微生物工程2.doc

1.初级代谢产物：在对数生长期所产生的代谢产物，是细胞生长和繁殖所必需的物质，如各种氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等，这些代谢产物称为初级代谢产物。2.次级代谢产物：次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。3.转化产物：是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，物将一种物质转化成为另一种物质，最终所得到的物质称为转化产物。4.生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。5.前体：是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合的产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化的物质，但是产物的产量却因此有较大的提高。6.比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-1。 CCr 临界溶氧浓度： 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。 7.摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。8.比速：单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。9.恒浊器：是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。10.恒化器：是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。11.接种：接入种子罐后直接移种到发酵罐上。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。12.生理酸性物质：经微生物生理作用后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质。生理碱性物质：经微生物生理作用后能产生碱性物质的无机氮源叫生理碱性物质。13.葡萄糖效应：碳分解产物的阻抑作用。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期，这是菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖。在上述培养基中即使加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的酶系也不能合成。14.铵阻遏：氮分解产物的调节作用指的是被菌体迅速利用的氮源（特别是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代谢的酶的合成。15.生物传感器：是利用生物催化剂和适当的转换元件制成的可将非电信号转化为电信号的仪器。 16.生物转化：是指利用微生物细胞或者酶对一些化合物的某一特定部位（基团）进行催化修饰，使其转变成的具有更大经济价值的化合物。 17.中间体：指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。 18.培养基：指人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。19.种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种罐或发酵罐时的培养时间。20.发酵工程：是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分，也被称为微生物工程。21.未培养微生物：是指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约占99%。1、微生物工业的核心是（实现规模化得微生物发酵），其发展并取得具有创新性的成果，都必须处理好下面三大问题：（优良的菌种）、（适当的反应器调控）、（发酵基质的选定）。2、菌种的保藏方法有：(斜面低温保藏法)、(矿物油中浸没保藏法)、（固体曲保藏法）、（砂土管保藏法）、（普通冷冻保藏）、（超低温冷冻保藏法）、（冷冻干燥法）、（液氮冷冻保藏法）、（寄主保藏）。3、微生物大致采用三种方式调节其代谢：（酶活的调节）、（酶合成的调节）、（遗传控制）。4、生物传感器的在线使用的局限性主要原因是（灭菌）和（稳定性）方面存在问题。5、pH电极在发酵罐中的使用应注意（灭菌）、（校准）、（电解液流失）、（多孔塞污染）。6、微生物的代谢产物名目繁多，从生源上考虑，可区分为（初级代谢产物）、（次级代谢产物）、（转化产物）。7、影响培养基质量的因素（原料的预处理）、（培养基成分丰富性及均衡性）、（发酵特性的影响 ）、（无菌条件）、（其它影响因素）。典型的发酵工艺流程是什么？答：（1）用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；（2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；（3）扩大培养用活性的适量纯种，以一定比例将菌种接入发酵罐中；（4）控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；（5）将产物提取并精制，以得到合格的产品。（6）回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。适合大规模发酵培养基的要求？答：（1）培养基能够满足产物最经济的合成；（2）发酵后所形成的副产物尽可能地少；（3）培养基的原料应因地制宜、价格低廉、且性能稳定、资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；（4）所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等等。从微生物代谢调控出发，谈谈如何对发酵条件进行控制？答： 应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节。在直线式的合成途径中，营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物而不能积累最终代谢产物，在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可使某一分支途径的末端产物得到积累。 应用抗反馈调节的突变株能解除反馈调节。在这种菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或反馈抑制和阻遏同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。 控制细胞膜的渗透性。请给出图中每一设备的名称并说明连续灭菌的流程答：从左到右依次为：配料罐、连消泵、混合器、连消泵、连消塔、维持罐、冷却罐。培养基由配料罐放出，经过蒸汽预加热后，用连消泵送入气液混合器或连消塔底端，料液被加热到灭菌温度后，由顶部流出，进入维持管，维持8-25分钟，再由维持罐上部侧面管道流出，维持管内最后的培养液由底部排尽，经冷却装置冷却到发酵温度，进入发酵罐。溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？答：当给电极施加极谱电压时，溶液中的氧就在阴极还原，阴极上失去电子以后，阳极上反应产生的电子流向阴极，于是在两电极间形成电流，将氧的信号转变为电信号，当产生的电流与溶液中氧的含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，电压为极谱电压，氧浓度与饱和电流成正比关系。从基因工程菌生长与产物表达的特点出发，论述重组大肠杆菌的高密度培养策略。答：重组大肠杆菌高密度发酵的关键技术是补料策略，也就是根据重组菌的生长特点及产物的表达方式，采取合理的营养物流加方式，碳源和氮源是两种常用的限制性基质，葡萄糖因细菌利用快且价廉易得，已广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质，大肠杆菌在过量葡萄糖的条件下回发生葡萄糖效应，积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源Pro的有效表达，因此，大肠杆菌高密度发酵中合理流加碳源使G效应降低是发酵成功的关键。Pirt方程是什么？答：a + b；（1）a=0、b0：可表示一类发酵；（2）a0、b 0：可表示二类发酵；（3）a 0 、b=0：可表示三类发酵。dP/dt = *（dX/dt）+X， dp/dt：产物生成速率；X：菌体浓度：与菌体生长相关的产物生成系数；：与菌体浓度相关的产物生成系数。生长相关型：产物的生成与细胞的生长密切相关的动力学过程，产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果。 生长部分相关型：指代谢产物是能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物。非生长关联型：指产物的生成与能量代谢无关，与细胞生长也无直接联系，即产物的生成与微生物细胞生长不偶联，产物均为次级产物。分批发酵的优缺点：优点：即操作简单，周期短，染菌的机会减少，生产过程和产品质量易掌握。缺点：存在基质抑制问题，出现二次生长（diauxic growth）现象。如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在12天，产率较低，不适于测定动力学数据。 补料分批培养的优缺点：优点 ：在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点 ：由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会半连续发酵的优缺点在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液可称为半连续发酵.优点:放掉部分发酵液,再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物质被稀释,从而有利于产物的继续合成,提高了总产量。缺点:（1）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体；（2）.定期补充和带放使发酵液稀释,送去提炼的发酵液体积更大；（3）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物,最终限制发酵产物的合成；（4）一些经代谢产生的前体可能丢失；（5）有利于非产生菌突变株的生长。连续发酵的优缺点优点：（1）备利用率高，操作简单，产品质量稳定，对发酵设备以外的外围设备的利用率高，可以及时的排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。（2）制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量.（3）由于u=D,通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学。 缺点：（1）生产菌种突变的问题，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。（2）长时间补料染菌的机会大大增加。发酵过程泡沫产生的原因（1）通气搅拌的强烈程度：通气大、搅拌强烈可使泡沫增多,因此在发酵前期由于培养基营养成分的消耗少,培养基成分丰富,易起泡。（2）培养基配比与原料组成：培养基营养丰富、黏度大,产生泡沫多而持久,前期难开搅拌。（3）菌种、种子质量和接种量：菌种质量好，生长速度快，可溶性氨源较快被利用，泡沫产生几率也就少。（4）灭菌质量：培养基灭菌质量不好，糖氨被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。起泡的危害：1降低了发酵罐的装料系数；2.增加了菌群的非均一性；3增加了污染杂菌的机会；4.大量的起泡，控制不及时会引起“逃液“，导致产物的流失；5.消泡剂的加入有时会影响发酵产量或给下游分离纯化与精制工序带来麻烦；泡沫如何控制？答：两种途径：调整培养基中的成分，或改变某些物理化学参数 ，或者改变发酵工艺 ；采用机械消沫或消沫剂消沫。另外可以从生产菌种本身的特性着手，预防泡沫的形成。 机械消沫：利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂，起消沫作用。有罐内消沫和罐外消沫两种方法。优点：节省原料，不需引进外界物质(如消泡剂)，减少染菌机会，不会增加下游工段的负担。缺点：消沫效果不理想，不能从根本上消除泡沫成因，仅可作为消沫的辅助方法。菌种选育的目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。突变株的筛选方法：随机筛选、理性化筛选（平皿快速检测法：A、纸片培养显色法 B、变色圈法 C、透明圈法 D、生长圈法E、抑制圈法）。培养基成分选择的原则：（1）菌体的同化能力；（2）代谢的阻遏和诱导；（3）合适的C，N比1000.22.0；（4）pH的要求。影响培养基质量的因素：原料及设备的预处理；原材料的质量 ；发酵特性的影响 ；灭菌 ；其它影响因素 。要确定一个合理的放罐时间，须要考虑下列几个因素： 1.考虑经济因素，以最低的成本来获得最大生产能力 ；2.产品质量因素：发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大影响 ；3.特殊因素：异常情况；加糖、补料或消沫剂。确定放罐的指标：产物的产量、过滤速度、氨基氮的含量、菌丝形态、pH值、溶氧(DO)、发酵液的粘度和外观等 。常用消泡剂的种类和性能是什么？答：（1）天然油脂：天然油脂是最早用的消泡剂，它来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，但油脂如保藏不好，易变质，使酸值增高，对发酵有毒性。包括：酒糟榨出液、啤酒花油；（2）聚醚类消泡剂：它是以甘油为起始剂，由环氧丙烷，或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成的；（3）高碳醇：高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。C7C9的醇是最有效的消泡剂；（4）硅酮类：它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。挥发性低并具有化学惰性，比较稳定且毒性小。培养基的成分及来源是什么？ 答：（1）碳源：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。生产中常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳醇和其它碳氢化合物等。 （2）氮源：主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。分为有机氮源和无机氮源。（3）无机盐及微量元素：微生物在生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，如磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等。 （4）水：水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。可以通过物理和化学的方法得到去离子或脱盐的工业用水。 （5）其它成分：（1）生长因子：有机氮源是生长因子的重要来源。同时有机氮源也能提供无机盐。（2）前体：在实际生产中前体的加入还可以显著提高产物中目的成分的比重。（3）抑制剂和产物促进剂。（4）消泡剂。菌种保藏方法的原理和优缺点是什么？答：（1）斜面低温保藏：是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。可用于实验室中若干菌种的保藏。