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1 第八章高效液相色谱法 高效液相色谱法 high performanceliquidchromatography HPLC 又称高压液相色谱法 它是在经典色谱和气相色谱法的基础上发展起来的 在色谱理论方面没有本质的差别 但由于采用了高效固定相 高压输液泵 高灵敏度检测器等新技术 因而有了更高的效率并实现了自动化 高压 150 350 105Pa高效 大于30000塔板 米高灵敏 10 9g 紫外检测 10 11g 荧光检测 与经典色谱的比较 一 与其它色谱方法比较 经典LC 仅做为一种分离手段 特点 高压 高效 高速 是高沸点 热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法 与气相色谱比较以溶剂作流动相 流动相参与分离作用 分离能力强 适用范围广 气相色谱分离分析的化合物只占化合物的30 而高效色谱对高沸点 热不稳定 大分子量 离子型化合物等都有效 适合于生命物质的分析 分析过程中一般不破坏物质 因而可以方便地制备色谱纯物质 第一节高效液相色谱的固定相和流动相 固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类 可分为刚性固体和硬胶两大类 刚性固体以二氧化硅为基质 可承受7 0 108 1 0 109Pa的高压 可制成直径 形状 孔隙度不同的颗粒 如果在二氧化硅表面键合各种官能团 就是键合固定相 可扩大应用范围 它是目前最广泛使用的一种固定相 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中 它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成 可承受压力上限为3 5 108Pa 1 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠 在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料 如硅胶 氧化铝 离子交换剂 分子筛 聚酸胺等 这类固定相的多孔层厚度小 孔浅 相对死体积小 出峰迅速 柱效亦高 颗粒较大 渗透性好 装柱容易 梯度淋洗时能迅速达平衡 较适合做常规分析 由于多孔层厚度薄 最大允许量受限制 固定相按孔隙深度分类 可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类 2 全多孔型固定相 它由直径为10 m的硅胶微粒凝聚而成 这类固定相由于颗粒很细 5 10 m 孔仍然较浅 传质速率快 易实现高效 高速 特别适合复杂混合物分离及痕量分析 二 流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体 它对组分有亲和力 并参与固定相对组分的竞争 因此 正确选择流动相直接影响组分的分离度 对流动相溶剂的要求是 1 溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好的选择性 2 溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器 应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时 溶剂对此辐射产生强烈吸收 此时溶剂被看作是光学不透明的 它严重干扰组分的吸收测量 下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长 对于折光率检测器 要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相 以达最高灵敏度 12 3 高纯度 由于高效液相灵敏度高 对流动相溶剂的纯度也要求高 不纯的溶剂会引起基线不稳 或产生 伪峰 痕量杂质的存在 将使截止波长值增加50 IOOnm 4 化学稳定性好 不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 5 低粘度 若使用高粘度溶剂 势必增高压力 不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮 乙醇 乙晴等 但粘度过于低的溶剂也不宜采用 例戊烷 乙醚等 它们易在色谱柱或检测器内形成气泡 影响分离 第二节高效液相色谱的主要类型和分类 按分离原理可分为 吸附色谱 液 固吸附色谱 分配色谱 液 液分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 凝胶色谱 空间排阻色谱 按流动相 固定相的相对极性分类 固定相的极性大于流动相的极性 称为正相色谱 反之 固定相的极性小于流动相的极性的称为反相色谱 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相 吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质 在它们的表面存在吸附中心 液固色谱实质是根据待分离的物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的 一 液 固吸附色谱法 当流动相通过固定相 吸附剂 时 吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子 当待测试样分子 X 被流动相带入柱内 就要取代数目相当的已被吸附的流动相分子 于是 在固定相表面发生交换 竞争 吸附 Xm nMad Xad nMm 1 分离原理 其中Kad为吸附平衡常数 值大表示组分在吸附剂上保留强 难于洗脱 Kad值小 则保留值弱 易于洗脱 试样中各组分据此得以分离 竞争吸附达平衡时 有 2 固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂 如硅胶 氧化铝 聚酸胶等 由于硅胶的优点较多 如线性容量较高 机械性能好 不溶胀 与大多数试样不发生化学反应等 因此 以硅胶用得最多 在高效液相色谱法中 表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相 它们具有填料均匀 粒度小 孔穴浅的优点 能极大地提高柱效 但表面多孔型由于试样容量较小 目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料 3 流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂 液 固吸附色谱中常用有机溶剂作为流动相 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂 对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数 0 来衡量 0越大 表示洗脱剂的极性越强 表中列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的 0值 在硅胶吸附剂中 0值的顺序相同 数值可换算 0硅胶 0 77 0氧化铝 液固吸附色谱适用于分离那些能溶解在非极性溶剂中 具有中等分子质量的非离子型 油溶性 的试样 对具有相同官能团但数目不同的化合物或者异构体也有较高选择性 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾 二分配色谱和化学键合相色谱 液 液分配色谱法 是马丁及辛格于1941年创立的 液 液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同 都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同 具有不同的分配系数 所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的 使这种分配平衡可反复多次进行 造成各组分的差速迁移 提高了分离效率 从而能分离各种复杂组分 固定相与流动相均为液体 互不相溶 但在高效液相色谱法中 使用的固定相是经特殊处理得到的 22 固定相 早期涂渍固定液 固定液易流失 现在较少采用 为了解决这一矛盾 采用化学键合固定相 化学键合固定相 将不同基团通过化学反应键合到硅胶 载体 表面的游离羟基上 它代替了固定液的机械涂渍 因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破 它是目前应用最广泛的一种固定相 据统计 约有3 4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的 1 化学键合固定相 目前化学键合固定相一般以硅胶 薄壳型或全多孔微粒型 为基体 经酸 碱洗 中和 干燥和活化等处理后 再利用表面上的硅羟基与某种有机物或有机硅化合物反应 制备成化学键合固定相 键合上去的有机基团主要有三大类 疏水基团 不同链长的烷基和苯基等 极性基团 氨基 氰基 醚基和醇基等 离子交换基团 阴离子交换基团胺基 季铵基 阳离子交换基团磺酸基 2 正相键合相色谱法 固定相采用极性的有机基团 CN NH2 双羟基等键合在硅胶表面 流动相采用非极性或极性小的溶剂 如烃类 中加入适量的极性溶剂 如氯仿 醇 乙醇等 它多用于分离异构体 极性不同的化合物 此时 组分的分配比k值随其极性的增加而增大 但随流动相极性的增加而降低 3 反相键合相色谱法 固定相是采用极性较小的键合固定相 如硅胶 C18H37 硅胶 苯基等 流动相是采用极性较强的溶剂 如甲醇 乙睛 水 水和无机盐的缓冲溶液等 它多用于分离多环芳烃等低极性化合物 若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液为流动相 也可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相 则可分离一些易离解的样品 如有机酸 有机碱 酚等 反相键合相色谱法具有柱效高 能获得无拖尾色谱峰的优点 3 离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质 化学键合各种离子交换基团 如 COOH SO3H NHCH3 N CH3 2等时 就形成了离子性键合相色谱的固定相 流动相一般采用缓冲溶液 其分离原理与离子交换色谱类同 以上讨论了各种类型化学键合相色谱法 归纳键合相色谱的最大优点是 通过改变流动相的组成和种类 可有效地分离各种类型化合物 非极性 极性和离子型 此外 由于键合到载体上的基团不易流失 特别适用于梯度淋洗 据统计 在高效液相色谱法中 约有80 的分离问题是用键合相色谱法解决 此法的最大缺点是不能用于酸 碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系 三 离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法 凡在溶液中能够电离的物质 通常都可用离子交换色谱法进行分离 它不仅适用无机离子混合物的分离 亦可用于有机物的分离 例如氨基酸 核酸 蛋白质等生物大分子 因此 应用范围较广 固定相 阴离子交换树脂或阳离子交换树脂 流动相 阴离子离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换反应 R Y Mm R M Ym 阴离子交换反应 R Y Xm R X Ym 在离子交换色谱中 常通过改变流动相中反离子的种类 浓度及流动相的pH值等来控制k值 改变选择性 离子交换色谱法在无机离子的分析和应用中受到限制 例如 对于那些不能采用紫外检测器的组分 需采用电导检测器 由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测 为了解决这一问题 1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术 四 离子色谱法 离子色谱法与离子交换色谱的区别是在离子交换分离柱后加一根抑制柱 抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量 若样品为阳离子 用无机酸 HCl 作流动相 抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 OH 当试样经阳离子交换剂的分离柱后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个重要反应 R OH H Cl R Cl H2OR OH M Cl R Cl M OH 由反应可见 经抑制柱后 一方面将大量酸转变为电导很小的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子M 转变成相应的碱 由于OH 离子的淌度为Cl 离子的2 6倍 提高了所测阳离子电导的检测灵敏度 同理对于阴离子样品也有相似的作用机理 五 体积排阻色谱 固定相 凝胶 具有一定大小孔隙分布 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量的分布 它具有其他液相色谱所没有的特点 1 保留时间是分子尺寸的函数 有可能提供分子结构的某些信息 2 保留时间短 谱峰窄 易检测 可采用灵敏度较低的检测器 3 固定相与分子间作用力极弱 趋于零 由于柱子不能很强保留分子 因此柱寿命长 4 不能分辨分子大小相近的化合物 相对分子质量差别必须大于10 才能得以分离 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品 而且与凝胶本身非常相似 这样才能润湿凝胶 选择溶剂还必须与所用的检测器相匹配 常用的流动相有四氢呋喃 甲苯 氯仿 二甲基酸胺和水等 体积排阻色谱法不采用改变流动相组成来改善分离度 第三节高效液相色谱仪 液相色谱仪 2 液相色谱仪 3 液相色谱仪 4 流程及主要部件 1 流程图 动画演示 42 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细 因此对流动相阻力很大 为使流动相较快流动 必须配备有高压输液系统 它是高效液相色谱仪最重要的部件 一般由储液罐 高压输液泵 过滤器 压力脉动阻力器等组成 其中高压输液泵是核心部件 1 储液罐 贮液槽 是用于贮存足够量的流动相的容器 常用材料为玻璃或不锈钢等 使用过程应密闭 所用溶剂及样品在使用前应过滤 一 高压输液系统 43 流动相过滤器样品过滤器 44 2 流动相脱气 HPLC所用流动相必须预先脱气 否则容易在系统内逸出气泡 影响泵的工作 气泡还会影响柱的分离效率 影响检测器的灵敏度 基线稳定性 甚至使无法检测 噪声增大 基线不稳 突然跳动 此外 溶解在流动相中的氧还可能与样品 流动相甚至固定相 如烷基胺 反应 溶解气体还会引起溶剂pH的变化 对分离或分析结果带来误差 45 常用的脱气方法有 加热煮沸 抽真空 超声 吹氦等 对混合溶剂 若采用抽气或煮沸法 则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化 超声脱气比较好 10 20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂 水混合液的脱气是足够了 一般500ml溶液需超声20 30min方可 此法不影响溶剂组成 离线 系统外 脱气法不能维持溶剂的脱气状态 在你停止脱气后 气体立即开始回到溶剂中 在1 4小时内 溶剂又将被环境气体所饱和 在线 系统内 脱气法无此缺点 最常用的在线脱气法为鼓泡 即在色谱操作前和进行时 将惰性气体喷入溶剂中 严格来说 此方法不能将溶剂脱气 它只是用一种低溶解度的惰性气体 通常是氦 将空气替换出来 此外还有在线真空脱气机 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好 输出流量恒定 压力平稳 可调范围宽 便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种 恒流泵特点是在一定操作条件下 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关 恒压泵是指能保持输出压力恒定 但其流量则随色谱系统阻力而变化 故保留时间的重现性差 它们各有优缺点 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵 恒流泵又称机械泵 它又分机械注射泵和机械往复泵两种 应用最多的是机械往复泵 往复式恒流柱塞泵 3 高压泵 4 梯度洗脱装置 高压梯度洗脱 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 低压梯度洗脱 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 48 二 进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 约5 30cm 所以柱外展宽 又称柱外效应 较突出 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽 主要包括进样系统 连接管道及检测器中存在死体积 柱外展宽可分柱前和柱后展宽 进样系统是引起往前展宽的主要因素 因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严 进样阀 直接进样 停流进样 高压六通阀进样 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 三 分离系统 色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件 它包括柱管与固定相两部分 柱体为直型不锈钢管 内径2 6mm 柱长10 50cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 一般在分离前备有一个保护柱 可以除去溶剂中的颗粒和污染物质 并可使淋洗溶剂由于经过保护柱为其中的固定液饱和 使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定液 保证分离的性能不受影响 四 检测系统 a 紫外检测器应用最广 对大部分有机化合物有响应 特点 灵敏度高 流通池可做的很小 1mm 10mm 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 波长可选 易于操作 可用于梯度洗脱 b 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要发展 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 c 荧光检测器fluorescencedetector 高灵敏度 高选择性 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 d 示差折光检测器differentialrefractivein