流式细胞仪基本原理及应用.ppt

流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用 李柏青蚌埠医学院免疫学教研室 2 流式细胞仪和流式细胞术 概述流式细胞仪的工作原理和测量参数流式细胞仪在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用血液病检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用 流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用 3 一 流式细胞仪和流式细胞术的基本概念 流式细胞仪 FlowCytometer FCM 是集合光电子物理 光电测量技术 液流技术 计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器 4 一 流式细胞仪和流式细胞术的基本概念 流式细胞术 FlowCytometry FCM 是应用流式细胞仪 对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数 快速测量和定量分析 以及分选的技术 5 一 流式细胞仪和流式细胞术 特点 多参数测量和分析 散射光和荧光 快速测量和分析每秒可达1000 10000个细胞分选纯度可达99 以上 获取的数据分析结果更具有统计学意义 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中 此外 也可测量微生物等生物颗粒 或者工合成微球非生物颗粒 6 台式机 FACSCalibur 双激光488nm635nm四荧光参数分选 浓缩系统 7 8 大型机 FACSVantageSE 科研型八荧光参数高速分选多路分选 9 流式细胞仪与荧光显微镜比较 流式细胞仪荧光显微镜 流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可揭示细胞内部结构信息 10 二 流式细胞仪的工作原理和测量参数 光路系统 激光光源 光路系统 透镜 滤光片 电子系统 光电倍增管 PMT 补偿电路液流系统 鞘液系统 样品流动系统数据系统 计算机 数据测量和分析软件 细胞分选系统 一 流式细胞仪的结构 11 流式细胞仪 光路系统 激光 Laser 是一种相干光源 它能提供单一波长 单一方向 同步的稳定光照激光波长 488nm 635nm光收集系统是由若干组透镜 滤波片 小孔组成 将产生的光信号引导至检测器 12 光路系统 13 InjectorTip 14 InjectorTip Fluorescence signals Focusedlaser beam Sheathfluid 15 流式细胞仪 光学系统 激发光源与荧光标记物 16 光学检测信号 17 流式细胞仪的光学系统FACSCalibur 18 流式细胞仪 液流系统 19 液流系统 鞘液系统 样品流动系统 20 流式细胞仪的电子系统 信号检测和分析当细胞携带荧光素 通过激光照射区 受到激发产生不同波长的 代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收 转变为电脉冲信号 电脉冲信号经A D转换成数字信号数字信号传送到计算机 进行储存 作图和统计分析 21 数据系统 22 二 流式细胞仪可检测的细胞参数 细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量 细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度 二 流式细胞仪的工作原理和测量参数 23 二 流式细胞仪可检测的细胞的参数 散射光信号 前向角散射光 FSC ForwardScatter 入射光的前向 5 散射光信号 可反映 细胞相对大小及其表面积侧向角散射光 SSC SideScatter 入射光90 角的散射光信号 可反映 细胞颗粒性程度 胞内成分和构造和表面结构的复杂性 24 散射光信号 前向角散射光 FSC 25 散射光信号 侧向角散射光 SSC 26 流式细胞的基本信息 形态 27 28 外周全血细胞 红细胞溶解后 以散射光表示的双参数点图 29 外周全血细胞 红细胞溶解后 以散射光表示的双参数点图 中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 30 二 流式细胞检测细胞参数 特征信息 荧光 Fluorescence 信号 荧光素吸收激光 激发光波长 能量荧光素将吸收能量释放 转换为释放较入射光波长更长的光量子 发射光波长 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体 荧光抗体与细胞抗原结合越多 产生荧光信号越强荧光素与细胞核酸结合 荧光强度反映核酸含量 31 二 流式细胞检测细胞参数 特征信息 荧光 Fluorescence 信号 Forwardscatter FSC Sidescatter SSC FL1 第一荧光 FITC 异硫氰酸荧光素 FL2 第二荧光 PE 藻红蛋白 FL3 第三荧光 PerCP PeCy5等PL4 第四荧光 APC 藻青蛋白 32 荧光信号 33 34 荧光信号 双色直接染色 35 三 流式细胞仪分析数据常见图形 二维 点陈图 DotPlot 适用于 双参数分析 36 三 流式细胞仪分析数据常见图形 直方图 HistogramPlot 适用于 单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化 37 流式细胞术检测细胞的荧光标记方法 单标 一种单抗 FL1 FSC SSC 三参数 双标 两种单抗 FL1 FL1 FSC SSC 四参数 三标 三种单抗 FL1 FL2 FL3 FSC SSC 五参数 四标 四种荧光标记抗体 四种单抗 FL1 FL2 FL3 FL4 FSC SSC 六参数 38 淋巴细胞亚群分析 细胞凋亡 肿瘤学 移植免疫 三流式细胞仪在临床检测和科研中的应用 血小板 其它 39 淋巴细胞亚群分析 40 41 42 43 T淋巴细胞 淋巴细胞亚群检测 Tcells Tsubsets NKcells Bcells 44 淋巴细胞亚群 45 淋巴细胞亚群 46 淋巴细胞亚群与疾病 47 淋巴细胞亚群检测意义 疾病机理研究 疾病辅助诊断 移植后免疫检测 治疗方案的确定及疗效评价 CD25高于正常值5 10 表明即将或已发生排斥CD4 CD8比值下降提示并发凶险感染 0 2时 必须停用免疫抑制剂CD2 HLA DR 增加5 10 且不伴有CD25的增加 提示巨细胞病毒感染 慢性疲劳 感染后综合征 纤维肌痛 类风湿性关节炎 过敏等 疾病预防 48 淋巴细胞亚群检测意义 鉴别活动期和非活动期SLE 49 HIVANDAIDS 50 Th1 Th2细胞 51 Th1 Th2细胞 Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应 巨噬细胞活化 局部炎症刺激来源 病毒 某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖 分泌多克隆免疫球蛋白 促进I型变态反应 过敏反应 刺激来源 多细胞寄生虫 过敏原 52 Th1 Th2细胞 PMA Ionomycin刺激4 6hr 53 流式细胞仪检测胞内细胞因子 新鲜分离PBMC加PMA Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL 4和IFN g 检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子 操作和分析方法 54 四色标记胞内因子FCM检测 55 Th1 Th2失衡相关疾病 嗜酸性细胞增多和IgE升高相关疾病Ommen sSyndrome Ommen s综合征 HyperosinophilicSyndrome 高嗜曙红细胞综合征 Kimura sDisease Kimura s疾病 Well sSyndrome Well s综合征 传染病病毒性疾病人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病 AIDS 麻疹呼吸道合胞体病毒感染慢性活动性乙型肝炎病毒感染分枝杆菌和其它细菌感染麻疯病 肺结核鸟结核分枝杆菌复合感染滑膜炎反应性关节炎淋病和梅毒 56 Th1 Th2失衡相关疾病 寄生虫病原寄生虫感染 皮肤和内脏利什曼病蠕虫病 丝虫病和血吸虫病真菌性疾病过敏性支气管肺霉菌病念珠菌病隐球菌病类球孢子菌病球孢子菌病组织胞浆菌病恶性肿瘤皮肤基底细胞和鳞细胞癌SezarySyndrome Sezary综合征 淋巴瘤EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤何杰金氏淋巴瘤大细胞退行性 CD30 淋巴瘤多发性骨髓瘤和Castleman s综合征卡氏肉瘤 57 Th1 Th2失衡相关疾病 变应性疾病皮肤性哮喘变应性哮喘春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病巨细胞 暂时性的 动脉炎系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性甲状腺疾病类肉瘤病银屑病 牛皮癣 IgA肾病多发性硬化 58 Th1 Th2细胞检测意义 疾病治疗 发病机制研究 使用Th1和Th2相关的细胞因子IFN 治疗麻疯病 用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体抗IL 4抗体治疗真菌和寄生虫感染 使用调节Th2 Th2细胞因子平衡的药物 萨力多胺 Thaliodomide 治疗巨细胞动脉炎 疾病治疗监测 59 60 肿瘤发生发展 61 0 200 400 600 800 1000 PI荧光强度 DNA含量 DNA含量分析 2N 4N Counts G0 G1 G2 M S 62 DNA含量分析 70 人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变 1 RossJS DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology NewYork Igaku Shoin 1996 47 60 DNA倍体和S期比例 指导治疗 2 卵巢癌 乳腺癌 结肠癌 子宫内膜癌 原发部位不明的癌症 早期 I II期 DNA倍体和DNA指数 预后长期和无病生存期 2 卵巢癌 晚期 2 TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry HCFAWebsite 1999 63 P53 Bcl 2 64 P53 乳腺癌 与病理学分级有关 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关 大肠肿瘤 早期发现大肠癌 胃癌 与预后相关 肝细胞癌 与组织分级 肿瘤预后 转移及肿瘤大小密切相关 65 Bcl 2 Bcl 2在正常组织中的表达 造血系统细胞 淋巴 单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮 子宫内膜等干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞 肠上皮寿命长的分裂细胞 神经元胚胎组织 Bcl 2在肿瘤组织中的表达 肾脏肿瘤 肾癌 肾盂乳头瘤 Wilms瘤 肾嗜酸细胞瘤前列腺癌B细胞性淋巴瘤乳腺癌 43 甲状腺癌 66 nm23 nm23与多种肿瘤的转移及预后相关 肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤 67 CD44 CD44s CD44v 68 肿瘤多药耐药性 MDR 检测 P gp在肿瘤组织中的表达 乳腺癌 膀胱癌 胃癌 食管癌 卵巢癌 前列腺癌等 化疗前高表达 化疗后高表达 肾细胞癌 结肠癌 肝癌 肾上腺皮质癌 胰腺癌等 化疗前低表达 非何杰金氏淋巴瘤 成神经细胞瘤 急性髓白血病等 化疗不敏感 化疗敏感 化疗不敏感 69 乳腺癌 石蜡切片 脱腊 ER 雌激素受体 ER抗体染色 酶解 流式检测 固定 多聚甲醛 破膜 70 甲醇 细胞 70 Cyclin 细胞周期蛋白 71 72 细胞凋亡分析 73 DNA断裂 74 乳腺癌 Fas FasL与疾病 慢性病毒性肝炎 恶性肿瘤细胞 黑色素瘤 结肠癌 肺癌 肝癌等 脑缺血后细胞凋亡 自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 Fas FasL CD95 CD95L 75 乳腺癌 Caspases 早期细胞凋亡 AnnexinV PI 76 移植免疫 77 CD25高于正常值5 10 表明即将或已发生排斥CD4 CD8比值下降提示并发凶险感染 0 2时 必须停用免疫抑制剂CD2 HLA DR 增加5 10 且不伴有CD25的增加提示巨细胞病毒感染 移植后免疫监测 78 血小板 79 血小板活化 静止血小板 活化血小板 80 血小板活化 81 网织血小板 ITP 特发性血小板减少症 化疗 鉴别诊断 骨髓移植 82 血小板计数新标准 间接双平台法 R 红细胞数 血小板数 流式细胞术 血小板数 红细胞数 血球仪 R 国际血液学标准化委员会 ICSH 国际实验血液学协会 ISLH 2001 83 其它 84 HLA B27 85 正常人 患者 HLA B27 86 细胞介导的细胞毒作用 活靶细胞 死靶细胞 替代51Cr释放实验 87 HLA B27检测 CalibrationbeadsHLA B27calibrationbeadsDecisionmarkerHLA B27FITC MF