荧光定量PCR实验报告.doc

荧光定量PCR实验报告目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。一、实验原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。本实验主要采用SYBR荧光染料。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二、实验试剂和器材因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂：逆转录酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司，合适的抑癌基因A的引物、-actin引物。器材：ABI 7300 Real-Time PCR SystemRS-28高速低温离心机超低温冰箱 微量移液器三、实验步骤，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点, 用抗癌药A在0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA反转录（RT）: 反转录反应液组成如下表：Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chainComponentVolume（ml）Concentration5R.T.buffer*51dNTP2.510mM/ mlRNasin220U/ mlRNA5.38mgRandom Primer10.1ug/ mlM-MLV65 U/ mlNucleasr-Free Water 3.2Total25 42反转录50min，95 5min灭活反转录酶。Syber Green 荧光定量PCR检测：在冰上按下表加样，PCR反应液组成如下表：Table 2 Mixed components for polymerase chain reactionComponent Volume （ul）R.T.product12Master Mix10Primer1+1H2O7Total20PCR板的设置如图中所示：PCR热循环参数：96 4min，然后三步反应：94 30S，58 30s，72 30s，进行40个循环，于每个循环的第三步即：72 30s收集荧光信号。最后在72 保温7min。3 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。四、实时荧光定量PCR结果分析:扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等，如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线。以-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。五、注意事项PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m滤膜过滤除菌或高压灭菌。试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够