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第四节离子交换色谱 LujiangYuanSchoolofPharmaceuticalScienceSouthwestUniversity 离子交换色谱的发展 1903年 泡沸石 天然硅铝酸盐Na2A12Si4O12 nH2O 来软化硬水 Na2Z Ca2 CaZ 2Na 1933年 合成了酚醛类型的阴阳离子树脂 1945年 美国人 D Alelio 聚苯乙烯型强酸性阳离子树脂 聚丙稀酸型阳离子交换树脂的合成 此外 纤维素和多糖上引入交换基形成的离子交换剂 离子交换层析 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相 以含特定离子的溶液为流动相 利用离子交换剂上的可交换离子与溶液中离子发生交换作用 由于不同的离子交换能力不一样 待分离的各种离子在树脂柱中随流动相的移动速度也不一样 而将混合物中不同离子进行分离的技术 离子交换介质的基本性质 离子交换剂亦称离子交换介质 通常是一种不溶性高分子化合物如树脂 纤维素 葡聚糖 醇脂糖等 含可交换离子洗脱的可能性取决于交换反应平衡常数吸附的蛋白质可以通过改变pH值 使蛋白质分子电性发生改变 而洗脱下来 不同蛋白质形成离子键数目有差异的 及亲和力不同 离子交换树脂的结构和性质 离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物 网状结构的骨架部分一段很稳定 不溶于酸 碱和一般溶剂 在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团 根据活性基团的不同 离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类 合成 高分子化学加聚反应 先合成骨架 然后在骨架上添加功能基团 如合成过程中加入致孔剂 可得大孔离子交换树脂 否为凝胶型 在高分子离子交换树脂中 常用的为交联的聚苯乙烯骨架上连接不同得功能团 可交换基团 离子交换剂的分类阳离子交换剂 强酸型和弱酸型可电离的基团磺酸基 SO3H 磷酸基 PO3H2 羧酸基 COOH 酚羟基 OH 阴离子交换剂 强碱型和弱碱型可电离的基团伯胺基 NH2 仲胺基 NHCH3 叔胺基 N CH3 2 季胺基 N CH3 3 一 阳离子交换树脂 1强酸型阳离子交换树脂阳离子交换树脂具有酸性基团 如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂 它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合 经浓硫酸磺化而制得的聚合物 化学性质稳定 5 10年 耐强酸 强碱 氧化剂和还原剂 不溶于酸 碱及常见的有机溶剂 耐热超过100 C 2弱酸型子交换树脂 甲基丙烯酸和二乙烯苯基聚合 功能基羧基 COOH 根据活性基团离解出H 能力的大小不同 阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种 例如含 SO3的为强酸性阳离子交换树脂 常用R SO3H表示 R表示树脂的骨架 含 COOH和 OH的弱酸性阳离子交换树脂 分别用R COOH和R OH表示 强酸性阳离子交换树脂应用较广泛 弱酸性阳离子交换树脂的H 不易电离 所以在酸性溶液中不能应用 但它的选择性较高而且易于洗脱 二 阴离子交换树脂 与阳离子交换树脂具有同样的有机骨架 只是所联的活性基团为碱性基团 季胺 N CH3 3 H 不易电离 强碱性阴离子交换树脂 伯胺基 NH2 仲胺基 NHCH3 和叔胺基 N CH3 2 的树脂为弱碱性阴离子交换树脂 水化 R NH3OH R NH2CH3OH R NH CH3 2OH和R N CH3 3OH OH 可被阴离子交换和洗脱 阴离子交换树脂的化学稳定性及耐热性能都不如阳离子交换树脂稳定 交联度 树脂中所合交联剂的百分率称为重量交联度 例如强酸性阳离子交换树脂 苯乙烯聚合而成为长的链状分子 二乙烯苯把各链状分子联成立体型的网状体 如果二乙烯苯在原料总量中占10 则称该树脂的交联度为10 交联度 树脂的交联度越大 则网眼越小 交换时体积大的离子进入树脂便受到限制 但提高了交换的选择性 另外 交联度大时 形成的树脂结构紧密 机械强度高 但是如果交联度过大则对水的膨胀性能差 一般要求1克干树脂在水中能膨胀至1 5 2cm3为宜 交换反应的速度慢 因此要求树脂的交联度一般为4 14 交换容量 每克干树脂所含活性基团的物质的量 而实际交换容量是指在实验条件下 每克干树脂能交换离子的物质的量 称取干树脂1克 置于250mL锥形瓶中 准确加入0 1mol LNaOH标准溶液100mL 振荡后放置过夜 用移浓管吸取上层清液25mL 加酚酞指示剂1滴 用0 1mol L标准HCl溶液滴定至红色消失 设用去标准HCl溶液14mL 树脂的交换容量可以计算为5 6mmol g 离子交换亲和力 离子交换反应和其他化学反应一样 完全服从质量作用定律 树脂对离子亲合力的大小用平衡常数来代表 它与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响 离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大 离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱 常用的离子交换剂 离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物 具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积 大分子可以自由通过 因而对生物大分子 如蛋白质 的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素 CM纤维素 等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素 DEAE纤维素 离子交换纤维素 离子交换纤维素 离子交换纤维素 常用的离子交换剂 离子交换葡聚糖 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物 SephadexG Sephadex的优点如下 亲水性强 不会引起生物分子的变性和失活 母链对蛋白质 核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高 交换容量大 装柱方便 流速快既有离子交换作用 又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质 在pH 7时可耐120 的高热 2 105的蛋白质 适用于 常用的离子交换剂 常用的离子交换葡聚糖包括 阳离子交换剂CM SephadexC 25 CM SephadexC 50 SephadexC 25 SephadexC 50 阴离子交换剂DEAE SephadexA 25 DEAE SephadexA 50 QAE SephadexA 25 QAE SephadexA 50 常用的离子交换剂 离子交换琼脂糖 离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL 6B DEAE Sepharose 阴离子型 和CM Sepharose 阳离子型 的离子交换介质具有硬度大 性质稳定 流速好 分离能力强等优点 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小 因此具有稳定的外形体积 对pH及温度的变化均较稳定 可在pH3 10和0 70 范围内使用 改变离子强度或pH时 床体积变化不大 二 离子交换树脂的选择 一般原则 酸性物质用阴离子交换剂分离碱性物质用阳离子交换剂分离 反离子 强酸 碱性用H OH 弱用Na Cl 氨基酸 核苷酸 蛋白质等两性电解质 可根据其pI值及离子化曲线来选择 活性分子 亲水性基质的交换树脂具体 种类 离子形式 交换量 颜色 交联度 理化性质等 被分离物质所带的电荷性质 离子交换介质的选择原则 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH 蛋白质净电荷 等电点 吸附阴离子交换剂 吸附阳离子交换剂 pHpI 对pI 5的某酸性蛋白质 在pH5 5 9 0的范围内 当蛋白质为阴离子时 应首选DEAE纤维素 在pH3 5 4 5的范围内 当蛋白质为阳离子时 应首选CM纤维素 1种类选定 中性盐体系 阴阳离子的脱除用强酸强碱树脂微量杂质的脱除也要强型树脂强碱树脂分有I和II型 I型碱型强于III型 易与硅酸等弱酸作用 再生差 II型 不与比乙酸更弱的酸作用 交换能力强的离子 用弱碱性或弱酸性离子交换树脂 如一般有机碱交换能力都强 多价金属离子 生物碱 链霉素等都用弱酸性离子交换树脂 既容易吸附又容易洗脱 中性或碱性体系中 多价金属离子与弱酸阳离子交换强 易洗脱 与强酸阳离子交换弱 弱酸通常不用弱碱树脂 但用强碱树脂 弱碱体系中 阳离子交换用弱酸阳离子树脂 弱酸体系中 弱酸中的阴离子用弱碱阴离子树脂 2树脂形式的选择 中性盐溶液 交换后生成盐 盐型弱酸弱碱树脂 当量相当的游离 酸碱混合 酸 碱条件下的离子 游离碱或酸树脂 盐中除酸 碱 弱型树脂 强型会交换盐 3 颗粒 交联度和稳定性 A颜色 浅色便于看色带 使用后色深 杂质多色变深 B颗粒 20 80目 200 400目 C交联度 聚苯乙烯树脂交联度1 20 常用8 交联度高 选择性好 交换速度小 孔度与交联度关系密切 D密度 0 4 0 8g mlE稳定性 一般而言 聚苯乙烯树脂稳定阳比阴稳定盐比酸碱稳定 离子交换剂的分类 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响 离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大 离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱 弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱 三 离子交换柱的操作 以强酸性阳离子交换树脂分离K 和Na 为例交换R H K R K H R H Na R Na H 洗脱R K H R H K R Na H R H Na 1树脂的处理 A过筛分 得均一颗粒 也可溶胀后筛分 商品树脂20 80目 可将其干燥 粉碎 过筛或沉降 浮选处理 B净化处理 乙醇 水 4mol LHClorNaOH 蒸馏水到 pH4 5or7 8 强酸阳离子树脂其商品多为Na型 用4倍体积5 6 盐酸搅拌5h 水洗到中性 然后4倍体积5 6 NaorNaCl交换 水洗到无Na 必要时可重复1 2次 如需使用H 接上步骤用6倍体积5 6 HCl交换 水洗到中性 酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型 强碱型阴离子交换树脂 商品型一般为Cl型 4倍体积5 6 NaOH 蒸馏水洗到中性 4倍体积5 6 HCl 蒸馏水洗到中性 6倍体积5 6 NaOH 蒸馏水洗到中性 OH型树脂最好现制现用 它吸附空气中CO2 弱酸型阳离子交换树脂 商品树脂一般为Na型 处理可参照强酸型阳离子交换树脂 弱碱型阴离子交换树脂处理参照强碱型阴离子交换树脂法 2柱的操作 装柱 树脂高度一般约为柱高的90 为防止加试液时树脂被冲起 在柱的上端亦应铺一层玻璃纤维 或隔板 装好后 再用蒸馏水洗涤 不少于2倍柱体积 备用 上样 阳离子树脂可达交换容量的50 阴离子一般为10 20 小于5 床体积 1 分析 洗脱 用蒸馏水洗去多余的 没吸附的 样品 然后用洗脱液 缓冲液 pH 离子强度 淋洗 方法有等度 梯度等 平衡 柱子装好后 要用所需的缓冲液 有一定的pH和离子强度 平衡柱子 用恒流泵在恒定压力下走柱子 平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同 离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合 有时柱子平衡好后 还要进行转型处理 补充 离子交换层析的基本操作 层析柱平衡 平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 平衡终点以流出液的离子浓度 导电性 pH值与缓冲液一致为准 其中pH值最重要 补充 交换将试液加到交换柱上 用活塞控制一定的流速进行交换 经过一段时间之后 上层树脂全部被交换 下层未被交换 中间则部分被交换 这一段称为 交界层 随着交换的进行 交界层逐渐下移 至流出液中开始出现交换离子时 称为始漏点 亦称泄漏点或突破点 此时交换柱上被交换离子的物质的量数称为始漏量 在到达始漏点时 交界层的下端刚到达交换柱的底部 而交换层中尚有未被交换的树脂存在 所以始漏量总是小于总交换量 补充 洗脱当交换完毕之后 一般用蒸馏水洗去残存溶液 然后用适当的洗脱液进行洗脱 在洗脱过程中 上层被交换的离子先被洗脱下来 经过下层未被交换的树脂时 又可以再度被交换 因此最初洗脱液中被交换离子的浓度等于零 随着洗脱的进行 洗出液离子浓度逐渐增大 达到最大值之后又逐渐减小 至完全洗脱之后 被洗出之离子浓度又等于零 对于阳离子交换树脂常采用HCl溶液作为洗脱液 经过洗脱之后树脂转为氢型 阴离子交换树脂常采用NaCl或NaOH溶液作为洗脱液 经过洗脱之后 树脂转为氯型或氢氧型 因此洗脱之后的树脂已得到再生 用蒸馏水洗涤干净即可再次使用 补充 离子交换层析的基本操作 样品洗脱 恒定洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 10 20 30 40 50 60 70 80 90 离子强度 pH值 C C2 C2 C1 1 V A2 A1 A1 C1 V为流出体积对总体积之比 A2 C2 当A1 A2时为线性梯度 当A1 A2时为凹形梯度 A1 A2时为凸形梯度 洗脱速度 洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率要好 但峰过宽洗脱峰过宽 则可适当提高洗脱速度 产品的浓缩 脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高 而且体积较大 样品浓度较低 所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩 脱盐处理 3再生 若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生 也可用乙醇洗涤 其顺序为 0 5mol LNaOH 水 乙醇 水 20 NaOH 水 保存离子交换剂时要加防腐剂 阴离子交换剂 0 002 氯已定 洗必泰 阳离子交换剂 乙基硫柳汞 0 005 有些产品用0 02 叠氮钠 影响离子交换的主要因素 流动相的酸度 离子交换树脂就是固体酸碱 对于强型而言pH影响不大 弱型则显著 强酸型阳离子 pH 2弱酸型阳离子 pH 6强碱型阴离子 pH 12弱碱型阴离子 pH 7 样品浓度 浓度高树脂的解离减小 影响吸附顺序及选择性 改变树脂表面结构 影响离子进入 温度 对稀溶液的交换影响不大 溶液浓度高时 温度升高 易水合的离子易吸附 对弱碱 弱酸 温度升高 吸附速加快 但温度太高会破坏树脂 溶剂 一般情况在水溶液中进行 可加入某些有极性机溶剂来改变选择性 但必须特别注意 这可能会使某些离子的交换无法进行 四离子色谱的应用 1纯水的制备氢型强酸性阳离子交换树脂 除去各种阳离子2R SO3H Ca2 R SO3 2Ca 2H 氢氧型强碱性阴离子交换树脂 除去各种阴离子 RN CH3 3OH C1 RN CH3 3Cl OH 去离子水装置示意 水质检测 化学法 pH值离子 Cl Fe CaMg 硫酸根等 可溶性硅 氧化物不挥发物物理法 测定电阻率超纯水18兆以上 再生