硝酸盐、盐度和无机碳对Porphyra torta(红藻门)幼配子体生长和色素的影响——外文翻译.doc

硝酸盐、盐度和无机碳对Porphyra torta（红藻门）幼配子体生长和色素的影响关键词：紫菜，海藻，海水养殖，生态生理学，氮，盐度，无机碳，增长速度， 藻红蛋白，色素摘要Porphyra torta Krishnamurthy（红藻门）配子的绿叶阶段，是一种在阿拉斯加海水养殖的候选种类，仅在冬季和早春生长，并仅限于阿拉斯加东南部外海岸。为了帮助确定限制这个种类的季节性和地理分布的具体环境因素，利用三个物理因素的现实环境水平进行培养实验。在代表每个因素的最高和最低水平的硝酸盐、盐度和无机碳的组合下比较幼配子体的生长和藻红蛋白的含量。复苏实验同时进行，以确定是否受低硝酸盐或盐度影响的叶片能够恢复正常生长速度和色素水平。为了在统计上作出有效的处理组生长率的比较，进行重复试验，测试了两阶段分析，并证实是适当的。低硝酸盐对于生长和藻红蛋白含量有重大的负面影响。盐度对于叶片生长有微弱的负面影响，然而无机碳既对叶片生长没有影响，对藻红蛋白含量也没有重要影响。受低硝酸盐影响的叶片，当增加硝酸盐含量时，在长达6个星期的处理后，能够恢复正常的生长速度，并高于正常水平。随着时间一开始增加，由数据得到的生长速率，依赖于硝酸盐水平。导言Porphyra torta是世界范围内已知的至少70种紫菜种类之一（Stiller & Waaland, 1993），是沿着东北太平洋的多岩石海滩上部潮间带区域的冬天及早春的栖居者(Conway & Cole, 1977; Waaland 等, 1990; Lindstrom& Cole, 1993)。P. torta和它的春天及早夏对应物P. abbottae是阿拉斯加东南部特林吉特人的传统饮食的一部分，叫做laakusk (黑海藻) (Betts, 1991)。Porphyra是世界上最古老和最重要的养殖作物品种之一，培育品种已经被选定并且在三百年间在今天的世界领先的生产商，日本、中国和韩国，被开发。Porphyra已经在华盛顿和美国缅因州和加拿大(Byce等, 1984;Waaland等, 1986; Mumford, 1987, 1990),但是它作为商业作物的潜力在北美仍然未发展(Merrill, 1993)。P. torta是几个北美西海岸种类之中，由Waaland等根据她们的商业潜力确定和Lindstrom (1993)根据在阿拉斯加的商业潜力确定。P. torta的生命周期是双相的，一个多叶，单一配子体和一个纤维状、二倍体孢子体或者丝状体(Drew, 1949; Conway & Cole,1977)。壳孢子的成熟和释放需要1个短的光周期12h或者更少(Waaland 等,1987)。这种刺激也许加上环境要求，对P. torta的叶片生长作用(Waaland et al., 1990).阿拉斯加东南部的P. torta仅限于整年盐度稳定，大约在30ppt的外面海岸地区。在内水域中，盐度季节性变动，10ppt或者更少(Conitz,1999)。这项研究涉及的问题是，低盐度是否对P. torta有限制。港湾和上部潮间带藻类通常有更广泛的耐受盐度(Russell, 1987),能经常忍受盐度短期变化，没有完全渗透调节(Kirst, 1995; Reed, 1990)。无机碳的稀释能够混淆盐度对在低盐培养基中海藻光合作用的影响(Ogata & Matsui, 1965; Ogata & Schramm, 1971;Ohno, 1976)。在东南阿拉斯加沿海水域，在强的淡水稀释期间，总无机碳能从它至少2.0meq L1的典型水平下降到1.5meq L1(Conitz, 1999)。这项研究也因此调查了无机碳稀释在低盐培养基中的影响。在沿海水域氮供应随季节强烈波动，与海藻季节性增长模式相联系(Lobban & Harrison, 1994)。在东南阿拉斯加水域，硝酸盐在早冬达到它的年度最高，大约在40-45M(Conitz, 1999)。冬天，P. torta的配子体阶段的出现可能是对季节性氮循环的适应。大多数可利用的溶解无机氮，主要是硝酸盐（NO3)和氨(NH4+),在阿拉斯加水域，很快被春季浮游植物大量出现而消耗，在晚春下降到1.0M以下，在整个夏天保持那种低水平。(Conitz,1999; Ziemann 等, 1989)。在海藻中，氮素吸收、利用和储存几个途径，能够使他们在有限的氮素环境中竞争(Lobban & Harrison, 1994),包括多余氮的积累，硝酸盐、氨基酸、蛋白质、酶或者光合色素(Hwang等, 1987; Hernndez等, 1993; Naldi & Wheeler, 1999)。光合色素已经被用来作为氮素缺乏和恢复的指标(Amano & Noda, 1987),和对于江蓠属水体氮的可及性的指标(Jones等, 1996; Horrocks等, 1995)。在这些实验中，我们假设，如果硝酸盐水平微不足道或为零，P. torta将停止生长。我们有兴趣知道硝酸盐水平略高于零是否可以支持生长。硝酸盐供应对光合色素水平的关系也考虑了。最后，我们想知道P. torta叶片的氮素消耗的影响能否被逆转，以及在什么时期。Porphyra torta能够被可靠地培养通过他的生命周期，但是叶片生长和生理的具体环境因素的影响大多未知。在华盛顿州P. torta实地栽培实验中，叶片生长被测量(Waaland等, 1986)，在培养中幼叶片的生长的具体因素的作用被测定(Hannach, 1989; Hannach & Waaland, 1989)。这项研究调查了在幼P. torta叶片的生长和藻红蛋白含量对硝酸盐、盐度和无机碳原为和更低水平的依耐性。这些因素的可能的相互作用和P. torta叶片从这些因素限制中恢复的能力，被包含在实验设计中，并特别关注。材料与方法Porphyra torta Krishnamurthy丝状体(culture PtEI02a1)是1997年4月9日从阿拉斯加Elovoi岛一个叶片的单一果孢子克隆而来(5649N，13524W)。0.025g（鲜重）自由丝状体零散培养，在8h光照：16h黑暗的光周期（8：16 L:D）,光子通量密度90-110mol m2s1 (PFD) and 12 。培养基时一个用Guillard的 f/2 丰富的人工海水基地(Guillard & Ryther,1962)。水运动由Labline 3-D 旋转器，30 rpm提供。包子在一批培养31/2周后被释放在一个单脉冲，到20m网格Nitex网的基板。一星期以后首先观察萌芽及附着。在最初生长期，富集培养基硝酸盐被降低到88m（f/20），其余营养盐在f/2水平，并且每周变化。孢子释放后4周，叶片附着的各自基质片段，被放在包含10mL培养基的单独的25mL锥形烧杯中，在一个实验性处理的12组合盐度、碳酸氢盐和硝酸盐，有4个重复。通过用蒸馏水或包含2.0mm NaHCO3的蒸馏水稀释AW基地，得到三个盐度水平（30，15，7.5ppt）。因此，在每个盐度水平内，碳酸氢盐要么根据盐度稀释，要么增加到保持2.0mm浓度。每隔人工海水基地混合物的一部分硝酸盐被丰富了在88m，另一部分在2.2m；其余营养物质与f/2一样。每个因素的最高水平接近环境因素的最大水平，被指定为“正常”或对照水平。（注意，两个在30ppt盐度水平的碳酸氢盐水平实际上相同的，但为了保持一种平衡因子设计，被视为单独水平。）培养是在和孢子释放期间同样的对照环境条件下生长，在上面列出，随每周培养基变化。基线测量是在同一天，但是在实验性处理之前，这个数据被指定为week0。每周一次和以下6个星期（wks 06),随机选择没培养瓶三个叶片，用来测量和藻红蛋白（PE）分析。用Optimas 4.0 图像分析软件，从叶片的录像显微镜图像，数据测量叶片表面面积。然后为了分析藻红蛋白，叶片被冷冻在0.2m NaCl 和pH 6.7的 0.2 m H2PO4/HPO42缓冲液。每个来自两个重复培养的三个叶片样品相互结合治疗，以给于足够的材料可供提取。外表皮和细胞壁要求在藻红蛋白水提取前酶切。13单位每mL提纯的木瓜蛋白酶（Sigma）,用来消化表皮。鲍消化酶(Sigma，鲍鱼丙酮粉，原油)的一种过滤灭菌的提取物(H2PO4/ HPO42缓冲液），在最终浓度1.0 mg mL1，pH6.7,增加以被细胞壁消化（PolneFuller & Gibor, 1990)。在磷酸盐缓冲液的一个冻结-融化循环，细胞壁消化以后，藻红蛋白被提取，通过玻璃纤维过滤器被过滤(Advantec MFS)。这种方法被测试对对照标准，在实验样本提取之前记录光谱，以确保藻红蛋白光谱不会定性受酶切影响。对照在H2PO4/ HPO42 缓冲液的一个空白包含1.0 mg mL1鲍酶提取物，在700、588、565和455 nm读出藻红蛋白提取物的吸光度。最终藻红蛋白浓度使用公式计算，藻红蛋白= (A565 A588) ( A455- A588)0.200.12 ，并且以干重标准化。(Beer & Eshel, 1985)为了测试从任何实验处理的影响的复苏，在2、4和6周，一个子叶片被搬离每个培养瓶，并且运行在正常培养基生长10天。每个瓶的叶片随机取样测量，如上所述，在复苏期的开始和结束时期，分析藻红蛋白含量。生长实验的数据用量阶段或衍生变量分析来分析(Diggle等, 1994: pp. 154)。用试探性数据分析方法(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993)，叶片表面数据的-5次方跟（-0.2次方）转化，发现每个处理的面积和时间呈线性关系。在分析的第一阶段，利用转化的表面积对时间和复制品的稳健回归，得到每个处理的倾斜系数（n=4）(S-Plus 4, 1997)。在第二阶段，硝酸盐、盐度、碳X盐度的联合作用的主要影响的稳健回归系数，用方差分析研究。（Neter等, 1996）。合适尺寸被转换为原始尺寸大小，从模型的区别得到瞬时增长率。利用每周数据，方差分析硝酸盐、盐度、碳X盐度的主要影响以及硝酸盐和盐度对藻红蛋白浓度的联合作用。对于复苏数据，在10 天复苏期结束到实验处理的最后一天期间，利用方差分析叶片表面积（生长复苏）和藻红蛋白含量(藻红蛋白复苏)的不同。使用诊断和探索型数据分析方法检测假设方差分析模型的每个数据(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993; S-Plus 4,1997)。结果叶片生长 (图1) 6周，盐度、无机碳和硝酸盐12个实验性处理组合下的幼P. torta叶片的生长。盐度水平是30、15、7.5ppt(1x、0.5x、0.25x正常环境水平)。盐度内嵌套的一个因素无机碳，要么像碳酸氢盐一样被增加到2.0mm,或者稀释到同盐度一样的水平。高硝酸盐是88m，低硝酸盐是2.2m，（大约分别是2X最大值和略高于极小的环境水平）。每周测量叶片表面积，n=4。用黄色光滑曲线表明生长趋势。The P. torta叶片在所有处理中经过6周实验期生长，但生长根据处理变化(图1)。F-tests的健壮回归系数对硝酸盐有意义，p=0.021。在低硝酸盐组中所有盐度水平和碳X盐度水平的生长率降低。生长率也随着盐度而下降，但差异微弱，p=0.079。t时叶片大小的模型是：y，=0i + (. + i ) t + , i = 1,.,m，其中y，是叶片面积的-0.2次方的转化，0i是i组初始面积的-0.2次方转化，.是所有组的总平均值，i是在i水平硝酸盐的解释性变量，是误差项。其余可能的解释变量，盐度和碳，不包含在内，因为它们不显著，p 0.05。叶片面积由方程预测，面积area=( y)5。t时瞬时增长率由方程预测，生长率=d(面积)/dt = 5(. + i) / 0i + (. + i ) t6。根据这一模式，生长率随时间开始增加，并且增加的速度取决于硝酸盐水平。8-10周以后，由模型预测的指数生长变得不切实际，这表明在后期阶段其他因素肯定调节生长。藻红蛋白含量（表1）在实验开始之前测量在幼Porphyra torta叶片的藻红蛋白含量，每周一次，共6周。在盐度、无机碳和硝酸盐的12组合之一的处理，用每个样本的3块样本的吸光度计算藻红蛋白，数据是每隔处理的样本（n=2）。在开始的第一周，低盐培养基的叶片生长中，藻红蛋白明显减少(表1)。在实验环境（wk 0）,叶片处理之前，在所有组之间藻红蛋白没有显著差异。在1至2周的实验处理曝光后，硝酸盐对藻红蛋白含量有一个重大作用，分别为p=0.009和p=0.016。在3-6周的实验条件处理后，硝酸盐持续对藻红蛋白含量有重要影响，每周p 0.001。碳X盐度，硝酸盐X盐度互交作用对藻红蛋白含量的影响在所有周内都是无意义的。藻红蛋白浓度的平方根转化改进了在多数星期中的分析合适度，在诊断残差基础上。生长复苏（表2）2，4或6周，P. torta叶片在盐度、无机碳和碳酸盐的低水平的处理的生长复苏，然后返回到正常环境10天。正常环境是30ppt，碳2.0mm和硝酸盐88m（对照组，第一行，整个实验中在这些条件处理）。（注意，在当盐度30ppt时，既然海水培养基在那一水平不被稀释，碳的“增加”和“稀释”水平是相同的。）一般，叶片接触低硝酸盐、盐度和碳，2周和四周，恢复生长率相当于那些在10天复苏期间，来自对照营养和盐度水平的（表2）。在这些时间段，复苏生长期间，群体间生长没有显著差异。在复苏期，在总体低硝酸盐处理组，在6周处理后，大幅减少生长(p=0.043)。然而，群体接触低盐度/低硝酸盐组合6周后，在复苏期有显著较高的生长（硝酸盐X盐度交互作用，p=0.042）。藻红蛋白复苏（表3) 2，4或6周，P. torta叶片在盐度、无机碳、和硝酸盐的低水平的处理的藻红蛋白含量的复苏，然后返回到正常环境10天。正常环境是30ppt，碳2.0mm和硝酸盐88m（对照组，第一行，整个实验中在这些条件处理）。（注意，当盐度30ppt时，既然海水培养基在那一水平不被稀释，碳的“增加”和“稀释”水平是相同的。）在10天复苏期，氮耗尽叶片显著增加藻红蛋白含量（表3）。在复苏期结束时，氮耗尽叶片的藻红蛋白含量一般超过未被耗尽的叶片。复苏显示在，低硝酸盐中处理的组比其他组的藻红蛋白含量有一个更大的积极变化，在2周处理后，p=0.020;4周和6周处理后，p0.001。4周处理后，盐度对藻红蛋白含量的恢复有重要影响，p=0.014。在复苏期，在15ppt盐度，低硝酸盐中处理的组藻红蛋白含量显著增加(硝酸盐X盐度交互作用，p=0.002)。讨论观察幼P.torta叶片的最初缓慢增长，表明存在滞后期，在这期间，氨基酸和蛋白质的细胞库逐渐建立，其次是，结构蛋白的细胞分化和别的组成部分的生产的更快速生长和增加。在6-8周，P.torta在生殖成熟的时候能预测生长的缓慢(Waaland等, 1990)，并且与衰老过程相联系(Hernndez等, 1993; Flores-Moya等, 1997)。各种各样的附着物和萌芽时间和个别生长率，这些混淆因素分析，提出单个叶片的差异问题，被观察。既然叶片来自同一果孢子，那么很少能预测遗传变异。P.torta萌芽和生长可能是密度制约(Conitz, 1999)。幼P.torta叶片的生长和藻红蛋白含量高度依赖在硝酸盐水平。在低硝酸盐处理的2-6周，有一个生理过程的渐进的损伤，如下所示，与2和4周处理后复苏量相比，在6周处理后，叶片减少复苏量。直到4周的处理，生长都没有受到影响，而在第一周的实验，藻红蛋白含量对低硝酸盐处理呈消极反应，并且在第三周达到最小水平。成长反应的滞后与色素含量的观察标胶，表明叶片最初用藻红蛋白含量作为一种储备氮源。在这个实验中，使用非常幼小的叶片，滞后期至少是3星期。当培养基中重新供应硝酸盐时，藻红蛋白含量大幅增加。紫菜、江蓠和其他红藻，在氮限制时期，可能使用储存氮作为有机化合物(Bird等, 1982; Hwang等, 1987;Kain & Norton, 1990)。如果每两周给予一个单脉冲氮，江蓠能够获得和储存足够的氮，用来无限增长(Ryther 等,1981)。藻红蛋白作为江蓠中氮存储化合物。G. tikvahiae中藻红蛋白含量构成总氮的20%，但是在可观察到的生长下降之前的氮限制的2周半的滞后期明显下降(Lapointe & Duke, 1984)。在江蓠氮限制生长期，作为氮源，藻红蛋白代谢在无机氮和氨基酸后，但是在其他蛋白质前，并且在外部NO3增加时，它在其他蛋白质后被人工合成(Bird等, 1982)。在最近的G. pacifica的藻红蛋白量化中，藻红蛋白相当于总氮的5-6%。不同含氮化合物的存储的相对贡献随种类变化。在Porphyra umbilicalis，发现当某些红藻藻红蛋白包括60%的总可溶性蛋白，藻胆蛋白占可溶性蛋白的15-20%(Hernndez等, 1993)。既然在一周内氮限制影响藻红蛋白含量，它可以作为一种评估野生或栽培紫菜的氮状态的快速、可行的方法。日本的海产养殖者和研究者很早就认可了由高浓度叶绿素、类胡萝卜素、藻红蛋白和藻蓝蛋白造成的栽培紫菜或紫菜的理想黑色，与环境中氮的供应的关系。受精作用研究显示，在条斑紫菜活跃生长中，在长达8天的氮耗尽期，色素含量快速恢复(Amano & Noda, 1987)。在使用标准水溶液从幼P.torta叶片中提取藻红蛋白时，遇到了意想不到的困难。通常情况下，提取藻胆蛋白时，红藻组织必须被冷冻和解冻或在磷酸盐或其他水溶液中研磨(如 Beer & Eshel, 1985; Hernndez等, 1993; Naldi & Wheeler, 1999)。用在这些实验中的叶片及其耐冻，并且太小，以至于不能研磨，定量测定。表皮和细胞壁的酶切在不改变提取物的吸光谱的情况下，有效地解决了这一问题。盐度的结果是不确定的。在这次和前几次实验的低盐水平处理，包括畸形、细胞死亡和容易分散阻止的叶片的质的差别，被显微观察(Conitz, 1999)。虽然，观察到随盐度生长下降，但是统计显示只有一个微弱的关系。有趣的是，在低硝酸盐与低盐度的组合的处理的叶片明显看到显著复苏。在复苏期，盐度增加的离子平衡改变，也许促进了硝酸盐的吸收。在这些实验中，无