方法 的方法 3 不需要价格昂贵的试剂不需要价格昂贵的试剂 如帽子结构类似物 体外转录系统等即可得到感染性 如帽子结构类似物 体外转录系统等即可得到感染性 RNAs 4 病毒基因组的表达很大程度上不再依赖于病毒的复制过程 病毒基因组的表达很大程度上不再依赖于病毒的复制过程 这一点对研究那些不能在细胞 这一点对研究那些不能在细胞 复制的突变体病毒复制的突变体病毒 RNAs 所表达的蛋白质及其定位很有用 所表达的蛋白质及其定位很有用 体外转录 体外转录 选择合适的启动子十分重要 因为这将直接影响体外转录物的产量 目前常用的启动子 选择合适的启动子十分重要 因为这将直接影响体外转录物的产量 目前常用的启动子 主要有主要有 T7 启动子和启动子和 SP6 启动子 有三种方法可以将启动子与病毒启动子 有三种方法可以将启动子与病毒 cDNA 序列嵌合在一起序列嵌合在一起 1 使用通用转录载体 使用通用转录载体 在距离启动子序列最近的地方设计限制性酶切位点以插入病毒在距离启动子序列最近的地方设计限制性酶切位点以插入病毒 cDNA 序列序列 这类载体有 这类载体有 Ppml Pm Phst70 SP6 pCa35J 35S 等 等 2 将外源将外源 cDNA 序列克隆到含有启动子的载体上以后 序列克隆到含有启动子的载体上以后 通过一定的方法缺失启动子与病毒通过一定的方法缺失启动子与病毒 cDNA 之间的冗余序列 之间的冗余序列 3 在合成病毒在合成病毒 cDNA 的过程中通过的过程中通过 PCR 反应在病毒反应在病毒 cDNA 序列的序列的 5 端引人合适的启动子 端引人合适的启动子 序列序列 然后将它们一起克隆到表达载体中 然后将它们一起克隆到表达载体中 体外转录还需要解决能否正确终止转录的问题体外转录还需要解决能否正确终止转录的问题 以免转录物含有非病毒的核苷酸序列 以免转录物含有非病毒的核苷酸序列 影响转录物的感染性 对此 影响转录物的感染性 对此 可在全长可在全长 cDNA 的的 3 末端加上一个特异的限制性酶切位点 末端加上一个特异的限制性酶切位点 在体外转录时先将重组质粒线性化 在体外转录时先将重组质粒线性化 再进行转录过程 再进行转录过程 可使转录正确终止 这在上面已有详 可使转录正确终止 这在上面已有详 细的说明和实例 细的说明和实例 感染性克隆的产生与鉴定 常规的病毒鉴定方法 感染性克隆的产生与鉴定 常规的病毒鉴定方法 生物秀实验频道 生物秀实验频道 努力做您的实验助手努力做您的实验助手 中国生物科学论坛 中国生物科学论坛 生物秀论坛 生物秀论坛 8 有研究表明 有研究表明 直接导入体内的转录物直接导入体内的转录物 RNA 有感染性 但目前多数研究还是采用转染敏 有感染性 但目前多数研究还是采用转染敏 感细胞系来确定感细胞系来确定 RNA 转录物的感染性 转录物的感染性 转染转染 RNA 的方法主要有的方法主要有 DEAE 或脂质体转染法和电激法等或脂质体转染法和电激法等 转染细胞后转染细胞后 可以通过细胞病变可以通过细胞病变 蚀斑蚀斑 免疫染色斑以及其他一些特异性指标来判断转录 免疫染色斑以及其他一些特异性指标来判断转录 物的感染性物的感染性 为要避免假阳性的产生为要避免假阳性的产生 在转染时还要设阳性和阴性对照在转染时还要设阳性和阴性对照 并在转录前要用并在转录前要用 DNA 和和 RNA 酶处理样品 酶处理样品 初步检测以后有必要进一步分析研究感染性克隆的一些生物学特 初步检测以后有必要进一步分析研究感染性克隆的一些生物学特 性 性 如在宿主细胞中的表达 如在宿主细胞中的表达 复制情况 复制情况 对实验动物的致病性对实验动物的致病性 宿主谱的变化等 在进行这 宿主谱的变化等 在进行这 些研究的同时要与其祖代毒性做比较分析些研究的同时要与其祖代毒性做比较分析 正链正链 RNA 病毒感染性克隆的构建中获得基因组全长病毒感染性克隆的构建中获得基因组全长 cDNA 克隆是构建感染性分子克隆的 克隆是构建感染性分子克隆的 关键一步关键一步 但全长但全长 cDNA 克隆并不一定具有感染性 克隆并不一定具有感染性 在构建基因组全长在构建基因组全长 cDNA 克隆时克隆时 cDNA 的合成过程 克隆载体的性质和载体中插入位点的旁侧 的合成过程 克隆载体的性质和载体中插入位点的旁侧 序列都会对得到的分子克隆的感染性产生重要影响序列都会对得到的分子克隆的感染性产生重要影响 由于有些病毒的 由于有些病毒的 RNA 形成了比较牢固 形成了比较牢固 的二级结构的二级结构 难以获得基因组全长难以获得基因组全长 cDNA 但现在已获得了许多病毒基因组全长但现在已获得了许多病毒基因组全长 cDNA 如口 如口 蹄疫病毒蹄疫病毒 FMDV 猪传染性胃肠炎病毒猪传染性胃肠炎病毒 TGEV 烟草花叶病毒烟草花叶病毒 TMV 和芜菁黄色花叶 和芜菁黄色花叶 病毒病毒 TYMV 等 等 如果病毒基因组如果病毒基因组 RNA 太长太长 在构建感染性在构建感染性 cDNA 或体外转录本时会遇到这样一些问题或体外转录本时会遇到这样一些问题 1 通过通过 RT PCR 合成合成 cDNA 时时 易出现错配易出现错配 2 长的长的 RNA 序列更容易含有毒性序列序列更容易含有毒性序列 造成造成 cDNA 在质粒中不稳定在质粒中不稳定 3 缺少恰当的载体 缺少恰当的载体 使用高保真反转录酶和使用高保真反转录酶和 DNA 聚合酶使聚合酶使 RT PCR 的错配率大大降低的错配率大大降低 但即便如此但即便如此 仍难获得 仍难获得 真实无误的基因组真实无误的基因组cDNA 因为有些因为有些RT PCR 产物来源于不完整的和缺陷型的产物来源于不完整的和缺陷型的RNA cDNA 序列中的毒性序列是克隆病毒序列中的毒性序列是克隆病毒 cDNA 或或 DNA 时遇到的棘手问题时遇到的棘手问题 原因可能是细菌不太适应 原因可能是细菌不太适应 这一外源序列 细菌具有对病毒特定序列进行加工的能力这一外源序列 细菌具有对病毒特定序列进行加工的能力 加工后序列有所改变 加工后序列有所改变 很早已