龙牙百合.doc

龙牙百合的组织培养及研究龙牙百合(Lilium brownii F. E.Brown var. viridulum Baker) ,又名百合、博多百合、白花百合,为野百合的变种,属百合科百合属植物,产于江西、湖南、湖北、安徽、浙江、河南和陕西等地,是我国较早的栽培种之一。龙牙百合的鳞片含有丰富的淀粉,风味独特,主要供食用;亦可药用,有润肺、止咳、清热、安神和利尿等功效;此外,还可用于观赏,大而洁白的花朵含有芳香油,可提取香料。正因为它不仅是极富营养价值的名贵佳肴,而且有良好的药用价值,所以具有广阔的市场开发前景。如：永州市零陵区。种植龙牙百合平均产量1. 8万hm2 ,产值约60万元/hm2 ,成本约18万元/hm2 (其中用种成本10. 5万元/hm2 )【1】农民收益好，积极性特别高。然而传统的繁殖方法主要采用常规的分球、分珠芽鳞片扦插，鳞片包埋等，采用这些方法繁殖，繁殖量较小，不能满足生产的需求，特别是经多代分殖以后，常造成种性退化，甚至病毒积累，影响百合的产量和质量。利用组织培养技术，能够迅速去除病毒和更新品种，加快了百合的快速繁殖，缩短了百合的生育周期。同时百合栽培中有着休眠期的束缚，也可通过低温或生长激素来打破休眠期。下面本文从龙牙百合的快速繁殖与脱毒、休眠期的打破两个方面介绍龙牙百合组织培养研究的概况。1、 龙牙百合的快速繁殖与脱毒1.1 外植体的选择龙牙百合许多器官都可作为外植体，如鳞片、顶芽、茎段、叶片、花药等，其中以鳞片做外植体较多，但是不同部位的鳞片的分化有差异。根据罗丽萍等【2】试验统计得出,来自鳞片上、中、下部的分化率分别为7 %、15 %和95 %。杭玲等【3】试验表明选择百合鳞片表皮3 4 层的鳞片为外质体诱导的小鳞茎不仅快而且诱导率也较高; 鳞茎表皮1 2层由于受损伤, 接种后极易污染, 不易成功; 内层越深鳞片越幼嫩, 诱导率越低, 甚至不产生小鳞茎。杨柏云等【4】也表明剥取的茎尖大小与茎尖的成活率呈正相关系,茎尖越大,成活率越高。茎尖小于0. 5 mm以后,茎尖启动所需的时间更长, 成活率也显著下降,部分生长点由刚分离时较亮的淡黄色逐渐变为无色透明,最终死亡。1.2外植体灭菌 龙牙百合外植体的灭菌多种多样，常用的药剂有乙醇、升汞、次氯酸钠及漂白粉等。通常用乙醇对材料进行预灭菌，使用浓度一般为70%-75%，灭菌时间为10-60s。升汞的使用浓度为0.1%-0.2%，灭菌时间为10min，灭菌是要不断摇动【5】；漂白粉的使用浓度为饱和溶液，灭菌时间为10-20min左右【6】。各类的方法大同小异都能达到灭菌的效果，以浓度为70%-75%的乙醇预灭菌再用浓度0.1%-0.2%的升汞灭菌较为常用有效。1.3 无毒苗的培养百合主要靠小鳞茎进行分株繁殖，但是百合病毒可以通过种球传播，使得病毒积累日趋严重，最终导致种质严重退化，影响龙牙百合鳞茎的产量和品质,极大地阻碍了龙牙百合的大面积推广。迄今为止已发现引起百合种球退化的病毒及其类似病原多达12种，其中危害最严重的有百合潜隐病毒（Lily symptomless virus ,LSV）,郁金香碎花病毒（Tulip breaking virus ,TBV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus ,CMV）。一旦百合感染上这些病毒，则植株生长势弱，株矮花小，在叶片上出现黄白斑甚至坏死。百合脱毒研究最早是Philli（1962年），他利用百合茎尖培养脱毒成功，之后的半个世纪时间里，科研工作者相继利用花丝进行组培得到无病毒小鳞茎，利用珠芽外植体诱导成愈伤组织最终得到无毒株苗，还有的则利用花药培养得到无毒植株，最新的方法还有化学处理和热处理等。一般被认为植物的生长点以及生长点附近没有病毒或浓度很低,所以一般百合脱毒都采用茎尖培养来获取无病毒植株。然而单单采用茎尖培养并不能达到100%脱毒的效果，单一的脱毒处理技术或难以完全脱除病毒或需要较长的时间。2 种或3 种脱毒技术的组合使用是生产脱毒龙牙百合种苗的首选方法。张文珠等【7】采用茎尖培养和茎尖培养结合热处理2种脱毒方法进行比较研究。实验结果表明：0.2-0.5mm的茎尖培养结合热处理的脱毒效果最好，脱毒率达60%。筛选出的无毒母株可作母本，进行快速大量的繁殖。杨柏云等【4】以无菌小苗与小鳞茎为材料,研究了热处理和病毒化学抑制剂预处理等对其茎尖存活率和脱毒效果的影响。实验结果表明病毒不耐高温,通过热处理可使其钝化,结合茎尖培养,能获得较好的脱毒效果。同时在外殖体培养时加入病毒化学抑制剂病毒唑(virazole) ,可促使病毒钝化,结合高温和茎尖培养,可获得无病毒苗。抗病毒剂使用浓度越高,处理时间越长脱毒效果越加明显,但是,高浓度抗病毒剂对植株的生长有一定伤害,该试验用5 mg/ L 病毒( virazole ) ,结果表明对植株生长无任何影响,且脱毒效果明显，但是最适的抗病毒剂的种类和浓度有待进一步的研究。1.4病毒检测方法无论用哪种方法脱毒，即使病毒检测呈阴性,仍不能保证小鳞茎不再带毒。过多次的继代培养后,有时仍然可检测到呈阳性的现象,并且随着继代培养的时间越长,检测呈阳率就越高为了保证脱毒种球户外栽培后保持无病毒状态,应该定期对植株进行病毒检测,同时加强田间栽培管理,控制感染源。总之,脱毒种球出瓶后的再检测和田间管理,是龙牙百合无病毒种球生产不可缺少的重要环节。目前常用的病毒检测方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。指示植物法虽然简单,但检测速度很慢,灵敏度较低,还受季节限制,成本较高,应用局限性较大。现在应用最广泛的植物病毒检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA) ,其以快速、准确、适于批量检测的优点,成为当前国内外检测百合病毒的常用技术【8】。1.5 激素对百合培养的影响1.5.1 在诱导体细胞胚形成的过程中,生长素类激素尤其是2, 4 - D起着重要的作用。杨柏云等【9】以龙牙百合鳞片为外植体,以MS为基本培养,通过添加不同浓度的6 - BA, 2, 4 - D,研究了其体细胞胚发生的最佳培养条件，其结果表明当2, 4 - D浓度低于0. 5 mg/L时,体细胞胚以直接方式发生,起源于鳞片表皮下数层细胞或深层的细胞,依次经过多细胞原胚,球形胚,心形胚,成熟胚等阶段,其形态学发育过程与合子胚相似。当2, 4 - D浓度适中时,体细胞胚以间接方式发生,起源于愈伤组织内部的胚性细胞团,其形态学发育过程也与合子胚相似;诱导胚性愈伤组织的最适培养基为MS + 0. 5 mg/L 6 - BA + 2. 0 mg/L 2, 4 - D,在分化形成体细胞胚时,需降低或去除2, 4 - D。1.5.2 培养基中的激素成分与配比是影响百合鳞芽诱导及不定芽增殖的重要因素。 万勇等【10】以万载龙牙百合当年成熟的鳞片为外植体,接种于不同激素配比的MS 培养基上诱导小鳞茎。其试验结果也表明:在小鳞茎诱导过程中,暗处理有利于小鳞茎的生长,最佳诱导培养基为:MS +NAA 0. 5mg/ L + CH 300mg/ L ; 快速增殖以培养基MS + NAA 0. 2mg/ L + BA 2. 0mg/ L + CH500mg/ L 的效果最好。百合试管苗容易生根,在附加较低浓度IBA 或NAA 的1/ 2 MS 培养基上均能100 %生根,但以附加IBA 0. 2mg/ L 及0. 1 %活性碳的培养基效果最好。因此,对于龙牙百合的快速繁殖与脱毒,激素的浓度和搭配比例与芽的诱导和增殖有密切关系,所以,在选择出最佳的外植体后,激素的浓度和配比是百合组织培养中的关键因素。2、 打破龙牙百合休眠生理的研究龙牙百合鳞茎具有自发休眠的特性,生产中常出现种球发芽率低、发芽不整齐、切花质量较差等现象,而且存在生长周期长不可一年多季的问题。因此如何打破龙牙百合鳞茎自然休眠,对调节百合种植时期有着十分重要的意义。对于百合等鳞茎类植物来说不存在种皮机械障碍和胚未成熟等原因导致的强制性休眠，其休眠与体内发芽抑制物的存在有关，属于生理休眠。温度和光照是引起休眠或萌芽最主要的外界因素，而由之引发的各类内源激素含量及其相互比值的变化则是最主要的内部因素，其中尤以脱落酸（ABA），赤霉素（GA），细胞分裂素(CTK)，生长素(IAA)的影响较为显著【11】。因此打破百合鳞茎休眠的突破口可以分为低温处理和激素处理两大方面。2.1 低温处理是打破百合鳞茎休眠有效的方法。有研究【12-16】表明, 打破休眠的有效温度在15以下。无论是组培获得的百合鳞茎, 还是种间杂交种的鳞茎, 或其它繁殖方法获得的鳞茎, 均可在013处30110 d打破休眠。组培产生的小鳞茎, 不同的低温处理不仅影响到小鳞茎萌发的数量, 还影响萌发的迟早, 低温处理时间越长, 萌发的时间越早越整齐。在实际生产中, 人们常利用低温、变温处理适宜的时间打破鳞茎休眠。 低温处理已证实可以一定程度上打破百合的休眠，然而低温处理所需要的时间较长，一般都需要30d以上，因此推动了激素处理研究。2.2 激素处理打破百合休眠目前人们普遍认为植物的休眠是由植物内源激素所调控的是内源抑制物和促进物之间平衡的结果。2.2.1 一般认为, 脱落酸(ABA) 是萌发抑制物。用脱落酸处理百合鳞茎不仅可以延迟萌发, 而且可以钝化低温的春化作用。在百合组织培养的试验中也发现, 在培养基中加入ABA虽不影响组培小鳞茎的休眠状态, 但加入ABA的合成抑制剂氟草酮( Flu2ridone) 可以有效阻止休眠的发生, 若同时加入ABA, 则氟草酮的作用被逆转。但也有研究发现, 在百合离体培养的小鳞茎中, 休眠小鳞茎与非休眠小鳞茎相比, 内源ABA含量并无差别【17】。2.2.2 在植物激素方面, 以往的研究多侧重于单一激素对休眠的影响, 但起决定作用的是各激素间的互作关系。因此, 系统全面地研究鳞茎休眠的发生与解除过程中各激素间的互作关系, 深入研究各激素调控作用与物质转化间的关系, 对于研究鳞茎休眠机理具有重要的意义2.3 低温和激素两方面结合对于打破百合休眠效果更佳方少忠等【18】实验表明用GA3 50 mg/L + CEPA100 mg/L + KT100 mg/L 组合处理冷藏的百合鳞茎, 可以通过影响内源激素的平衡来促进鳞茎的萌动, 缩短冷藏的时间, 打破休眠, 促进开花。但如果没有低温诱导, 其作用效果就不明显。【19】陈海霞等实验也表明药剂处理结合适当的低温处理可以增加其打破休眠的效应。经过多年的研究,龙牙百合的组织培养技术已较成熟,并开始在百合育种、遗传转化中广泛使用。目前正在开展百合的转基因研究,将抗干旱、抗盐碱基因导入百合,旨在获得抗干旱、抗盐碱的转基因百合。【1】苏琼 龙牙百合快速繁殖研究 农技服务, 2010, 27 (4) : 521 - 522【2】罗丽萍 杨柏云 蔡奇英 章敏华 龙牙百合的组织培养 植物生理学通讯第37卷第6期, 2001年12月 527-528【3】杭玲 苏宾 陈丽新 苏国秀 程汤 黄卓忠 龙牙百合组培快繁技术研究 广西农业科学 2001 年第4 期183-184【4】 杨柏云, 罗丽萍, 高荫榆 龙牙百合脱毒技术的研究 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri . 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