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微生物发酵培养基的优化方法 作者：余继叁中国热带农业科学院热带生物技术研究所 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步2。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）7。设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里22。1 发酵培养基的成分 现代分离的微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要2。其营养物质一般包括碳源、氮源（有机氮源、无机氮源）、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。另外，在设计培养基时还必须把经济问题和原材料的供应问题等因素一起考虑在内6。 此外，还要考虑所筛选的菌种来源的地点环境，比如本实验室长期从事红树林微生物的分离及其研究工作，红树林的环境处于海洋与陆地之间，所以配制培养基所用的水除了一般的去离子水外还包括陈海水。 如果在知道产物结构或者产物合成途径的情况下，我们可以有意识地加入构成产物和合成途径中所需的特定结构物质。我们也可以结合某一菌株的特定代谢途径，加入阻遏或者促进物质，使目的产物过量合成。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体-氨基已二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激赖氨酸的合成。这是因为-氨基已二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少-氨基已二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。 发酵培养基的设计和优化 由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型；另外，由于测量数据常包含较大的误差，也影响了培养基优化过程的准确评估，因此培养基优化工作的量大且复杂8。许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型（Biologicalmimicry）、单次试验（One at a time）、全因子法（Full factorial）、部分因子法（Partialfactorial）、Plackett andBurman法等。但每一种实验设计都有它的优点和缺点，不可能只用一种试验设计来完成所有的工作22。2.1 单次单因子法 实验室最常用的优化方法是单次单因子(one-variable-at-a-time)法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期3。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。2.2 多因子试验多因子试验需要解决的两个问题1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化8。2.2.1 正交实验设计正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子2。正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平结合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应面值的最优值4。正交方法可以用来分析因素之间的交叉效应，但需要提前考虑那些因素之间存在交互作用，再根据考虑来设计实验。因此，没有预先考虑的两因素之间即使存在交互作用，在结果中也得不到显示。对于多因素、多水平的科学试验来说，正交法需要进行的次数仍嫌太多，在实际工作中常常无法安排，应用范围受到限制20。2.2.2 均匀实验设计如果仅考虑“均匀分散”，而不考虑“整齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。均匀设计按均匀设计表来安排实验，均匀设计表在使用时最值得注意的是均匀设计表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的最后一个水平与第一个水平衔接起来，组成一个封闭圈，然后从任一处开始定为第一个水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平9,13。均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。例如一项因素10水平的试验，若用正交设计需要做102次试验，而用均匀设计只需做10次，随着水平数的增多，均匀设计的优越性就愈加突出。这就大大减少了多因素多水平试验中的试验次数19。2.2.3 Plackett-Burman法Plackett-Bunnan设计法是一种两水平的实验优化方法22，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。理论上Plackett-Bunnan设计法可以达到99个因子仅做100次试验，但该法不能考察各因子的相互交互作用22。因此，它通常作为过程优化的初步实验，用于确定影响过程的重要因子14。许多文献都对此有报道28。Castro PML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素（gammainterferon）的产量提高了45%23。2.2.4 部分因子设计法部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验14。2.2.5 响应面分析法响应面分析（response surfaceanalysis，RSM）方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。它与“正交设计法”不同，响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间，因子与因子之间的相互关系，并进行优化2。近年来较多的报道都是用响应面分析法来优化发酵培养基，并取得比较好的成果24,25,26,27。RSM有许多方面的优点，但它仍有一定的局限性。首先，如果将因素水平选的太宽，或选的关键因素不全，将会导致响应面出现吊兜和鞍点。因此事先必须进行调研，查询和充分的论证或者通过其它试验设计得出主要影响因子；其次，通过回归分析得到的结果只能对该类实验作估计；第三，当回归数据用于预测时，只能在因素所限的范围内进行预测4。响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义15。中心组合设计是一种国际上较为常用的响应面法，是一种5水平的实验设计法。采用该法能够在有限的实验次数下，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响过程的最佳条件14,18。3 结论培养基的优化通常包括以下几个步骤：所有影响因子的确认；影响因子的筛选，以确定各个因子的影响程度；根据影响因子和优化的要求，选择优化策略； 实验结果的数学或统计分析，以确定其最佳条件； 最佳条件的验证14。经以上几种方法的比较，我们可以通过把几种试验方法的结合，减少实验工作量，但又得到比较理想的结果。首先充分调研和以前实验的基础上，用部分因子设计21对多种培养基组分对响应值影响进行评价， 并找出主要影响因子； 再用最陡爬坡路径逼近最大响应区域；最后用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。已经有许多报道利用这几种试验相结合的方法成功地优化了目的菌株的发酵培养基10,11,12。 另外，在缺乏某一菌株的生理代谢和合成调控机制知识的情形时，可通过摇瓶实验先用Plackett-Burman法从手边可获得的多种培养基中确定出重要因素，然后用响应面优化设计法或均匀设计法得到各重要因素的最佳水平值3,16,17。参考文献1 欧宏宇,贾士儒.SAS软件在微生物培养条件优化中的应用.天津轻工业学院学报.2001,36(1):14-172 俞俊棠,唐孝宣,邬行彦等.新编生物工艺学.北京:化学工业出版社.2003:99-1193 褚以文.微生物培养基优化方法及其优化软件.国外医药抗生素分册.1999,20(2):58-664 郝学财,余晓斌,刘志钰等.响应面方法在优化微生物生物培养基中的应用.食品研究与开发.2006,27(1):38-415 胡永红,沈树宝,欧阳平凯.响应面分析法用于微生物培养基尝试的优化.工业微生物.2002,32(1):9-126 张元星.发酵原理.北京:科学出版社.2005:3247 陈坚,李寅.发酵过程优化原理与实践.北京:化学工业出版社.2002:18 李永泉,贺筱蓉,赵小立等.数理统计方法优化单细胞蛋白发酵培养基研究.微生物学通报.1995,22(5):263-2669 杨波涛.均匀设计和正交设计在微生物最佳培养配方中的应用.渝州大学学报（自然科学版）.2000,17(1):14-1910刘小杰,何国庆,陈启和等.黑曲霉-葡萄糖苷酶发酵培养基的优化.中国食品学报.2006,6(2):6-1011张大皓,谭天伟,王炳武.响应面试验设计优化脂肪酶发酵培养基.北京化工大学学报.2006,33(2):41-4412李孱,白景华,蔡昭铃等.细菌素发酵培养基的优化及动力学初步分析.生物工程学报.2001,17(2):187-19213张国权,吕小欢,罗志刚.均匀设计的方法与应用.华南农业大学学报.1998,19(2):91-9614潘向军.生物过程优化的研究进展.化工时刊.2006,20(3):54-5715Davies 0 L,Georne E P, Lewis R C.The Design and Analysis ofIndustrial Experiments(2nd ed).Londononnman Group 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