分子标记技术及其在园林植物遗传育种中的应用 精品.doc

分子标记技术及其在植物遗传育种中的应用近年，随着生物技术的快速发展，分子标记技术在诸多领域得到应用，尤以农业、医药业、畜牧业等行业应用得最多。分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。分子标记的出现，使植物育种的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育种的有效性，因而在遗传育种领域愈来愈受到重视。在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致分为两大类：一类是以Southern杂交技术为核心的分子标记(如RFLP)，此类被称为第一代分子标记；以PCR技术为核心的分子标记(如STS、RAPD、AFLP、SSR等)称为第二代分子标记，单核苷酸多态性(SNP)标记称为第三代分子标记，这也是以PCR技术为基础的分子标记技术。现分别介绍其原理及在植物育种上的应用。1分子标记在植物育种上的特点分子标记育种(molecular mark-assist selection，MAS)是借助分子标记在DNA水平上对遗传资源或育种材料进行选择，对作物产量，品质和抗性等综合性状进行高效改良，并针对目标性状基困连锁进行优良植株筛选，是现代分子生物学与传统遗传育种相结合的新品种选育方法。与传统育种相比分子标记的优势是：(1)传统育种通过性状间接筛选目的基因，分子标记则通过直接与目的基因连锁进行筛选，因此，后者比前者准确，特别是在一些表现型与基因型之间对应关系较差时的筛选，(2)传统育种需要在成熟期才能筛选，分子标记筛选则可以不受植物生长发育期的限制，在苗期就可以筛选，而且不影响植株生长，(3)传统方法一次只能标记一个基因，分子标记筛选则可以同时筛选多个目的性状基因，(4)分子标记筛选利用了控制单一性状的多个等位基因，避免了传统育种通过表现型而获得不纯植株的缺陷；(5)分子标记筛选样品用量少，可以进行非破坏性筛选，从而加速育种进程，提高育种效率。2常用分子标记的技术及其在植物育种上的应用2.1限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP，简称限制片段长度多态性) RFLP是以分子杂交技术为基础的标记技术，其原理是碱基的突变、缺失、重排或是一段DNA的重排或插入，导致限制性内切核苷酸酶的酶切位点分布发生改变，得到的切割片段在数量和长度上不同，从而产生多态性。用限制性内切酶切割基因得到不同片段，然后经琼脂糖凝胶电泳分离，印迹到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用DNA探针与同源序列杂交，经放射自显影或酶学检测。RFLP的优点是检测到的等位基因具有共显性，能区分纯合子和杂合子，能稳定遗传。 甘娜16等（20XX）利用RAPD、叶绿体和线粒体基因组PCR2RFLP标记系统评价了大花蕙兰20个品种的遗传多样性。其结果表明RAPD标记揭示的大花蕙兰遗传多样性最高, 其次为cpDNA PCR-RFLP标记, 而mtDNA PCR-RFLP标记揭示的遗传多样性最低。但是大花蕙兰的叶绿体和线粒体基因组比较保守, 遗传多样性较低, 不能作为聚类分析的依据。 张立平29等（1996）提出简便易行的葡萄染色体DNA的提取纯化方法，并对部分葡萄种及品种进行RFLP鉴定，以期用分子生物学方法完善我国葡萄分类，也为其它果树分类提供借鉴。 2.2 随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphism DNA，RAPD) RAPD以DNA聚合酶链式反应(PCR)为基础，它的引物是一段任意寡聚脱氧核糖核苷酸单链片段(长度通常为810 bp)，在基因组DNA上随机引物都有特定的结合位点区域。一旦此区域的碱基突变或是DNA插序、重排、缺失，均会引起结合位点分布的变化，从而引起PCR扩增产物在数量和长度上不同，产生多态性。加人随机引物，进行PCR扩增，得到长度不同的DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色显示相应区域内DNA的多态性。由于使用多个引物，多态性的检测可以扩大到整个基因组，因此RAPD可用于构建基因指纹图谱。 RAPD1(20XX)技术操作简便，已大量应用于品种鉴定、遗传图谱的构建及进化关系研究（Kuginuki et al.，1997；徐炎等，20XX；谭雪等，20XX；Ramchiary & Lim，20XX），存在稳定性和重现性较低的不足（Jones et al.，1997）。 朱华武18等（20XX）为探明茄子抗青枯病的遗传机制, 用RAPD技术对供试材料的抗青枯病基因进行了研究。其结果是找到了一个与茄子抗青枯病亲本S3中的抗病基因紧密连锁的分子标记S264780，该标记与S3的抗病基因的交换值为432% , 遗传距离为433 cM。但是试验中在抗病亲本S3和F2代抗病池中均能扩增出S264780 , 而感病亲本北京六叶茄和F2代感病池均缺失这条带。 徐炎22等（20XX） 以感病抗病的葡萄种间杂交组合白玉霓塘尾的F1代17个单株及塘尾自交一代16个单株为试材, 采用BSA法和RAPD 技术, 通过对155个随机引物的筛选, 获得了一个与中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的RAPD标记OPP09-760 , 并在中国野生葡萄8 个种的32个株系及欧洲葡萄16个品种中得到验证。但是本研究获得的刺葡萄塘尾抗白腐病基因RAPD标记OPP09-760 ,仅为研究抗白腐病基因提供了一个突破点, 更多的RAPD标记及其与抗白腐病基因位点的距离及定位作图是诸多学者正在进行研究的内容。秦贺兰25等（20XX）用RAID技术分析了18个菊花品种DNA的多态性，其结果检测出两个品种特有的分子标记，大红托桂有OPD15 (1200 bp)玉翎管缺失OPAl7(1100 bp)。瓣型一致的品种间基因型相似系数较高。但是本试验中筛选出的3个引物扩增出的多态性条带不能将黄秀芳和白秀两个品种的菊花花色区分开。罗素兰26等（20XX）利用随机扩增多态性DNA (RAPD) 在一个葡萄的种间杂交组合的F1 群体中发展分子标记,共产生了89 个稳定的RAPD 标记,连同4 个形态标记(花型、霜霉病抗性、果皮颜色、果汁颜色) 构建了一个葡萄RAPD 分子连锁图。为毛葡萄连锁图谱的构建提供了一个连锁框架。但是在图谱上进行更多形态性状的基因定位或找出与目标性状相连锁的其它标记, 是需要进一步填充更多的RAPD 标记。王跃进28等（1997）用RAPD技术分析了葡萄属圆叶葡萄亚属及真葡萄亚属美洲种的相关性。2.3扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism，AFLP)AFLP是通过限制性内切酶切割DNA产生不同长度的DNA片段来检测DNA的多态性。其原理是用限制性内切核苷酸酶酶切DNA，在DNA片段的两端加上带有特定序列的。接头”，然后用与接头互补的3/端带有几个随机选择的核营酸引物进行特异PCR扩增。只有与3/端严格配对的DNA片段才能扩增。3/端的核苷酸序列决定了DNA片段的特异性。最后用高分辨率测序凝胶将扩增产物分离，用放射性自显影或银染法检测。该技术1(20XX)可在不了解某物种任何DNA 信息情况下用于DNA 多态性的检测，且多态性丰富，重复性高，稳定性好，是一种较为理想和有效的分子标记，被广泛地应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因表达调控研究等（Guo et al.，20XX；Zhao et al.，20XX；Ramchiary & Lim，20XX；Shi et al.，20XX）。但操作相对较为复杂，成本较高，通常需要同位素、荧光或银染观察多态性，且多态性条带较难以转换成操作简单的PCR 标记（Guo et al.，20XX）。赵婷婷2等（20XX）以番茄抗叶霉病的品种05HN36为母本，以感病品种051355为父本配置杂交组合，以亲本及其F2分离群体为研究材料，采用AFLP 技术筛选与抗叶霉病基因Cf12 连锁的分子标记。其结果是通过对545对引物进行筛选，获得了6个连锁的AFLP标记。但是AFLP 的成本高和操作复杂等缺点限制了它在育种工作中的实际应用。刘富中10等（20XX）采用AFLP分析技术和改良BAS法，通过512对EM引物组合的筛选，获得1个与茄子单性结实基因紧密连锁的AFLP标记E75M53-70，该标记与单性结实基因间的遗传图距为1538cM，可用于茄子单性结实性的鉴定和单性结实分子标记辅助育种，加速茄子单性结实基因的转育和利用。但是通过试验可知茄子单性结实的遗传机制较复杂，存在多个单性结实基因的控制，不同材料的遗传特性不尽相同。唐美玲11等（20XX）利用AFLP分子标记技术, 筛选与山葡萄性别相关的分子标记, 同时将其转化为简单实用的SCAR标记, 可加快葡萄育种进程。但是AFLP标记具有操作程序复杂、成本高等缺点。因此, 有必要将与山葡萄性别相关的AFLP标记转化为简单实用的SCAR标记，并且用于山葡萄分子标记辅助育种。罗建华14等（20XX）以抗病的秋棚和感病的欧洲8号杂交获得的115份重组自交系(RIL)为材料, 采用集团分离分析法(BSA) 和AFLP技术进行了黄瓜抗ZYMV-CH遗传规律和连锁分子研究，并将其转化成共显性的SCAR 标记SCAR3-109，作为黄瓜抗ZYMV辅助选择的分子标记。但是遗传学家早就对黄瓜抗ZYMV-CH基因的遗传进行了研究, 认为抗性受隐性单基因控制，但本试验中也存在微效基因的作用。 顾兴芳15等（20XX）运用AFLP技术, 采用集群分析法(BSA) 进行与黄瓜果实苦味基因连锁的分子标记的研究,找到了与苦味基因连锁的两个显性AFLP标记: E23M66-101和E25M65-213，可用于无苦味黄瓜的分子标记辅助育种。但是本试验中对E23M66-101和E25M65-213采用Blast软件在GeneBank数据库中进行查询，未发现与这两个片段相似性高的片段，说明这两个片段为新发现的黄瓜的DNA序列。 娄群峰17等(20XX)利用AFLP标记结合银染技术获得了与黄瓜全雌性位点连锁距离为6.7cM的标记,并成功地将其转化成操作简便、表现稳定的SCAR标记,该标记命名为SA166。但是在本研究中与TG/CAC234标记连锁的雌性基因对黄瓜全雌性表型具有决定作用, 其可能是一个决定全雌性的关键性基因, 但其是否为F基因则需要进一步的验证。李锡香21等（20XX）采用AFLP分子标记技术，对中国黄瓜种质资源遗传多样性及其与外来种质的关系进行了分析，结果表明8对AFLP引物在70份黄瓜种质中共扩增出425条带，多态性带的比例为66。聚类分析将70份种质分为三大组群，即西双版纳黄瓜组群，野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。大多数华南型和华北型种质归属于不同的亚组。这些结果有助于有目的地利用这些变异拓宽育种材料的遗传背景。但是在本研究中，虽然大多数形态特性类似的种质被聚在了一起，但是依据AFLP标记的分类与种质的形态特征和生态特性的分类也有不相一致的。并且AFLP的检测效率在不同作物或同种作物不同材料中差异较大。2.4简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)SSR叉称微卫星DNA，是由16个核苷酸基序串联重复组成的DNA序列。常见的是二核苷酸重复序列如(AT)n、(TG)n，这种序列广泛分布在基因组的不同位置，其重复单位具有高度的可变性，其多态性来源于重复数量的不同。在不同个体中，重复序列出现的频率不同，造成了个体之间的多态性。基因组中某一特定的微卫星DNA的侧翼序列通常是保守的单一序列，通过测定侧翼序列，根据其互补序列设计引物，通过PCR扩增微卫星片段。由于核心序列重复数量不同，从而扩增出不同长度的DNA片段。最后将扩增产物进行聚丙酰胺凝胶电泳。在SSR基础上发展起来一种简单序列间区重复多态性(intersimple sequence repeat polymorphism ISSR)标记，是用两个相邻SSR区间的引物去扩增单拷贝序列，然后通过电泳检测。引物是由2-3个核苷酸作为基元，以不同重复次数再加几个非重复的锚定碱基组成的随机引物，如(AC)nX、(TG)nX。它避免了SSR种问的特异性，且开发费用低、精度高，目前用于遗传作图，品种鉴定、遗传分化等领域。高颖3等（20XX）以190份大白菜种质材料为试材，利用分布于全基因组的30个SSR标记和27个InDel标记，全面分析其群体结构，进行抽薹时间、开花时间与分子标记的关联分析。其结果是，发现13个标记的17个位点与抽薹时间和开花时间相关，其中15个与抽薹时间相关，12个与开花时间相关。10个位点同时与两个性状相关联。但是通过本研究可发现遗传组分的混合程度是有所不同，遗传组分相对单一的基因型与遗传组分混合程度高的基因型的遗传背景相对差距较远，适合作为亲本材料配置杂交组合。李慧4等（20XX）基于中国48个平菇栽培品种的11对SSR分子标记数据，参照位点优先取样策略，提出了针对小样本容量的原种质在构建核心样本过程中取样量的确定方法，以期为平菇栽培品种核心样本的构建提供方法依据。结果表明：采用位点优先取样策略，在等位基因保留比例为95%的水平上构建的核心样本能够以最小的样本量最大限度地代表原种质的遗传多样性。但是本研究筛选的11个SSR位点，仅分布在糙皮侧耳全基因组12个nuclear scaffold 中的4个，所以对于该平菇种质遗传多样性的检测还不够全面，还需对覆盖糙皮侧耳全基因组范围的SSR位点进行进一步的开发。张水明5等（20XX）通过SSRIT软件对NCBI数据库已收录的8188条蝴蝶兰EST进行分析，开发了更多新的蝴蝶兰EST-SSR标记，其结果表明设计开发的蝴蝶兰的EST-SSR标记是有效的。但是本研究的结果与其他学者的同类研究有一定的差异，其原因是是SSR搜索标准不同。时秋香8等（20XX）利用黄瓜近等基因系纯雌株W1983G (基因型为FFMM ) 与两性花株W1983H (基因型为FFMM ) 为亲本, 以W1983H为回交亲本构建了BC1代分离群体, 采用SSR及SCAR分子标记技术, 获得了3个与M 基因紧密连锁的标记SSR23487、SCAR123 和SSR19914, 这3个分子标记的获得不仅可以用于分子标记辅助选择育种, 而且为最终M 基因的克隆打下了基础。但是本研究中受近等基因系及SSR位点全基因组扫描进行引物设计等因素的限制, 所得的分子标记偏少。卢江30等（1995）应用12对SSR引物对39个葡萄品种的基因组DNA进行扩增，扩增出了155条不同分子量DNA条带，其中多态性位点149个，占96.13。依据SSR特征谱带，可直接鉴别出供试品种；根据聚类结果，在相似系数为0.66时可将供试39个葡萄品种划分为3个类群，绝大部分系谱相同或相近的品种聚到了一起，不同地域起源的品种间界限不明显。2.5序列特异性扩增区域(sequence characterize amplification region，SCAR)SCAR是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记。其原理是对基因作RAPD分析后，选取目的DNA片段克隆，对其末端测序，根据末段序列设计引物。以此引物对DNA再进行特异PCR扩增，可以鉴别与原RAPD片段相对应的单一位点。由于引物较长，具有重复性和稳定性，主要用于基因定位及遗传作图。国艳梅19等（20XX）结合SCAR标记的原理与多引物PCR技术, 建立了共显性标记技术Codominant2SCAR。利用该技术对12份番茄近等基因系进行了遗传鉴定, 结果表明该方法具有重复性好、迅速、简便、成本低的特点, 可用于番茄和其它作物的分子育种。江海坤6等（20XX）CRF-SCAR分子标记辅助筛选恢复系，对20XX年秋20XX年秋利用引进的CMS不育源作转育母本，配合力自交系材料HY13作轮回亲本进行3年6个世代的回交，为辣椒雄性不育系及其恢复系选育提供参考。但是本研究只是进行初步的实验。2.6酶切扩增多态性序列(cleaved amplification polymorphism sequence tagged sites，CAPs)CAPs实质上是PCR技术与RFLP技术相结合的一种方法。PCR引物是针对特定位点设计的，根据已知位点DNA序列资源设计的PCR引物对特异位点的某一DNA片段扩增，接着用专一性很强的限制性内切酶切割扩增产物。经凝胶电泳、分离、染色观察其多态性。 王孝宣20等(20XX)建立了同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi)和抗叶霉病基因(Cf5)的Mutip lex-CAPS技术,并利用该技术检测了12份番茄材料含有的抗性基因。但是在本研究中利用Multiplex-CAPS技术对12份番茄是否含有Mi和Cf5基因，没有出现同时含有这两个基因的植株。王孝宣23等（20XX）应用MultiplexPCR和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)原理研究建立了MutiplexCAPS技术。利用该技术对番茄TA517及其近等基因系的分析表明，MultiplexCAPS能同时检测2个、3个或多个CAPS标记的多态性，其效果等同于每个CAPS标记的多态性的叠加，重复性好，分析效率高，降低成本数倍。但是MultiplexCAPS存在缺点，需要用先PCR Buffer，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳提高酶切产物的分辨率，可以克服其缺点。2.7简单序列重复间区（intersimple sequence repeat，ISSR) ISSR是以一种锚定引物(SSR引物添加碱基)PCR为基础的分子标记。该技术是利用锚定引物与特定位点互补的重复序列间的DNA片段进行PCR扩增，其产物的差异性表现为物种间(内)的多态性，具有引物通用、多态性高、信息量大、检测方便等优点。目前该技术已广泛应用于植物遗传图和指纹图谱的构建、遗传多样性及亲缘关系的研究、物种进化及系统分类研究、品种鉴定等研究中。朱元娣24等（20XX）以普通型苹果品种富士和柱型苹果舞姿以及其杂交后代的柱型与非柱型实生苗为试材, 建立了苹果的ISSR分子标记体系, 并将ISSR标记用于苹果柱型基因Co 的遗传分析。其结果是获得了35个ISSR标记, 其中33个标记呈现11分离,可用于苹果柱型基因的遗传分析。但是在本试验中在可以检测区域的片段由于琼脂糖凝胶电泳分离能力，一些多态性片段不能被检测到。吕琳13等（20XX）采用ISSR分子标记技术对来源于不同地区的19份要用菊花种源、4份野菊种源、1份菊花脑种源和一份杂交菊花黄金菊种源进行了遗传关系分析。聚类分析结果表明：种源可分成2大类，即野菊、菊花脑、杂交菊花归为一组，19份药用菊花种源归为一组；19份药用菊花种源又可根据原产地进一步分成2组，大部分原产北方的药用菊花种源的遗传关系较近，而大部分南方栽培的药用菊花种源也有相对较近的遗传关系。但是通过本实验可发现有些ISSR引物反应不稳定，可能是由于ISSR引物含有重复序列，与它结合的基因组DNA内靶序列在DNA复制过程孛存在滑动翻不均等现象，在不同品种或个体之间的重复次数差算较大，易引起引物结合位点和两结合位点间片段长度的差异。2.8 SCoT目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT） SCoT标记是Collard 和Mackill从水稻上提出的一种基于单引物扩增反应（single primer amplification reaction，SPAR）的新型分子标记，是一种新的目的基因分子标记，其原理是根据植物基因中的ATG 翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增，产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，并且操作简单，多态性丰富。韩国辉7等（20XX）采用正交设计方法，对影响柑橘SCoT-PCR 反应的Mg+2、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶及模板DNA 用量等因素进行优化，建立了适于柑橘的SCoT 标记分析体系。研究结果表明建立的柑橘SCoT体系结果稳定，重复性好，可为柑橘遗传育种提供新的技术支持。但是由于SCoT反应结果受材料、反应体系等因素的影响很大，有必要对SCoT-PCR 体系进行优化。2.9 ISTR反向序列标签重复技术( inverse sequence2tagged repeat, ISTR) ISTR是一种基于逆转座子的分子标记。ISTR标记较AFLP等常规分子标记灵敏, 因使用的是通用引物, 故与其它以物种特异性引物为前提的逆转座子分子标记类型相比, 可以免去前期逆转座子引物开发步骤, 降低试验成本和提高效率。杜晓云9等（20XX）利用反向序列标签重复技术，对柿属7个种共32个基因型进行了种质鉴定和亲缘关系研究。结果表明: ISTR可区分供试柿属植物中的30份;ISTR能够很好地适用于柿属植物亲缘关系分析;供试的中国与日本原产柿种质分别聚类;新发现的中国甜柿变异类型与日本甜柿的亲缘关系较远且存在较丰富的遗传变异, 可能是潜在的育种资源。ISTR标记可在柿属植物种质资源鉴定和亲缘关系分析中更广泛地应用。但是本试验中新发现的稀有的中国原产完全甜柿，目前尚未用于育种实践中。2.