NP对SBR系统中典型微生物菌群的影响.doc

NP对SBR系统中典型微生物菌群的影响摘 要壬基酚(Nonlphenol, NP) 是一种对生物有机体具有毒害作用的内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, EDCs)，主要用于生产表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)。环境中的壬基酚主要来源于污水处理厂系统中NPmEO的不完全降解后的出水中，并且大量野生动物与实验动物研究证明了壬基酚具有雌激素效应和其他的生物毒性, 其对生物体产生的不良作用包括影响内分泌、影响生殖和发育、影响免疫及促癌作用等。壬基酚被认为是有代表性的环境内分泌干扰物, 为联合国环境保护署制订的27 种优先控制的持久性有毒污染物之一。尽管一些研究对壬基酚在污水处理系统中的迁移转化进行了探讨，但是通过工业废水和生活污水排放进入污水处理系统中的壬基酚是否会对污水处理系统中的微生物种群及污泥活性产生影响尚不明确。因此本论文通过投加不同浓度梯度的壬基酚到经人工配置生活污水驯化的活性污泥中，进行摇瓶实验并进行分析，探索壬基酚对活性污泥可培养微生物的影响关键词：壬基酚；活性污泥；SBR；菌群；酶活性； Effect of NP on typical microorganisms in the SBR systemAbstractNonylphenol (NP) is an endocrine disrupting chemicals(EDCs) with the toxic effect for a biological organism, and in actual production, nonylphenol mainly uses for the production of surfactant nonylphenol ethoxylate (NPmEO). In the environment, nonylphenol mainly produced from incomplete degradation of NPmEO in the sewage treatment plant Nonylphenol system. And according to studies on a large number of wild and laboratory animals, the results show that nonylphenol has estrogenic effects and other toxicity, the adverse effects on organisms of which include impacts of endocrine, reproduction and development, immune and cancer promoting. Nonylphenol is considered as a representative of environmental endocrine disruptors and it was listed as one of the 27 priority persistent toxic pollutants by Environmental Protection Department for the United Nations. Although the migration and transformation of nonylphenol in sewage treatment systems has been discussed in some studies, it is still unclear whether nonylphenol has effects on microbial population and sludge activity which is discharged into the sewage treatment system through industrial wastewater and domestic sewage. Therefore, in this thesis, we made shake flask experiments through adding different concentrations of nonylphenol to manually configured activated sludge acclimated by domestic sewage to explore the culture of activated sludge microorganisms and the effects of typical enzyme activity such as dehydrogenase, phosphatase and urease caused by nonylphenol.Key words: nonylphenol; activated sludge; SBR; bacteria; enzyme activity; 目 录1绪论11.1壬基酚的来源11.2 NP的结构性质11.2.1 NP的结构11.2.2 NP的性质11.3 NP在环境中的分布21.4 NP在环境中的迁移转化31.4.1 NP在污水和给水处理厂的迁移转化31.4.2 NP在地表水体中的迁移转化41.4.3 NP 在土壤中的迁移转化41.4.4 NP 在地下水中的迁移转化41.4.5 NP 在大气中的迁移转化41.5 NP的危害41.5.1对高等生物的影响51.5.2壬基酚对微生物的影响61.6研究目的及意义62 壬基酚对活性污泥可培养微生物的影响62.1 实验材料及仪器62.1.1 材料62.1.2 仪器72.2 实验方法 72.3 统计分析方法82.4 结果与讨论82.4.1 壬基酚对好氧可培养细菌的影响82.4.2 壬基酚对好氧可培养真菌的影响92.4.3 壬基酚对好氧可培养放线菌的影响102.5 本章小结113 壬基酚对活性污泥活性的影响113.1 实验材料及仪器113.1.1 实验材料113.1.2 实验仪器113.2 实验方法123.2.1 脱氢酶活性测定123.2.2 磷酸酶测定123.2.3 脲酶测定123.3 统计分析方法133.4 结果与讨论133.4.1 壬基酚对活性污泥中脱氢酶的影响133.4.2 壬基酚对活性污泥中碱性磷酸酶的影响143.4.3 壬基酚活性污泥中尿酶的影响163.4.4 壬基酚对污泥酶活性的影响评价173.5 本章小结174 结论和建议174.1 结论174.2 建议18参考文献19致谢211 绪论1.1 壬基酚的来源壬基酚(Nonlphenol, NP) 是一种对生物有机体具有毒害作用的内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, EDCs) 。它主要是由不同的壬基异构体与苯酚经烷化后, 在苯环C-4上发生取代而形成的。壬基酚在工农业生产和生活中得到了广泛的应用, 不同壬基支链结构的NP技术级壬基酚( technical grade nonylphenol, tNP) 主要用于生产表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO) 、以及抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。环境中的NP主要有两个来源，其中一部分来源于壬基酚生产企业排放的三废物质；另一个主要来源为污水处理系统中壬基酚聚氧乙烯醚（NPmEO）的不完全降解后的出水中1 ，当NPmEO进入城市生活污水中逐级降解,最终生成各种NP同分异构体。壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)的分解途径由下图所示：图1 壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)的分解途径1.2 NP的结构性质1.2.1 NP的结构NP是由苯酚环和壬烷基构成, 并主要以壬基对位取代形式存在。目前有许多研究是针对于某种或某几种特定的NP同分异构体进行的。至今, 已经鉴定出的tNP 的同分异构体大于22种 , Guenther K17等依据国际理论和美国化学联合会( IUPAC) 的分类标准列举出了11 种NP的理论结构, 并估计将有5080种NP同分异构体存在于环境中，图2是几种常见的NP同分异构体化合物。不同结构的NP具有不同的降解性能, 以及对生物机体的内分泌干扰作用也不相同2 。tNP的生物降解与直链NP相比要困难, 因为tNP中85%的同分异构体的烷基链上位上都含有叔C14 , 使其分支程度较高, 且支链较大, 分子体积变大。因此, 这种的复杂的立体结构一方面增强了-C的支链供电性, 从而使对位的ph-O和O-H的活性减弱, 另一方面阻碍了分子进入细胞膜与酶的活性中心结合, 最终影响它的生物转化性质18 , 这也是导致壬基酚异构体降解差异的主要原因。图2NP典型同分异构体化学结构式1.2.2 NP的性质NP的外观在常温下为无色或淡黄色粘稠液体,略带苯酚气味,不溶于水, 溶于丙酮、四氯化碳、乙醇和氯仿, 其主要的物化性质如下：熔点：-10沸点：293-297比重：d204 0.950蒸汽压：3.210-3 Pa (2.410-5 mmHg) LogKow：3.014.48g) (25) 1.9 kPa (14 mmHg) (200) 享利常数：1.15510 -5 410 -5atm m3 /mol土壤吸附系数：Koc = 60,000 (HSDB, 2001)溶解性：水6.35 mg/L (25)由NP的主要物理化学性质可以看出它属于憎水性、不易挥发性物质， 有较强的吸附性能；因此, 当NP进入环境时, 主要存在于水和土壤及沉积物中22 。1.3 NP在环境中的分布 环境中的壬基酚主要来自于非离子表面活性剂NPmEO，后者主要通过污水处理系统进入环境。在污水处理系统中经生物处理等一系列工艺过程后，最终排入周围水体。NPmEO的降解产物是以复杂混合物的形式存在的，其中水溶性较低的NP及其低分子聚合物通常结合在有机颗粒和淤泥中。NPmEO的生产量高，而且已经作为清洗剂、乳化剂、湿润剂和分散剂等被广泛使用了大约40年，因此NP在环境中的分布广泛。NP往往在污水排放口附近污染较为广泛，在加拿大的污水处理系统中，污水经过一级、二级和三级处理后，NP的浓度范围分别为O.O262.1，0.124.79和0.023.2gL。美国Kalamazoo河的污水处理厂排出水中的NP浓度2.6gL。在加拿大的淡水系统中，NP的浓度范围为0.024.25gL，平均浓度为0.2OgL，最高浓度是在工业和生活污水排放口附近检测到的。我国的长江、黄河、重庆嘉陵江、太湖、海河等水环境均检出NP的存在；胡建英等对嘉陵江和长江重庆段河流和以这两条河为水源的5个自来水厂水样中的NP进行了检测，2001年4月河流水样中NP的浓度范围为0.021.12gL，7月份为1.556.85gL；自来水厂所采集的水样中4月份NP浓度范围为0.010.06gL，7月份为0.102.73gL。 由于NP的脂溶性强，易在底泥和生物组织中蓄积。美国五大湖(the Great Lakes)和圣劳伦斯河(StLawrence)的底泥中NP的浓度范围为O.O272.2gL。英国河流底泥中报道的浓度与此相似，在污染程度较高的地区中的浓度范围为00313lgL。在加拿大污水处理厂的淤泥中，NP的浓度在0.741260g/L之间。 目前关于NP在生物体中的浓度数据还比较缺乏，有一些研究表明这些化合物呈现低到中等程度的生物累积效应。据报道，NP在鱼中的生物累积因子(BCFs)在0.91250之间。将鲤鱼(common carp)暴露于lOg/L的NP中2832天后，BCF为550，将黑头呆鱼(fathead minnows)暴露14和28天后，BCF分别为586和741。在生产表面活性剂的工厂排出污水中网箱养殖的贻贝对NPEO 和NP的生物累积因子分别为60，100，170，340。美国密歇根州不同水体的鱼组织中，NP的浓度范围在3.329.1ng/g之间。从瑞士Glatt河中采集的四种鱼的混合样品中检测到NP，NPEO 和NPEOs的浓度分别高达1.6，7.0和3.0mg/kg。金芬等在北京排污河天津段野生鲫鱼体内检测到NPEOs的残留浓度为40680ng/g，NP的浓度在301510ng/g，其BCF值分别为898和94。1.4 NP在环境中的迁移转化NP在构筑物及环境介质中具有不同的迁移转化规律。1.4.1 NP在污水和给水处理厂的迁移转化大量研究调查了NP在污水处理设施中的迁移转化行规律，结果表明，壬基酚在污水处理厂的去除主要通过活性污泥的吸附和微生物的降解。活性污泥对NP的吸附作用与其有机质含量的高低密切相关；NP在污水处理工艺中的生物降解作用会受到温度、溶解氧含量等环境因素以及污泥龄等工艺参数的影响。NP在一些河流、湖泊以及饮用水水源地都有不同水平的污染，其在给水处理工艺中的迁移转化规律与给水工艺的类型有关。传统的混凝、沉淀、消毒给水工艺对壬基酚的去除有限，而在传统工艺后端设有臭氧氧化及活性炭吸附的给水处理工艺去除NP的效率能够达到95%以上。1.4.2 NP在地表水体中的迁移转化NP在河流、湖泊、水库等水体中的污染水平既与人类生产生活活动密切相关，又随季节变化而有所不同，通常夏季气温较高，微生物活性增强，导致壬基酚聚氧乙烯醚的生物转化速率升高，中间产物NP的积累速率相应增大。此外，NP在水体中的浓度还与流速、沉淀速率及水体中颗粒物的粒径大小有关。NP进入水体后，极易吸附于沉积物中，从而限制了其扩散到水溶液中，阻抑了微生物的降解，因此底泥中的NP浓度往往比水体中的NP高。而NP在底泥中的吸附过程主要取决与NP与亲水性矿物成及憎水性有机质的相互作用，壬基酚在环境介质中不仅会发生吸附、扩散等物理化学过程，同时还会经过一系列的生物化学转化。在浅层地表水体中，壬基酚会发生光解。在底泥和土壤中，一些受到壬基酚污染地方的土著的微生物能够降解转化NP。1.4.3 NP在土壤中的迁移转化 NP在土壤中的污染与城市污泥的农用、垃圾填埋及工业泄露有关。一些列研究结果表明，施用城市污泥农田中的NP往往高于未施用的农田。NP进入土壤后，其浓度往往受到吸附、生物降解及挥发等物理化学过程的影响。土壤pH、腐殖质含量对NP的吸附影响明显，在较低pH下，高腐殖质含量的土壤中，吸附作用更强。NP在土壤颗粒上的吸附作用阻碍了其在土壤中扩散、迁移及其生物有效性。NP在土壤中的挥发性相对较弱，有研究结果显示，含NP（1克壬基酚/克土壤）土壤，经过40天的挥发，浓度只降低了0.22%。1.4.4 NP在地下水中的迁移转化 由于城市污水、垃圾渗滤液的排放，造成了地下水NP不同水平的污染。NP由地表排放进入地下，经历一系列的物理化学过程，包括迁移、扩散、吸附和生物降解等物理、化学和生物过程。地表水与地下水的循环交换需要渗透过河床、盆地，然后再进入潜水层。地下水在潜水层中迁移流动相对缓慢，而且营养和氧气有限，微生物活性低，NP降解速率低，相对稳定。因此进入地下水NP的浓度取决于地表水与地下水在河床盆地的渗透交换过程，在渗透交换过程中，吸附和生物降解对NP的浓度起着决定性的影响，而吸附和生物降解过程又受到温度、溶解氧及渗透层组成等因素的影响。1.4.5 NP在大气中的迁移转化大气中NP的污染也是人类生产生活活动的结果，NP进入大气，通过迁移扩散及干湿沉降回到陆地或地表水体。一个地区大气中NP浓度水平与该地区地表水体中的NP的浓度水平有关，且随季节性变化而变化，这是因为大气中的NP受水气交换速率影响，通常夏季气温高，水气交换通量大，大气中NP浓度水平相应增高。1.5 NP的危害 壬基酚广泛用于塑料、橡胶等行业生产中，可从各种烷基酚产品如某些食品袋中释放出来,造成污染。壬基酚能在脂肪组织中蓄积, 并通过食物链的循环进入人体产生危害23，因此其对高等生物的影响引起了人们的广泛关注。NP 对生物体产生的危害主要在以下几个方面:影响内分泌系统、影响生殖和发育、促癌作用、影响免疫等。1.5.1 对高等生物的影响1.5.1.1 对生殖发育系统的影响 报道显示，NP 可导致许多实验动物和野生动物繁殖能力下降。NP 经口进入啮齿类动物时可引起明显的睾丸损害, 成年雄性大鼠暴露于100mg/kg 1d NP 时，曲细精管直径缩小；暴露于250mg/kgd NP 时，附睾重量降低;暴露于400mg/kgd NP 时，睾丸重量降低、精子数减少。暴露剂量大于100 mg/kgd NP时,雄鼠附睾腔液中-糖苷浓度增高,表明附睾上皮分泌功能增强,这样就会破坏分泌和重吸收的平衡,使附睾腔中精子细胞发育成熟所依赖的生化环境改变,最终影响精子产生24 。睾丸功能的恶化可能与睾丸细胞凋亡有关。Hughes 等25 认为支持细胞( sertolicell) 是NP 的靶细胞,支持细胞含有丰富的内质网Ca2 + 2ATPase ,低浓度NP 即可抑制大鼠睾丸Ca2 + 2ATPase ,干扰其Ca2 + 内环境稳定,国外医学卫生学分册2004年第31卷第3期135 损害细胞生存力,这与Ca2 + 依赖的细胞凋亡机制一致。如有研究发现NP 引起日本青鱼精母细胞、支持细胞、间质细胞凋亡多于空白对照组25 。NP 可导致雄鱼雌性化。卵黄蛋白原(VTG) 是一种鱼类产生的肝源性脂蛋白,经雌激素和类雌激素物质诱导产生,一般雄鱼体内只有少量。NP 可明显增加雄鱼体内VTG。NP 结合雌激素受体( ER) 后直接激活依赖雌激素的报告基因estrgen-dependentreporter gene) ,促使VTG 基因转录。将雄性日本青鱼置于含20gL - 1NP 的水中4 天,蛋白印记法检测肝组织匀浆显示VTG含量高于空白对照组26 。NP 暴露剂量与雄性日本青鱼肝内VTG mRNA、血浆VTG水平呈剂量2反应关系。停止暴露后,肝内VTG mRNA迅速消失,而血浆中VTG 的清除则需几个月。成熟雄性日本青鱼暴露于含011gL - 1 NP 的水中即可诱导出雌性特有蛋白质(female-specific protein ,Fsp) 的表达,暴露剂量达100gL - 1 时可出现异常性腺以及雌鱼特有的臀鳍27 。1.5.1.2 对神经系统的影响 烟碱受体( nAChRs) 为递质乙酰胆碱门控的离子通道型受体,神经元nAChRs 与肌肉中的nAChRs 虽属同一家族,但它们的分子结构和生物学特性却有很大差异。NP 可干扰细胞跨膜的信号传递,其作用可能的靶位点是人类神经元nAChRs ,能有效抑制神经递质乙酰胆碱诱发的离子流通过受体,阻止信息传递给神经细胞。利用非洲爪蟾卵母细胞表达重组人类烟碱受体,受体重组亚单位不论是34 还是42 ,通过受体的离子流均能被NP 有效抑制34 。nAChRs 在学习和记忆等人类认知行为中有重要作用并参与帕金森病的发病。值得注意的是,帕金森病的病136 国外医学卫生学分册2004年第31卷第3期因至今还不完全清楚,NP 能促使12甲基242苯基吡啶(MPP+ ) 诱导的羟基自由基在成年大鼠纹状体内大量增加,而MPP+ 诱导自由基生成是公认的帕金森病的可能致病机制之一35 。NP 导致的神经行为改变的唯一证据是大鼠食盐摄入增加。从母体暴露到出生后71 天, 雌性和雄性大鼠暴露于剂量为2mgkg- 1d - 1NP ,与空白对照组相比,暴露组食盐和水的摄入量增加36 。1.5.1.3 对免疫系统的影响机体的免疫应答分为非特异性免疫应答和特异性免疫应答,特异性免疫应答由细胞免疫和体液免疫组成,T 细胞执行特异性细胞免疫应答,并在体液免疫中也发挥一定作用,B 细胞是体液免疫的主要参与者。NP 可作用于小鼠T 细胞和B 细胞上的2ER ,模拟E2 的作用,阻碍淋巴细胞的有丝分裂,即减少两者的克隆扩增,使两者生成效应细胞数量减少,影响机体执行正常特异性免疫应答功能37 。另外,NP 能有效抑制小鼠1 型辅助性T 细胞(Th1) 产生2干扰素( INF2) ,还能抑制2 型辅助性T 细胞(Th2) 产生白细胞介素24 ( IL24) 。Th1 能通过产生IL22 和INF2参与细胞免疫,Th2 能通过产生IL25、IL24 及其它白细胞介素参与体液免疫。由于NP 可通过抑制上述细胞因子的产生间接抑制特异性免疫应答活性,因而被认为具有一定的免疫毒性38 。1.5.2 壬基酚对微生物的影响壬基酚对高等生物的影响研究很多，而对对微生物生态的影响研究相对较少。目前有研究表明，壬基酚污染水平在3.86.610-6M的土壤，短期内对土壤中的真菌影响不明显，而长期作用下，对土壤中的一些丝状真菌和真菌孢子产生刺激诱导作用39。而Athanasios S等人研究了4-n-NP对活性污泥中微生物的影响，结果发现4-n-NP对污泥微生物的影响与污泥龄的长短有关，且随着污泥龄的增加，而其毒性效应相应减弱，而其4-n-NP对自养氨氧化细菌的抑制作用明显大于异氧微生物的作用40。1.6 研究目的及意义据调查目前全世界每年仍约有50 万吨的NP进入水体或土壤。根据目前发展的趋势, 在尚没有其他替代品的情况下, NPmEO及NP在工农业生产和生活中仍继续被广泛应用，而环境中的NPmEO通过污水处理系统转化为有毒、生物难降解及易生物积累的壬基酚。而通过工业废水和生活污水排放进入污水处理系统中的NP是否对污水处理系统中的微生物种群及污泥活性产生的影响尚不明确，尽管有少量的研究表明4-n-NP对活性污泥中自养氨氧化细菌有明显的抑制作用，但是环境中的NP主要是技术级的tNP，而非单一的4-n-NP。而可培养微生物的数量及污泥胞内酶和胞外酶的活性对污泥活性及污水处理系统的稳定性具有重要影响。因此本论文旨在研究技术级tNP对污水处理系统中的可培养微生物及污泥的脱氢酶、磷酸酶和尿酶等典型酶活性的影响。通过本研究，有助于进一步理解技术级壬基酚的对污水处理系统的影响，为NP的生态毒性风险评价提供很好的理论依据。2 壬基酚对活性污泥可培养微生物的影响2.1 实验材料及仪器2.1.1 材料生活污水：配方见下表2-142，其COD在500mg/L左右。表2-1组分浓度（mg/L）组分浓度（mg/L）葡萄糖400硫酸镁26谷氨酸100氯化钙3.5磷酸氢二钾138碳酸氢钠80磷酸二氢钾69七水硫酸亚铁0.75氯化铵65七水硫酸锌0.75酵母粉9七水硫酸锰0.75活性污泥：取自望塘污水处理厂氧化沟的回流污泥，污泥取回后，放入SBR反应器，加入生活污水驯化3天（运行周期12h）。牛肉膏蛋白胨培养基：用于培养细菌。在1L蒸馏水中溶于牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，并且把PH值调到7.2到7.5之间。 150度高温灭菌后使用。 马铃薯培养基：用于培养真菌。马铃薯200g煮成液体后用纱布过滤，添加蔗糖20g，琼脂15-20g，并且加蒸馏水到1L。150度高温灭菌后使用。 高氏1号培养基：用于培养放线菌。在1L蒸馏水中溶于可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，七水硫酸镁0.5g，三水磷酸氢二钾0.5，七水硫酸铁0.01，氯化钠0.5g，琼脂15-20g，并且把PH值调到7.4到7.6之间。150度高温灭菌后使用。 培养皿、试管、三角瓶。2.1.2 仪器表2-2主要实验仪器仪器名称仪器型号生产厂家电热恒温振荡水槽YIHENG上海恒科技术有限公司生物培养箱MJX-160B-Z上海博迅事业有限公司pH计HACH Sension1美国哈希HACH立式压力蒸汽灭菌器RSYZ-210上海申安医疗机械厂2.2 实验方法在6个1L三角瓶中分别加入预先计算量的NP壬基酚乙醚溶液，待乙醚挥发后，加入200mL人工配置的生活污水，然后在漩涡振荡器上振荡5min，再在超声波下振荡1h，使NP完全分散。然后加入400mL的生活污水驯化的回流污泥，使其中壬基酚初始浓度分别为0mg/L、0.2 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、20 mg/L、50 mg/L，恒温下培养42天。每7天取样，梯度稀释后接种到牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏1号培养基中，30下，在细菌培养箱内分别培养3、5、7天后统计细菌、真菌和放线菌数量，每一个样做3个平行。2.3 统计分析方法通过计算阻抑度来表示壬基酚对微生物菌落数量的影响，阻抑度计算公式如下： 上式中Acs为某一时间对照样的菌落数量，Ais为不同NP浓度下，某一时间活性污泥样的菌落数量。为了进一步分析壬基酚对微生物菌落的影响，用SPSS软件对数据进行了两因素方差分析。2.4 结果与讨论2.4.1 壬基酚对好氧可培养细菌的影响在42天的培养过程中，每周从6种不同浓度壬基酚污泥样中取样测定细菌数量，并计算某一取样时间下的阻抑度，其计算结果如下图2.1.图2.1 壬基酚对可培养好氧细菌的阻抑度（%） 由上图可以看出在某一时间内，壬基酚浓度高的水样，其阻抑度相对较高。当培养时间在14天时阻抑度达到最大，之后随着时间的变化逐步下降，在第35天，不同NP浓度的污泥样的阻抑度开始出现负值，而且浓度越高，负阻抑度越大，由此可以看出，后期活性污泥样中可能出现一些细菌开始利用NP为碳源。但总体上看，不同NP浓度对活性污泥样的阻抑度均不高，阻抑度最高值也才在5%到6%之间，所以从图不能直接判断壬基酚对可培养好氧细菌是否有显著影响。因此，采用SPSS软件对数据进行两因素方差分析，进一步探讨了壬基酚对细菌的影响。两因素方差分析结果如下表2-3：表2-3 壬基酚及培养时间对可培养好氧细菌的阻抑度的两因素方差分析误差来源df离差平方和均方FF0.05P培养时间5104.4320.8913.182.602.48E-60.05误差2539.6211.64总差35156.00 上表中F0.05为壬基酚在95%的可能性对菌落产生影响的参数值。当F值小于F0.05值时表明壬基酚没有影响。由上表可以看出浓度因子的F值远远小于F0.05值，由此可以看出，NP浓度在50mg/L以下，对活性污泥中可培养细菌无显著影响。2.4.2 壬基酚对好氧可培养真菌的影响在42天的培养过程中，每周从6种不同浓度壬基酚污泥样中取样测定真菌数量，并计算某一取样时间下的阻抑度，其计算结果如下图2.2.图2.2 壬基酚对可培养好氧真菌的阻抑度（%）由上图可以看出在某一时间内，壬基酚对污泥中好氧真菌的阻抑影响随着浓度高的升高而增大；且NP对污泥真菌的阻抑影响随着时间的延长，出现先增加后降低，总体阻抑度在中期21天时出现最大值，在后期有个别浓度水样存在负值。但总体阻抑度不高，最大值只达到2.2%，由此看出壬基酚对真菌的影响较小。为了进一步分析壬基酚对真菌的影响，采用SPSS软件对数据进行两因素方差分析，两因素方差分析结果如下表2-4。表2-4 壬基酚及培养时间对可培养好氧真菌的阻抑度的两因素方差分析误差来源df离差平方和均方FF0.05P培养时间513.912.786.452.605.59256E-40.05误差2510.780.43总差3529.08 从上表可以看出浓度因子的F值小于F0.05值，由此可以看出，NP浓度在50mg/L以下，对活性污泥中可培养真菌无显著影响。2.4.3 壬基酚对好氧可培养放线菌的影响在42天的培养过程中，每周从6种不同浓度壬基酚污泥样中取样测定放线菌数量，并计算某一取样时间下的阻抑度，其计算结果如下图2.3.图2.3 壬基酚对可培养好氧放线菌的阻抑度（%）由上图可以看出在同一时间内壬基酚浓度越高，阻抑度越高，并且不同NP浓度之间的阻抑度有明显的差异。在不同NP浓度下，当培养时间在14天时，阻抑度达到最高值，之后随着时间的变化逐步下降。NP浓度在50mg/L时，阻抑度最高值达到将近10%，由此可以看出壬基酚对可培养好氧放线菌有一定的影响。为了进一步分析壬基酚对放线菌的影响，使用SPSS软件对数据进行了两因素方差分析。两因素方差分析结果如下表2-5。表2-5 壬基酚及培养时间对可培养好氧放线菌的阻抑度的两因素方差分析误差来源df离差平方和均方FF0.05P培养时间544.058.816.672.604.52565E-40.05NP 浓度5125.0525.0118.922.608.82801E-80.05误差2533.051.32总差35202.15 由上表看出壬基酚浓度因子的F值远远大于F0.05值，两因素方法分析结果表明，壬基酚对可培养好氧放线菌有显著的影响。2.5本章小结 经过42天培养，考察了不同浓度的壬基酚对活性污泥可培养微生物的影响，结果表明，NP对细菌、真菌及放线菌的影响随着时间的变化与变化，且随着NP浓度的增加，阻抑影响愈大，且阻抑度最大值分别出现在第14天、21天、14天。50mg/L时最大阻抑度分别为5.6%、2.2%及9.8%。通过两因素方差分析可以看出，NP在50mg/L以下，对污泥中的细菌、真菌的影响不显著，而对放线菌具有显著性的影响。3 壬基酚对活性污泥活性的影响3.1 实验材料及仪器3.1.1 实验材料 壬基酚生活污水溶液同第二章。 活性污泥，取自望塘污水处理厂氧化沟的回流污泥，并在实验室SBR反应器内利用人工合成生活污水驯化培养3天。三羟甲基甲烷，盐酸，氯化三苯基四氮唑，亚硫酸钠，氯化钠，甲苯，氯化铵，氢氧化氨，铁氰化钾液，4-氨基氨替比林，硫酸苯二钠，柠檬酸，氢氧化钾，1M氢氧化钠，次氯酸钠，尿素，硫酸铵，所有试剂均为分析纯。3.1.2 实验仪器表3-1 实验仪器仪器名称仪器型号生产厂家恒温锅YIHENG上海恒可技术有限公司离心机GL-20BFULGOR生化培养箱MJX-160B-Z上海博迅事业有限公司分光光度计UV-1200JENCO3.2 实验方法在6个1L三角瓶中分别加入预先计算量的NP壬基酚乙醚溶液，待乙醚挥发后，加入200mL人工配置的生活污水，然后在漩涡振荡器上振荡5min，再在超声波下振荡1h，使NP完全分散。然后加入400mL的生活污水驯化的回流污泥，使其中壬基酚初始浓度分别为0mg/L、0.2 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、20 mg/L、50 mg/L，恒温下培养42天。每7天取样，测定脱氢酶、磷酸酶及尿酶，每一个样做2个平行。3.2.1 脱氢酶活性测定 采用了TTC比色法。氯化三苯基四氮唑（TTC）在氧化状态接受脱氢酶活化的氢而被还原时具体有稳定颜色，通过比色方法，测定反应后的颜色深度和反应速度来推测脱氢酶的活性。具体实验方法如下： 在10mL水样离心后弃去上清液，用生理盐水补足，充分摇匀后洗涤再离心，反复三次后，取活性污泥悬浮液。在2ml样品中加Tris-HCL缓冲液1.5mL, ,亚硫酸钠溶液0.5mL, 氯化三苯基四氮唑（TTC）1mL（对照样加0.5mLTTC和0.5mL生活污水），摇匀后放置在用盖子遮光37度水浴锅内，计时。反应时间已显色情况而定。样品呈棕红色后，加入3滴浓硫酸，终止反应。再加入甲苯萃取后，在4000转/分下离心10分钟。取上清液在485nm波长下用分光光度计比色。每个样品做2个平行，并且用同样方法绘制标准曲线。3.2.2 磷酸酶测定 采用了磷酸本二钠比色法。碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成玫红色醌类化合物，其颜色深浅与磷酸酶活性成正比。具体实验方法如下： 取5mL活性污泥水样，置于50mL三角瓶中，加2mL甲苯，20mL0.5%磷酸苯二钠，充分摇匀后放置37度恒温箱中。培养24小时后，取滤液2mL置于50mL容量瓶中分别加入20mL蒸馏水，0.25mL氯化铵-氢氧化氨缓冲液，0.5mL铁氰化钾液, 0.5mL 4-氨基氨替比林液，充分摇匀后定容到50mL。在15分钟内在510nm波长下用分光光度计比色。每个样在设置3次重复的同时，又设置了1个无基质对照。另外，对总试验设置无土壤对照，并且用同样方法绘制标准曲线。3.2.3 脲酶测定 采用了苯酚-次氯酸钠比色法（靛酚比色法）。具体实验方法如下：取5mL活性污泥水样，置于50mL三角瓶中，加2mL甲苯处理15min后，加入10mL 10%尿素液和20mL pH6.7的柠檬酸盐缓冲液。摇匀后将容量瓶放入37恒温箱中培养24h。培养结束后，将悬液用致密滤纸过滤，吸取2m滤液注入50 mL容量瓶中分别加入20mL蒸馏水，再加入4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。放置2分钟后，定容，1小时内在分光光度计上于波长578nm处比色。每个样在设置3次重复的同时，又设置了1个无基质对照。另外，对总试验设置无土壤对照，并且用同样方法绘制标准曲线。土壤脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。3.3 统计分析方法 通过计算阻抑度来表示壬基酚对活性污泥中三种酶活性的影响。阻抑度计算公式如下： 上式中Acs为某一时间对照样的酶活性，Ais为不同NP浓度下，某一时间活性污泥样的酶活性。为了进一步分析壬基酚对酶活性的影响，用SPSS软件对数据进行了两因素方差分析。3.4 结果与讨论3.4.1 壬基酚对活性污泥中脱氢酶的影响图 3.1 NP对脱氢酶活性的影响图3.2 NP对脱氢酶活性的剂量-效应关系图 由上图可以看出，在同一时间内活性污泥水样的壬基酚浓度越高，酶活性越低。不同NP浓度下，脱氢酶活性随时间的变化逐步下降，第35天之后，不同NP浓度污泥样的脱氢酶活性下降到一定值后，彼此之间无明显差别。由此可以看出NP对污泥脱氢酶活性的在28天以内具有明显的抑制影响。为了进一步分析NP对污泥脱氢酶活性的影响，拟合出NP对脱氢酶活性阻抑的剂量-效应模型如下图3.2，拟合方程如下表3-2。time (days)Fitting curve equationsR2P7y=5.65logX-23.020.979827.93759E-414y=6.43logX-26.200.94370.0037321y=6.13logX-20.960.95790.002428y=5.05logX-17.460.963120.0019735y=1.79logX-2.570.760210.0022142y=1.91logX-6.340.735740.00456 表3.2 壬基酚对污泥脱氢酶活性的剂量-效应的拟合曲线方程由上图3.2与表3.2可以看出活性污泥水样中的壬基酚浓度与阻抑度成正相关，在同一时间内壬基酚浓度高越高，阻抑度越高。阻抑度在前期随着时间的变化而增高，第14天时阻抑效应达到最显著，第35天以后阻抑效应不明显；而第28天之前，模型Y=aLogX+b对NP的剂量-效应拟合效果较好，第35天和42天时拟合效果较差，可能是后期活性污泥中的营养物缺乏，微生物数量减少，一部分微生物对NP具有耐性造成的。3.4.2 壬基酚对活性污泥中碱性磷酸酶的影响图 3.3 NP对磷酸酶的活性的影响 由上图可以看出在某一时间内，活性污泥水样的壬基酚浓度越高，酶活性越低。不同NP浓度活性污泥的磷酸酶活性随着时间的变化而变化，在21天之前，随着时间延长，磷酸酶活性逐渐降低，而且NP浓度越高，酶活性越低，第21天时酶活性达到最低；从第28天开始，酶活性开始上升，第35天时出现一个峰值，之后又开始下降。为了进一步分析NP对污泥磷酸酶活性的影响，采用模型Y=aLogX+b拟合NP对磷酸酶活性阻抑的剂量-效应，拟合曲线图及拟合方程分别见图3.4及表3-3。图3.4 NP对磷酸酶活性的剂量-效应关系图表3.3壬基酚对污泥磷酸酶活性的剂量-效应的拟合曲线方程time (days)Fitting curve equationsR2P7y=7.27logX-16.710.99062.49E-0414y=6.92logX-9.570.96270.00221y=6.80logX-14.270.97590.0010428y=5.91logX-8.430.95720.0024635y=5.88logX-10.360.85030.0030842y=3.77logX-10.810.80130.02559 从上图3.4与表3.3可以看出壬基酚对活性污泥中磷酸酶的阻抑度与NP的浓度成正相关，在某一时间内壬基酚浓度高越高，阻抑度越高。阻抑度在第7天时出现最大值，且随着时间的变化，阻抑度逐渐减小，这有可能是到了后期活性污泥中的营养不足，微生物开始分解自己细胞中的磷的化合物使得磷酸酶活性上升；总体上，在