免疫荧光 免疫组化 实验技术.doc

1甲醛（formaldehyde）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是3740得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4。10福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10福尔马林要好。4 AF液（混合固定液）95乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95乙醇脱水。以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10福尔马林，乙醇应尽量不用。IF免疫细胞化学和免疫荧光实验载玻片/盖玻片处理 聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。 无菌水冲洗盖玻片（3次 ，每次5分钟）。 可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。 在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。 磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的冲洗。 第一步：细胞固定 用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 )固定细胞片15分钟。 用预冷的PBS冲洗细胞片两次。透化：如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。注：丙酮固定标本不需要透化。 用含0.25% Triton X-100或100 M 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。Triton X - 100是目前最流行的通透剂，可提高抗体的渗透程度。但这不适合与膜相连抗原的使用，因为它会将膜破坏。 PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。 第二步：封闭和孵育 PBST孵育细胞（1 牛血清白蛋白），室温30分钟，以封闭抗体非特异性结合位点（封闭液也可以是1 明胶或10 的血清，此血清需来自二抗产生的物种体内） 。 加入一抗在湿盒内孵育细胞片（在使用含1% BSA PBST稀释抗体的），室温1小时或4 过夜。 缓慢倒出溶液，PBS清洗细胞片的3次，每次5分钟。 加入含1 BSA的二抗稀释液，室温避光孵育1小时（避光）。 缓慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分钟（避光）。 第三步：复染 在0.1-1 g/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育细胞1分钟。 PBS清洗。 第四步：封片和观察 滴加一滴封片剂封片剂质，盖上盖玻片。 用指甲油密封盖玻片，以防止干燥和显微镜观察时移动。 观察后的细胞片可避光保存在-20或4C。二、免疫荧光方法中的重要环节1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH78）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照：多聚赖氨酸防脱片处理：1、一般，先按照说明书稀释成工作液。2、清洗干净玻片或盖玻片：先用洗衣粉水浸洗1h左右，然后再用自来熟清洗数次，60度烤干；浸酸（重铬酸钾100克，溶入100ml水中，缓缓加入硫酸1000ml）过夜，也可用超声波仪中浸洗；自来水冲洗3次，然后用双蒸水漂洗3次，