蜂胶的抗氧化及抑菌作用.doc

蜂胶抗氧化和抑菌作用的研究进展蜂胶(Propolis)是蜜蜂从植物花苞及树干上采集的树胶，并混入颚腺分泌物和蜂蜡等物质加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物质，是防护病原微生物、修补巢房和内环境消毒杀菌的高效清洁剂1-3。蜂胶素有“自然界中的紫色黄金”之称，是一种对健康有很大作用的天然营养品。大量研究表明：蜂胶中起药理作用的主要有效成分是黄酮类化合物，其具有增强免疫功能、抗菌消炎、排除毒素、增强免疫、软化血管、净化血液、改善微循环、抗氧化、抗病毒、抗癌作用，此外，还能调节大鼠的血糖水平，调节体内蛋白质代谢，对肾脏有保护作用，促进组织再生等广泛的生物学作用。我国已有将蜂胶作为主要原料的准字号药品，2005版中国药典第一部已经收录蜂胶。随着蜂胶的多种神奇医疗作用逐渐揭示，国际蜂胶消费量迅速增长，国内外学者对蜂胶的功能研究日益深入，尤其在蜂胶的抗菌活性方面进行了广泛的研究。经研究蜂胶提取物对革兰阳性菌的抑制效果较好。而有关蜂胶抗氧化作用报道也较多，均表明蜂胶及所含黄酮类化合物对动物体内的多种自由基有显著的抑制或直接清除作用。文章综合近几年蜂胶研究进展对蜂胶的抗氧化和抑菌作用综述如下。1.蜂胶的主要化学成分及其提取方法1.1 蜂胶的主要化学成分目前，已从蜂胶中分离鉴定出的化学成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醇类、酚类、醚类、有机酸和大量的氨基酸、酶类、维生素B1、维生B2、维生素B6、维生素E和维生素A以及各种矿物质等。蜂胶总酚含量很高，要高出蔬菜、水果、植物药材的几万倍至几百万倍。蜂胶中的酚类化合物主要包括黄酮类化合物和酚酸类化合物以及它们的缩合体。含有大量的黄酮类、萜烯类化合物是蜂胶的重要特征。现已从蜂胶中分离鉴定的黄酮类化合物135种，其中黄酮及黄酮醇类化合物46种，二氢黄酮及二氢黄酮醇类36种, 11种异黄酮类化合物。查耳酮和二氢查耳酮类17种，以及最近几年从蜂胶中鉴定出的新黄酮类似物25种。包括白杨素、柚柏素、芹菜素、金合欢素、槲皮素、 高良姜素、芦丁、山萘酚、山萘甲素，鼠李素，松属素等，其5，7 -二羟基3，4-二甲黄酮和5-羟基4，7 -二甲氧基双氢黄酮等蜂胶的特有成分，蜂胶大部分的生理及药理功能都与此类化合物有密切关系。蜂胶中挥发性成分萜烯类化合物等形成了蜂胶特殊香气，分析鉴定出94种化合物，包括长叶烯、-古芸烯、去氢白菖烯、-雪松烯、香橙烯、-芹子烯、杜松萜烯、大根香叶烯、-广藿香烯、桉叶油醇、杜松烯醇等。1.2 蜂胶化学成分提取方法蜂胶的化学成分提取主要采用2.蜂胶的抗氧化作用在机体中氧自由基O2-通过脂质过氧化损伤、破坏细胞膜等，最终使组织器官发生病理改变，氧自由基又是具有更大毒性的羟自由基和过氧化氢的前体，所以对机体危害较大。能制衡或清除自由基的物质称抗氧化剂，它们能干扰自由基链反应的启动和放大，阻断其反应过程，抑制其产生。抗氧化剂有两类，一类是酶类抗氧化剂，另一类是非酶类抗氧化剂，蜂胶属后一类18。一般认为，抗氧化剂的作用机理主要包括三个方面：(1)对自由基的直接清除作用；(2)阻断自由基的反应链；(3)提高体内抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，如谷胱甘肽等19。有研究表明，蜂胶黄酮类对自由基有直接的清除作用19。2.1 蜂胶黄酮的抗氧化作用Krol等(1990)研究发现蜂胶乙醇提取液具有明显的抗氧化功能，主要原因是由于蜂胶中黄酮类化合物与超氧阴离子反应，阻止自由基反应的引发，或与铁离子螯合阻止羟基自由基的生成，或与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。Scheller等(1990)利用电子顺磁共振的方法研究蜂胶乙醇提取液对自由基的作用，结果表明蜂胶中黄酮类化合物对2，2 -苯基-1-苦肼基游离基有强烈的抑制作用，可有效地清除自由基。Rapta等研究发现，蜂胶醇提取液中黄酮类和咖啡酸酯类具有较强的清除自由基和抗氧化能力，并且采用测定氧化还原电势的方法分析出抗氧化、清除阴离子自由基能力最强的是高良姜素和白杨素。Moon等(2001)指出高良姜属于黄酮类化合物中的黄酮醇类，在蜂胶中的含量很高，具有抗氧化、清除自由基活性和抑制化学药物的生殖毒性作用，是一种值得考虑的作为化疗导致生殖毒性的对抗物质。化学发光法研究表明， 两种古巴蜂胶醇提取物对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生的超氧阴离子均有捕获能力。它们的浓度为5g/ml和9.5g/ml时对超氧阴离子自由基的抑制率为50， 与72 g/ml SOD或0.15g/ml儿茶素等效。对烷氧自由基的半数捕获浓度为06 g/ml，与0.11g/ml维生素 E等效。蜂胶醇提取物对鲁米诺-H2O2产生的化学发光也有抑制作用， 这可能与其所含的黄酮类化合物有关。陈明之等人发现蜂胶提取液清除OH自由基的能力与总黄酮含量呈正相关，但其清除 02-自由基的能力与总黄酮含量并无相关性，其原因有待于进一步深入研究。同时蜂胶提取液具有良好的抗油脂氧化能力。徐颖等人通过采用乙醇回流提取法提取蜂胶黄酮，并用乙酸乙酯对乙醇提取物进行精制，通过邻苯三酚自氧化法，邻二氮菲Fe2+法和DPPH法评价其清除自由基能力，并比较了蜂胶黄酮与VC、银杏黄酮等自由基清除剂的作用效果，研究表明：蜂胶黄酮有较强的自由基清除能力。2.2 蜂胶挥发油的抗氧化作用赵强等人通过采用超临界CO2萃取和冷冻分离得到蜂胶挥发油，用化学发光法测定蜂胶挥发油对羟自由基和超氧阴离子自由基具有清除能力。桑慧等人利用在体模型及体外实验研究了蜂胶对总SOD活力及MDA含量的影响，。结果： 在蜂胶水提液抑制Ang I I诱导的平滑肌细胞增殖过程中总SOD活力增加，MDA含量降低，与Ang I I组均差异显著( P 0.01 )；蜂胶能增加高脂血症兔的总SOD活力，降低LD L、MDA含量，与模型组相比，差异显著(P0.01 )。结论：在抑制动脉粥样硬化病变过程中， 蜂胶具有抗脂质过氧化作用。 蜂胶挥发油中含量最高的化合物分别为: 172 三十五碳烯 (20. 00% ) , 12 二十二烯 (14. 86%) ,二十七碳烷 ( 7. 28%) ,2 桉叶油醇 ( 6. 89%) ,羊毛甾醇醋酸酯 ( 5 . 31%) ,其中萜烯类及其衍生物总相对含量为 15. 21% ,黄酮类化合物为 2 , 6 2 二羟基2 42 甲氧基查尔酮和柚木柯因两种,其含量为 2. 32%。据文献报道,巴西蜂胶具有多种生理活性,而其主要成分类别为萜烯类、 含异戊二烯基衍生物和对2 羟基桂皮酸 162 18 ,在蜂胶挥发油中萜烯类化合物很可能是产生抗氧化效果的主要成分。2.3 蜂胶中咖啡碱酯类的抗氧化作用Kimo t o 等( 1 9 9 9 ) 研究发现蜂胶提取物中的咖啡酸苯乙酯( C A P E ) 可明显降低三醋酸腈铁盐氧化引起的肾损伤， 阻止肾脏和肺脏病变的发生 。S u d i n a ( 1 9 9 3 ) 等指出 C A P E是蜂胶提取液中的活性成分之一， 能在微摩尔的浓度范围内抑制5-脂加氧酶催化的亚油酸和花生四烯酸的氧化过程。在 10M浓度时，可完全阻断人的噬中性粒细胞反应性氧化物的产生和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统。A t i l l a 等认为O2-或O H自由基在外伤或多次灌注所致局部缺血引起的脊髓神经元损伤的发病机理中扮演着重要角色。并通过大白兔大动脉堵塞并多次灌流的实验方法来研究蜂胶中的C A PE对脊髓神经元的保护作用。C A P E组剂量为 1 0mol/k g ， 阳性对照组用3 0 m gk g的甲基强的松龙。结果发现蜂胶中的C A P E具有良好的抗氧化活性， 能明显降低组织中MDA的含量，对脊髓神经元表现出明显的保护作用，降低脊髓神经元损伤的程度。蜂胶中的活性物质 CAPE还是脂氧合酶的水竞争性抑制剂，当CAPE浓度为 10g/ml时，它可以完全阻断人中性白细胞和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的活性氧。 2.4蜂胶中其它组分的抗氧化作用 Basnetp等从巴西蜂胶的水提取物中分离出一种苯基丙烯酸衍生物的化合物， 其抗氧化活性强于维生素C和维生素E。蜂胶水提取物还可以保护纤维细胞免受高压氧的胁迫，使得蜂胶水提取物具有抗炎症作用。德国学者vol-pert （1993） 研究发现，蜂胶的水提取物对心肌黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶催化的氧化反应均有抑制作用，对吲哚乙酸的过氧化反应也有抑制作用，其抗氧化作用可能与所含的单酚和多酚化合物有关。H i l m i 等( 1 9 9 9 ) 研究了蜂胶对硒诱导型白内障模型的影响， 主要是利用蜂胶的抗氧化作用， 结果发现， 蜂胶、 环氟拉嗪、 砾精和维生索C 抑制硒诱导型白内障生成率分别为70、60、 58.4和4 0 ， 而白果制品 E g b 7 6 1 对白内障的形成几乎无效果。说明蜂胶的抗氧化作用不仅仅来源于黄酮类化合物， 其它成分也起一定的作用。 2.5提取方法和种类对蜂胶抗氧化作用的影响 曹炜等(2001) 以抑制非细胞体系产生的超氧阴离子和羟基自由基为方法研究蜂胶的抗氧化活性， 结果表明蜂胶能有效地清除机体外产生的 02-和 OH自由基， 并呈现量效关系。ARju n 等( 2000 ) 研究了巴西、秘鲁、荷兰和中国等多种蜂胶的细胞毒性、保肝活性和清除D P P H自由基的能力，结果表明，巴西蜂胶和中国蜂胶水提取物清除DPPH自由基的能力比醇提取物强、而秘鲁和荷兰蜂胶的醇提物清除 DPPH自由基的能力比水提物强。巴西蜂胶的水提取物、 甲醇提取物和氯仿提取物均有清除 1,1 -Ciphenyl-2-picryhydrazyl 自由基和氧自由基的作用。L i n ( 1 9 9 9 ) 等研究了蜂胶乙醇提取液对酒精慢性中毒引起的谷胱甘肽和微粒体酶的影响， 发现剂量为3 0 m gk g体重时， 可以明显抑制细胞色素P-4 5 0 、 还原型辅酶 代谢依赖的细胞色素 C还原酶的活性， 减少谷胱甘肽和羟基苯胺的产生， 阻止脂质氧化过程。沈海涛( 2 0 0 2 ) 研究发现蜂胶对油脂的抗氧化能力随提取液浓度的增加而增强， 但在清除氧自由基试验中发现氧自由基的清除能力与总黄酮、总酚无对应关系， 说明蜂胶中除了黄酮类化合物之外还有其它的抗氧化作用成分。 孙丽萍等人以蜂胶为原料，分别以甲醇、乙醇、氯仿、蒸馏水为溶剂进行萃取，测定各萃取物总酚与黄酮类物质的含量，通过测定还原能力，清除DPPH自由基能力的测定来比较4种不同萃取物的抗氧化性。结果表明：甲醇萃取物具有较强的抗氧化性。甲醇萃取物浓度为0.25mg/ml时还原力高达1.162，且浓度为0.05mg/ml时对DPPH自由基清除率为64.676%。乙醇萃取物通过石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮依次分级萃取后所得到4种萃取物各项指标测定结果表明，氯仿萃取了蜂胶乙醇萃取物中主要成分，但乙酸乙酯和丙酮萃取物的还原能力及清除DPPH自由基清除能力较佳，在浓度为0.05mg/ml时还原力分别为2.087和1.798，DPPH自由基清除率达87.724%和88.013%。3.蜂胶的抑菌作用蜂胶，除具有调节免疫 、抗氧化、抗疲劳、抗癌、抗菌等生物学和药理学作用外，还具有良好的抑菌作用，但其抑菌作用机理还尚未报道。一般认为，天然抗菌物质的抗菌机理分为两大类：(1)破坏菌体结构，作用于细胞壁、原生质膜及细胞内容物；(2)影响代谢作用与生理活动，对酶体系作用，抑制呼吸作用，影响病原菌有丝分裂47。3.1 蜂胶提取物的抑菌作用梁郁强等利用提纯的蜂胶药液、新西兰蜂胶药液和30%乙醇溶液进行体外抑菌试验表明，蜂胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有明显的抑制作用。Sato T等研究了蜂胶对引起胃癌的幽门螺杆菌的作用，发现蜂胶能杀死幽门螺杆菌，抑制脲酶活性，促进胃液分泌，减少胃病发生。张天宝等将10%蜂胶乙醇液按照1:6加水稀释后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作用15分钟，杀灭率均为100%，按1:2加水稀释对白色念珠菌作用20分钟，杀灭率为99.96%，99.98%。曾莉萍采用琼脂平板扩散法对河南蜂胶抑制金黄色葡萄球菌进行了研究，发现随p H增加，河南蜂胶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性呈阶段性减弱。随浓度降低，对金黄色葡萄球菌的抑菌活力减弱，在p H65下，产生抑菌环的最小浓度为01 2 4 2 ( 即实验剂量为84 7g ) ，证实河南蜂胶对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性。还证实对丙型链球菌无明显的抑菌活性，对甲型链球菌和乙型链球菌有明显的抑菌环活性，抑菌活性随pH增加和浓度降低而减弱。陈志宝等人研究了蜂胶对金黄色葡萄球菌毒力因子的抑制作用，发现蜂胶能够抑制标准菌株ATCC29213的生长,在低浓度时抑菌作用较弱,虽然亚抑菌浓度的蜂胶不能完全抑制金葡菌生长,但却能够抑制金葡菌的多种毒力因子的分泌。蜂胶对-溶血素的分泌抑制作用最强,且在较宽浓度范围都能明显降低-溶血素的分泌。杨明等人以乙醇浸出提取的蜂胶和CO2超临界萃取提取的蜂胶为材料,测定了两种蜂胶的效果和最低抑菌浓度。结果表明:两种蜂胶对大肠埃希氏杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌和紫色癣菌都有一定抑菌效果,最低抑菌浓度为1.543.08 mg/mL。申慧亭等人采用琼脂挖沟法与琼脂绝对浓度法,对20种临床常见的病原菌和条件致病菌（金黄色葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌,结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等）都有抑制生长的作用,对结核杆菌、白色念珠菌,新型隐球菌进行了实验室条件下的蜂胶抗菌活性研究。结论:蜂胶在体外实验条件下有明显的抗细菌、抗真菌以及抗结核分枝杆菌的作用,而且这种作用不受实验方法的影响。表2琼脂绝对浓度法蜂胶对20种细菌与真菌抗菌结果记录兰桃芳等人：采用水、9 5 乙醇及与超声波的综合作用从原蜂胶中提取蜂胶液，将得到的蜂胶提取液稀释成0.8、0.4 、0.2、0.1 ，并分别对蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、黑曲霉五种菌进行抑菌圈直径和最小抑制浓度( MIC) 的测定。结果表明，超声波作用于9 5 的乙醇蜂胶液的方法提取效果最好，提取率为27. 3。不同提取方法得到的蜂胶提取液的抑菌作用存在差异，以超声波和乙醇提取的蜂胶液对受试菌作用最强。蜂胶提取液对大肠杆菌的抑制作用最强。其次是沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌，最差的是黑曲霉。有关资料表明,蜂胶中抗菌物质主要为黄酮类物质和树脂,这些物质大部分为脂溶性,经有机溶剂提取的蜂胶液抑菌效果比较好9。该研究通过对蜂胶中活性物质的提取和抗菌作用观察初步表明,经HPLC法检测89%乙醇提取的蜂胶粗提物出现多个峰值,即检测到多种化合物,其中黄酮峰值较高,经计算含量为20. 1%,其它化合物还有待进一步定性检测。孟日增等人利用体外抑菌试验考察了蜂胶粗提物对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌的抑菌效果,结果均呈高敏。据文献报道,蜂胶除了能抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌外,还能抑制蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、黑曲霉10。陈志宝等人研究表明,蜂胶能够抑制标准菌株ATCC29213的生长,在低浓度时抑菌作用较弱,虽然亚抑菌浓度的蜂胶不能完全抑制金葡菌生长,但却能够抑制金葡菌的多种毒力因子的分泌。蜂胶对-溶血素的分泌抑制作用最强,且在较宽浓度范围都能明显降低-溶血素的分泌。3.2 蜂胶提取物的抑菌机理周先汉等人研究了蜂胶提取物的抑菌活性及其抑菌机理。较低的pH值有利于蜂胶发挥抑菌作用；温度高于常温时，蜂胶的抑菌活性有所降低，但在常规的杀菌温度范围内，仍有较好的抑菌效果且较为稳定；金属离子对蜂胶的抑菌效果影响不大。蜂胶对细菌细胞壁与细胞膜都有一定的作用，使其通透性增加，造成细胞内物质外流，破坏了细胞正常代谢的物质基础，从而达到了抑菌效果。3.3 蜂胶提取物抑菌成分稳定性研究孟良玉等人以蜡样芽孢杆菌为指示菌研究蜂胶提取物抑菌成分的稳定性。结果表明：蜂胶提取物具有较强的抑菌活性，对热处理、pH值、紫外线、金属离子均具有较好的稳定性，仅在121或pH10处理后其抑菌活性才明显下降。4 蜂胶在实际生产中的应用4.1 鸡蛋保鲜蜂胶中抗菌物质主要为黄酮类物质和树脂，这些化合物可