南大2419 x 望水白群体中PPO活性的QTL定位.doc

南大2419 x望水白群体中籽粒多酚氧化酶活性的QTL定位吴纪中1蔡士宾1马正强2 （1江苏省农科院粮食作物研究所，南京，210014；2. 南京农业大学应用植物基因组实验室，南京，210095）摘要：多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO) 是引起小麦面粉及面制品颜色褐变的主要原因。本文利用基于L-DOPA方法对南大2419望水白F9:10代重组自交系（recombination inbred line，RIL）群体在3个种植环境的籽粒进行了PPO活性分析，并结合该群体已构建的覆盖小麦基因组3360cM，包括408个标记33个连锁群的遗传框架图，对控制小麦籽粒PPO活性的QTLs分别进行了单向方差分析、区间作图和复合区间作图分析。结果表明，14个染色体区域与该群体籽粒PPO活性极显著相关，分别位于第一、二同源群以及3B、4B、5B、5D、6B和7B上，其中位于染色体2AL的Xgwm312和2DL的Xsts49.2在3个环境中均与PPO活性极显著相关；区间作图和复合区间作图发现控制该群体籽粒PPO 活性的主效QTL有2个，分别位于染色体2AL的 Xgwm312-Xgwm47.32区间 和2D L 的Xsts49.2-Xcfd16区间，贡献率分别为10.9 %19.1 %和13.6 %32. 9 %，这两个主效QTL均来自高PPO活性亲本南大2419。关键词：普通小麦；多酚氧化酶(PPO)；分子标记；QTL 分析Mapping QTLs associated with Polyphenol Oxidase Activity in the Nanda2419 x Wangshuibai RIL populationWU Ji-zhong1, CAI Shi-bin1, MA Zheng-qiang2(1. Institute of Food Crop, Jiangsu Academy of Agricultural Science, Nanjing 210014, China; 2. The Applied Plant Genomics Lab, Crop genomics and Bioinformatics Center, Nanjing Agricultural University, Jiangsu 210095, China)Abstract：The enzyme activity of polyphenol oxidase (PPO) in kernel has been related to undesirable brown discoloration of bread wheat (Triticum aestivum L.) based end-products, particularly for Asian noodles. Developing wheat cultivars with low or zero PPO activity is the best approach to reduce the undesirable darkening. To identify genes for PPO activity, the recombination inbred line (RIL) population derived from Nanda2419 x Wangshuibai and the parents were assessed based on L-DOPA assays in three trials. A linkage map covering over 3360 cM of wheat genome was used for QTL analysis, and fourteen chromosome regions were identified significantly associated with PPO activity by one-way ANOVA, which located on wheat chromosomes group 1, 2, 3B, 4B, 5B, 5D, 6B and 7B.Among of these QTL markers, Xgwm312 and Xsts49.2 were highly significantly associated with PPO activity in three trials, which located on chromosomes 2AL and 2DL. With methods of simple and composite interval mapping (CIM), two putative major QTLs were detected on chromosome 2AL and 2DL, accounting for 10.9 %19.1 % and 13.6 %32.9 % of the phenotypic variance across three environments, respectively.Key words：Common wheat; Triticum aestivum L.；Polyphenol oxidase; Molecular marker; Quantitative trait loci (QTL)收稿日期: 基金项目：国家科技支撑计划（2006BAD13B02-11）和江苏省农科院基金项目（6110513）作者简介：吴纪中（1970-），硕士，副研究员，主要从事小麦种质资源研究。TelE-mail：wjz_面制食品是我国人民的传统主食，在人们的膳食结构中占有非常重要的地位。随着人们生活节奏的加快，面制半成品越来越受到人们的欢迎1。在面制食品的加工制作和储藏过程中经常会出现颜色加深的现象即褐变。褐变不仅影响面制食品的外观质量，而且还影响食品特性的内含蛋白质的营养价值，使食品品质变劣。多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）所催化的化学反应是引起面团或面条颜色褐变的主要原因，可解释面条颜色变异的55%70%2, 3。PPO主要分布在小麦籽粒的糊粉层，面粉PPO的含量仅占籽粒总PPO的3%左右4。Okot-Kotber 等研究表明，基因型是决定小麦PPO 活性的主要因素，但也受环境条件的影响5。不同品种间PPO 活性相差很大，因此，通过遗传育种途径改良面制品颜色的褐变是可行的5 。美国、澳大利亚等国家针对亚洲小麦巨大的消费市场已将其列为重要育种目标，对引起小麦面条（团）颜色褐变的多酚氧化酶进行了较为广泛而深入的研究，如建立了小麦全面粉4、整粒6, 7中PPO活性的多种检测技术，创造出PPO活性为0的种质资源8，并将控制小麦PPO活性的主效QTL定位于2A和2D7, 9, 10。目前，国内的一些科研和育种单位也日益重视小麦PPO活性的研究，并相继开展了PPO活性检测方法、资源筛选和遗传分析的工作。葛秀秀等11、张立平等12分别对两个北方冬小麦品种中优9507CA9632 的DH群体进行了主基因+多基因模型遗传分析和QTL定位，发现该群体的籽粒PPO活性主要受2对独立主基因控制，并将其定位染色体2AL和2DL上。马传喜等13建立了一种基于邻苯二酚的全麦粉PPO活性测定方法，并开展了一些杂交组合早代PPO活性的遗传分析和低PPO活性资源的筛选研究。本研究构建了我国长江中下游麦区的骨干亲本南大2419与赤霉病抗源望水白的高代重组自交系群体，并利用已建立的该群体遗传框架图定位小麦籽粒PPO活性的QTL，以期为该麦区利用分子标记辅助育种等手段进行的低PPO活性小麦新品种的选育提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料所用材料为南大2419 x 望水白的F9:10代重组自交系群体及其亲本，于2005至2006年共设置了三个试验。2005年调查了278个株系，2006年调查了133个株系。2005年的试验设置在江浦基地试验田，2006年的二个试验分别设置在江浦基地试验田和江苏省农科院实验田。所有试验均设置了两个重复。每个重复内小区排列按完全随机区组设计。每个株系种植两行，行长1 m，行宽25 cm，每行播种15粒。1.2PPO活性测定PPO 活性的测定参照Anderson等7和Connie Perron14的方法进行了改动。分别配制50 mM pH=3.5 的 MOPS（3-(N-吗啉代)丙烷磺酸）缓冲 液 (1.0465g+100ml 水) 和10 mM L-DOPA（ L-3，4-二羟基苯丙氨酸）（0.1972g+100 ml 水），现配现用。籽粒 PPO 活性测定具体操作步骤：选取供试材料饱满无破损无病害的籽粒20粒，称重。取其中8粒分别放于96孔酶标板中某一列的8个孔中（即1孔1粒种子，其中第一列除外，该列用做空白对照，仅加缓冲液和底物）。在室温（20）下，每个酶标板孔中加入体积均为150l的MOPS缓冲液和L-DOPA底物，反应30 min后，移取200l反应液至另一块干净的酶标板孔中，然后利用酶标仪（Molecular Devices 公司生产的SPECTRAmax Plus 384）在波长490 nm处测定其吸光度A。每个参试材料按上述程序重复分析两次，取两次重复吸光度的平均值进行下一步的分析。PPO活性通过以下公式计算：酶活性（A490/min.g-1.10-3）= A/(30min单粒种子克数)103。1.3统计分析使用软件Data Desk v.5.0（Data Description, Ithaca, N.Y.）进行方差分析和相关性分析。计算广义遗传力时，使用公式h2=sg2/(sg2+se2), 其中sg2和 se2分别表示遗传方差和误差方差，数值由方差分析所得相关组分的方差值估算。1.4QTL分析在单向方差分析中每个标记与PPO活性相关的显著性阀值设为P=0.01。利用包含有408个分子标记的南大2419 x 望水白的连锁框架图和群体中各株系的表型资料进行区间作图分析。利用Mapmaker/QTL v. 1.9（Lander & Botstein 1989）进行简单区间作图，QTL的显著性阀值设为LOD=2.0。在进行复合区间作图（CIM）时，将LOD值最高的QTL锚定后再进行全基因组扫描。当两个位点共同的LOD值比锚定位点本身LOD值高出2.0时，该新位点被认为是一个新QTL。2结果与分析2.1 表型分析对三个试验的重复资料进行的方差分析表明群体中各株系之间的表型变异均达到了极显著水平（P0.0001）（表1）。除2006年江苏省农科院试点重复之间的变异不显著（P=0.0539）外，2005和2006设置在江浦基地试验点两个试验其重复之间的变异均达到显著水平，但未达到极显著水平（2005，P=0.0314；2006，P= 0.0165）。2005和2006年江浦基地试验群体的PPO活性的广义遗传力较高，分别为64.0%和53.6%；2006年江苏省农科院试验群体的PPO活性的广义遗传力较低，仅为38.3%。表1. 南大2419 x望水白重组自交系群体小麦籽粒多酚氧化酶活性的方差分析Table 1 Analysis of variance of PPO activity in the Nanda2419 x Wangshuibai population 变异来源Source自由度 df均方MSF值 FP环境Environment2377.1170.3820.683重复Replication113319.813.510.0003基因型Genotype2255077.495.148 0.0001基因型环境GenotypeEnvironment2641485.761.506 0.0001误差 Error465986.3072005年江浦基地试验田群体中PPO活性的分布接近于正态分布，偏向于低PPO活性亲本望水白。PPO活性的变异幅度为15.433-216.033，平均值为90.333（图1）。2006年江浦基地试验田群体中PPO活性的分布也接近于正态分布，但偏向于高PPO活性亲本南大2419（图1）。2006年农科院试验田群体中PPO活性的分布呈多峰分布的特征，说明控制PPO活性的QTL中存在主效位点（图1）。三个试验间群体PPO活性的相关系数介于0.485-0.606之间，都达到了极显著水平（P0.0001）（表2）。2.2 单向方差分析利用南大2419 x 望水白群体遗传框架图中的408个分子标记位点和群体各株系PPO活性的表型资料进行了单向方差分析。结果表明，在南大2419中有4个染色体区域、在望水白中有10个染色体区域分别与PPO活性显著相关。表4中列出了每个区域最显著的标记及其解释的表型变异。2A上的Xgwm312和2D上的Xsts49.2在3个试验中均与PPO活性极显著相关。其中2D染色体上的QTL效应最强，与其连锁的Xsts49.2最高可解释群体PPO活性表型变异率的34.3%（表3）。株系数106011016021010203016.67100.00183.335101520252006江浦株系数2005江浦106011016021051015WM N2006农科院株系数M WNNM W图1 南大2419 x 望水白群体中PPO活性的分布 W:望水白，N:南大2419，M:平均值Fig. 1 Distribution of PPO activity in the Nanda2419 x Wangshuibai population. W: Wangshuibai, N: Nanda2419, M: mean value.表2 不同环境间多酚氧化酶活性的相关系数Table 2 The correlation coefficients of PPO activity across the environments2005江浦2006江浦2006江浦0.547*2006农科院0.485*0.603*significant at P0.0001表3 与PPO活性相关的标记及其解释的表型变异Table 3 Markers associated with PPO activity in one-way ANOVA and the phenotypic variation explained by them标记Markers抗性等位位点来源Source of resistance allele定位 Location2005 江浦2006 江浦*2006 农科院2005 JP2006 JP2006 JAASPR2(%)PR2(%)PR2(%)Xbarc197.1W1A0.0043 7.3Xbarc119N1B0.00745.6Xbarc80W1B0.0051 3.70.00416.6Xgwm642W1D0.0042 6.3Xgwm312N2A0.0001 25.90.0125.40.0074 6.0Xwmc317W2B0.0061 5.8Xgwm261W2D0.0016 8.7Xsts49.2N2D0.000120.30.000134.30.0001 14.7Xzmh461W3B0.0013 8.2Xgwm149W4B0.0068 5.8Xbarc140N5B0.0022 8.0Xwmc97W5D0.0044 6.3Xzmh122W6B0.0072 5.7Xmag1231W7B0.0001 8.7*斜体数字表示在其他试验中P值小于0.01。W: Wangshuibai, N: Nanda24192.3 区间作图分析区间作图分析证实了在单向方差分析中表现最显著的2个QTL（表4）。将其中最显著的位点锚定后再次进行扫描，还检测出一些新的与PPO活性相关的位点（表4）。表4 利用区间作图法检测到的与PPO活性相关的QTLTable 4 QTLs for PPO activity detected through interval mappingQTL鉴定方法Methods of QTL detection区间Interval定位Location提高PPO活性的位点来源Source of PPO activity allele区间长度Length (cM)峰值位置Peak position (cM)aLODb最大决定系数R2 (%)c2005江浦SIMXcfd48-Xcfd631DW34.8Xcfd4+26.02.27.9Xgwm312-Xgwm47.32AN3.9Xgwm312+0.06.0119.1Xsts49.2-Xcfd162D1N3.1Xsts49.2+0.0*6.1719.2Xmag2152-Xbarc1405BN18.5Xmag2152+8.02.138.5Xwmc517-Xzmh11437BW22.8Xwmc517+18.02.478.9CIMPGAM-Xzmh4613BW7.5PGAM+4.02.357.2Xzmh1143-Xwmc3117BW14.4Xzmh1143+02.757.02006江浦SIMXsts49.2-Xcfd162D1N3.1Xsts49.2+0.0*11.4232.9CIMXbarc197.1-Xwmc3291AW15.3Xbarc197+8.02.647.7Xgwm312-Xgwm47.32AN3.9Xgwm312+0.03.8410.9Xgwm614-Xcfd512D2W24.9Xgwm614+14.02.37.72006 农科院SIMXsts49.2-Xcfd162D1N3.1Xsts49.2+0.0*4.2213.6CIMXgwm312-Xgwm47.32AN3.9Xgwm312+0.03.112.5a QTL的峰值位置由该区间的左侧标记加上距它的遗传距离（cM）b, c 复合区间作图分析所得QTL的LOD值与R2值由两个位点总的值减去锚定位点自身的相应值* 运行复合区间作图分析时锚定的位点表5 Xgwm312和Xsts49.2单独或合并起来使多酚氧化酶活性增加的比率*（%）Table 5 The reduction* of PPO activity (%) due to Xgwm312 and Xsts49.2 independently orin combinationXgwm312Xsts49.2Xgwm312+Xsts49.22005江浦35.4932.6269.592006江浦16.2736.8755.512006农科院20.6730.4654.06*=（南大2419基因型望水白基因型）/南大2419基因型3 讨论目前，我国大面积种植小麦品种的活性普遍较高15, 而高水平的PPO 活性又是引起湿面条（面团）颜色褐变的最主要原因，因此也就导致了市场上出售的面粉及其面粉制食品在很大程度上不能满足现代消费者对其营养价值、色泽、口感等要求，因此选育低PPO 活性小麦新品种也就成为小麦品质育种重要的内容。此外，研究表明小麦籽粒颜色与PPO活性有关即红皮小麦中高PPO活性的品种比白皮小麦多15。长江中下游麦区在收获前往往会遇到连续阴雨天气而造成穗发芽现象，为避免这一气候灾害，该麦区生产上多种植红皮小麦，不可避免地增加了高PPO活性品种在该区种植的可能性，如大面积种植的扬麦158和扬麦10号等，所以在这一地区开展低PPO 活性小麦新品种的选育更为紧迫和必要。PPO 活性是无法在田间进行直接选择的理化性状，利用分子标记进行辅助选择将会极大地提高选择效率。本文利用南大2419 x 望水白群体中检测出了2个PPO活性的主效QTL，分别位于2AL和2DL上。这一结论与张立平等12利用中优9507 CA9632的加倍单倍体（double haploid，DH）群体定位的两个主效QTL相近似。其中位于2AL上的QTL介于Xgwm312 - Xgwm47.3之间的3.9 cM范围内，Xgwm312刚好位于QTL峰值上，在3个环境中与该QTL峰值的遗传距离均为零。张立平等12、Raman et al. 10也报道了小麦染色体2AL上存在一个控制小麦籽粒PPO活性的主效QTL，且均与Xgwm312紧密连锁，说明不同的小麦种质在该位点可能存在一个相同的控制PPO活性的主效QTL。因此，在长江中下游麦区可以利用与之紧密连锁的SSR标记Xgwm312开展低PPO活性小麦新品种的分子标记辅助选择研究。孙道杰等进一步验证了这一设想的可行性16。张立平等12用中优9507 CA9632的DH群体还检测到一个位于染色体2DL上介于WMC41-P41/PM32a之间的主效QTL，本文在相近区域也发现了一个主效QTL，该位点介于Xsts49.2-Xcfd16之间的3.1 cM范围内，Xsts49.2位于该QTL峰值上，与该QTL基因共分离。与前者相比，本文定位的该QTL的区间范围进一步缩小17，与之紧密连锁的STS标记更适合开展分子标记辅助选择。本文检测出的与PPO 活性相关的两个主效QTL在3个环境的效应都较大，标记区间一致，且获得了与二者分别共分离的SSR或STS 标记，因此，可以将这两个标记做为低PPO活性辅助育种的分子标记，以加速低PPO活性小麦品种的选育进程。参考文献1 李红军，蔡静平，黄淑霞，等影响面团褐变因素的研究J中国粮油学报，2000，15(6)：19-232 Demeke T, Morris CF, Campbell KG, King GE, Anderson JA and Chang HG. Wheat polyphenol oxidase distribution and genetic mapping in three inbred line populations J. Crop Science. 2001, 41:1750-17573 Demeke T and Morris CF. Molecular characterization of wheat polyphenol oxidase (PPO) J. Theoretical and Applied Genetic. 2002, 104:813-8184 Baik B K, Czuchajowska Z, Pomeranz Y. Comparison of polyphenol oxidase activities in wheats and flours from Australian and U.S.cultivarsJ. Journal of Cereal Science, 1994, 19: 291-296.5 葛秀秀，何中虎，杨金，张歧军我国冬小麦品种多酚氧化酶活性的遗传变异及其与品质性状的相关分析J 作物学报，2003，29：125-1316 Kruger JE, Hatcher DW and DePauw R. A whole seed assay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulness as a measure of noodle darkening J. Cereal Chemistry. 1994, 71:3243267 Anderson JV and Morris CF. An improved whole-seed assay for screening wheat germplasm for