实验3薄层板的制备及活化.ppt

1 天然产物化学 生物技术及应用专业 2 实验三薄层板的制备及活化 硅胶板 3 薄层色谱简介 薄层色谱中的吸附剂是铺在玻璃 塑料或金属片或薄板上的较薄的 均匀的一层细粉状物质 因支持剂的种类 制备方法和选用溶剂的不同 可按吸附 分配或二者结合的方式达到分离化合物的目的 TLC中涂布的物质如硅胶 氧化铝 聚酰胺等 硅胶是最常用的薄层色谱吸附剂 4 可以通过比较斑点的Rf值 或将未知样品与对照品在同一板上展开至同样高度 对样品进行初步的鉴定 还可通过比较可见斑点的大小进行半定量的判断 还可以通过光密度测量法实现定量测定 5 一 目的要求 1 掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法 2 掌握吸附剂活度测定的原理及方法 3 会应用薄层层析法检测识中草药化学成分 6 二 薄层板的制备 1 不加粘合剂的薄层涂布法 1 氧化铝薄层 2 纤维素薄层 3 聚酰胺薄层2 加粘合剂薄层的涂布法 1 硅胶G薄层 2 硅胶 H 羧甲基纤维钠 CMC Na 薄层 7 1 氧化铝薄层 将吸附剂置于薄层涂布器中 调节涂布器的高度 向前推动 即得均匀薄层 本实验主要用下述简易操作涂布薄层 取表面光滑 直径统一的玻璃一支 依据所制备薄层的宽度 厚度要求 在玻璃棒两端套上厚度为0 3 1mm的塑料圈或金属环 并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环 以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向 操作时 将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上 匀速向前推动 8 2 纤维素薄层 一般取纤维素粉1份加水约5份 在烧杯中混合均匀后 倒在玻璃板上 轻轻振动 使涂布均匀 水平放置 待水分蒸发至近干 于100 2 干燥30 60分钟即得 9 3 聚酰胺薄层 取锦纶丝经一系列加工使其完全溶解成透明胶状溶液 将此溶液适量倒在水平放置的洗净的玻璃片上 并自然向周围推匀 厚度约0 3mm 薄层太厚时 干后会裂开 完全固化后变不透明白色 再放数小时后 泡在流水中洗去甲酸 先在空气中晾干 后在烘箱中0 恒温加热活化15分钟 冷后置干燥器中贮存备用 10 1 硅胶G薄层 取硅胶G或硅胶GF一份 置烧杯中加水约3份混合均匀 加水量根据实际情况自行调整 放置片刻 随即用药匙取一定量 分别倒在一定大小的玻璃片上 或倒入涂布器中 推动涂布 均匀涂布成0 25 0 5mm厚度 轻轻振动玻璃板 使薄层面平整均匀 11 在水平位置放置 待薄层发白近干 于烘箱中105 活化0 5 1小时 冷后贮于干燥器内备用 活化温度和时间可依需要调整 一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时 所用薄层板只在空气中自然干燥 不经活化即可贮存备用 12 物质之所以能在吸附剂 以硅胶 氧化铝或正相键合硅胶为例 的薄层上分离 是因为吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许多活性点 被吸附物质 极性或可极化的物质 的量及被吸附的牢固程度在其它条件一定的条件下取决于活性点的强度 单位面积的表面能量 及数目 单位质量的表面积 单位质量吸附剂所含活性点的数目越多 活性点的强度越大 则吸附剂的活度越高 即 对物质 极性或可极化的物质 的吸附能力越强 被吸附物质的Rf值就越小 13 当此类吸附剂的含水量增加时 吸附剂的活性点被水中羟基占据的数目增多 因此 自由活性点减少 吸附剂的活度变小 吸附力也变小 于是被吸附物质的Rf就变大 因此 为了使薄层板的水分含量相对一致 使用对薄板进行活化可以使Rf值具有较好的重现性 14 2 硅胶 H CMC Na薄层 取羧甲基纤维素 CMC Na 0 2g 溶于25ml水中 在水浴上加热搅拌使完全溶解 倒入烧杯中 加薄层层析用硅胶 颗粒度10 40 m的约6 8g 混成均匀的稀糊 按照硅胶G薄层涂布法制备薄层 轻摇均匀涂布 15 或取0 8 羧甲基纤维纳10ml 倒入广口瓶 高约10 12cm 中 然后逐步加入薄层层析用硅胶3 3克 不断振摇成均匀的稀糊 把两块载玻片面对面结合在一起 这样每片只有一面与硅胶糊接触 使薄片浸入硅胶稀糊中 然后慢慢取出 分开二块薄片 将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上 让其自然阴干 100 下烘30分钟 冷后于干燥器内备用 未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内 以供再用 16 三 仪器和试剂 玻璃板 5 10cm或2 5 7 5cm 洁净且干燥 薄层色谱用硅胶H0 8 羧甲基纤维素钠水溶液层析缸 点样毛细管混合染料 含二甲黄 苏丹红 靛酚蓝各0 40mg ml 展开剂 石油醚 A R 或苯 A R 17 四 实验步骤 把玻璃板清洗干净并烘干 取羧甲基纤维素 CMC Na 0 2g 溶于25ml水中 在水浴上加热搅拌使完全溶解 在三角烧瓶中把一份硅胶H和三份CMC Na溶液 0 8 混合 并用力振摇至少30秒 混合均匀 18 将混合好的溶液倾倒在玻璃板上 轻轻振动 使涂布均匀 水平放置 铺好的板静置5分钟 然后把它们面朝上移至一个水平的平面上 阴干 把阴干后的板在105 的烘箱中烘30分钟 活化 待板凉至室温后 置干燥器中保存 19 关于配制CMC Na 先将称好的CMC Na加入所需水量的8 10 让其充分溶涨后 再加热煮沸 然后将剩余水慢慢加入 这样在煮沸过程中不易形成颗粒 煮沸时间短 溶液的浓度0 3 0 8 比较合适 实际操作中0 4 0 5 最为实用 浓度高 将来显色时如有加热过程板子容易发黑 浓度低 铺的板子不结实 易掉渣 不易保存 点样时易出洞 20 五 硅胶活度的测定 一般选用三种染料的薄层层析法进行测定 欧洲药典1969年记载用0 01 二甲基黄 苏丹红 靛酚蓝的苯溶液各10 l点滴于硅胶G或硅胶H薄层上 以苯为展开剂 展开10cm 约20分钟 三种染料应明显分离 21 点样与展开 取薄层板一块 在距板的一端2cm处用铅笔轻轻划上起始线并在距起始线10cm处划出前沿线 在起始线上划上2 3个点样点 每点间隔2cm 两侧点距边缘2cm 用内径约1mm的平口毛细管轻轻点上混合染料溶液 边点边用冷风吹 原点直径应不超过2 3mm 22 挥干溶剂 将薄层板置于放有苯的层析缸中 展开至前沿线时 取出 挥干溶剂 划出实际前沿线 观察斑点的位置 测量计算出二甲黄 苏丹红 靛酚蓝的Rf值 判断活度 相关活度级别可查询有关资料 23 苯展开则应分成三个斑点 合格的硅胶粘合薄层 其Rf值分别为 如Rf值 标准值 表明硅胶的含水量小 新鲜活化的硅胶板 吸附能力强 如Rf值 标准值 表明硅胶的含水量大 暴露在空气中时间较长的硅胶板 吸附能力弱 活度级别为 级 24 25 靛酚蓝斑点接近于起始线 二甲基黄斑点在薄层的当中 苏丹红斑点位于两点之间 则认为薄层板活性符合要求 点样点 26 27 国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是 硅胶G G是Gypsum石膏的缩写 表示加了石膏