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细胞工程考试大纲绪论一、名词 高技术：是指那些能带来高经济效益、具有高增值作用，并能向经济和社会各领域广泛渗透的新技术。生物技术：指通过技术手段，利用生物体或生物过程来生产有经济价值产品或创造新物种的综合技术。细胞工程：是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行的实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。生化工程：是由生物科学与生化工程相结合的交叉学科，研究生物技术的实验成果转化为生产力过程的工程技术问题。二、知识点01生物技术的基本内容：生物技术的基本内容包括广义和狭义两个方面，狭义指基因重组、细胞融合、固定化酶与细胞、生物反应器等技术领域。广义包括资源、能量、粮食、饲料生产以及为净化环境所进行的物质分解及发酵技术等。02细胞工程主要的技术领域：（1）细胞（组织、器官）培养：in vivo 在体、活体、生物体内 in vitro 离体、生物体外（2）细胞融合（体细胞杂交、细胞并合）（3）细胞拆合（细胞质工程、细胞器移植）03细胞工程的主要应用:1 优质植物快速培育及繁殖2 动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种3 动、植物细胞培养生产活性产品、药品4 新型动、植物品种的培育5 组织工程提供医学器官修复或移植第一章 细胞培养的基本设施及条件一、名词生物安全：指为了使病原微生物在实验受到安全控制而采取的一系列措施。p1级实验室：对人体、动植物或环境危害较低，不具有对健康人体、动植物致病的致病因子的实验室。二、知识点1细胞培养室的基本要求： （1）动物细胞培养室基本要求：严格保持无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影；无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储备，各区最好分别设置相连的各个房间，特别是无菌操作室最好单独设置。 （2）植物细胞培养师基本要求：培养室的温度是可控的，一般保持在252；培养一般在散光条件下进行；培养室的相对湿度至少保持在50%以上；在培养室内应设有若干培养架以放置培养物；必要时培养室还应设置摇床。2 p1级实验室的基本要求： 1、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。第二章 清洗与消毒一、名词21清洁液：由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成的具有强氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用的液体物质。22干热灭菌：主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到160，保持1小时或更长时间，可达到消毒目的。23湿热灭菌：湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法。二、知识点1细胞培养室常见的消毒方法（1）物理灭菌法：紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤除菌法；（2）化学消毒法：消毒剂、抗生素2玻璃器皿的清洗方法 玻璃器皿的清洗，要求玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行，一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。 浸泡初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。刷洗浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。浸酸刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。 冲洗玻璃器皿浸酸后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗23次，用双蒸水漂洗1次，烤干备用。 玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法。第三章 细胞培养的基本方法一、名词1 无菌操作技术：指在细胞培养的工程中，为了防止培养物被污染而采取的无菌操作方法和技巧。2 细胞贴壁率：又称接种存活率，指直接反映细胞生存能力的贴壁生长细胞数占接种总数的百分率。3 细胞计数：细胞计数是指用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和细胞浓度的一种方法。4 MTT法：根据活细胞内线粒体脱氢酶活性，可将染料MTT还原为难容的蓝紫色结晶物质而沉淀在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度，来反映生活细胞代谢水平的一种方法即为MTT法。5 活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活动不产生任何明显影响的染色方法。6 成集落试验：在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，这种用于检验培养细胞能否增殖的试验方法即为成集落试验。7 污染：指一切进入培养系统后影响培养物的正常生理机能的与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）。二、知识点1无菌操作的技术要领与要求 1、培养前的准备根据研究内容的要求充分做好培养前的实验用品准备工作；2、超净工作台的消毒3、洗手和着装先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水冲洗，然后用0.2新洁尔灭或75洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。4、火焰消毒在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。 5、无菌培养操作进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。2培养细胞的观察技术（1）相差显微镜观察；（2）细胞计数法；（3）细胞生长曲线；（4）细胞分裂指数；（5）细胞贴壁率；（6）细胞周期；（6）MTT比色法检测细胞活力；（7）集成菌落实验3培养细胞的主要污染与排除（1）细菌的污染及检测。当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。（2）真菌的污染及检测。真菌污染最为常见，污染也容易发现。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。（3）支原体的污染及检测。支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。（4）病毒的污染及检测。病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。（5）细胞交叉污染及检测。在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。（6）有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。4细胞计数应注意的问题（1）进行计数的细胞悬液细胞密度不能过高或过低，以每个大格子中的细胞密度20-50个为宜。（2）滴加细胞悬液时，取少量，在计数板一侧滴加，不要溢出盖玻片，也不要过少或出现气泡。（3）制备细胞悬液时，尽量充分消化，将细胞团吹打开，若细胞团数量在10%以上说明消化不充分，应重新制备细胞悬液。第四章 细胞培养一、名词1动物细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的方法，在动物细胞水平进行的遗传操作，是一个涉及改变细胞遗传物质的技术领域。2细胞培养：是指将组织取出后，用化学或物理的方法，将其分散成单个细胞在体外条件下进行培养。细胞在培养的过程中不再形成组织，培养物是单个细胞或细胞群。3组织培养：指从体内取出组织，在体外模拟体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能，培养物是组织碎块或器官的一部分。4器官培养：指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能。 5原代培养：将机体取出的细胞或组织进行实效（立即）培养的过程，又称初培养。6继代培养：指从原代培养的细胞继续转接培养，又称传代培养。7细胞系：由原代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群即成细胞系。此时细胞发生了遗传突变，染色体呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制特性。8克隆：又称无性繁殖系或无性系，指由一个细胞或共同祖先通过有丝分裂所产生的遗传特性一致的细胞群或生物群，亦指DNA片段群。9接触抑制：当培养细胞分裂增殖相互间密切接触时，细胞停止活动的现象为接触抑制。10密度抑制：细胞密度过大，培养液中营养成分减少，代谢物增多，营养物质耗尽导致分裂停止的现象成为密度抑制。11天然培养液：指取自动物体液或利用组织分离提取的一种培养基，包括生物性液体（血清）、组织浸液（胚胎浸液）、凝固剂（如血浆凝块）等。12合成培养液：指在了解了细胞所需要营养成分的基础上，通过人工设计，配制成能够保证培养物生理机能和正常生长代谢的培养基。13“一代”细胞：仅指从接种到分离再培养一段时间的细胞。14组织块培养法：指将组织切割成0.51mm3的小块，在不加任何粘着剂的情况下，直接贴壁向外长出生长晕，最后连接成片形成单层细胞的培养方法。15单层细胞培养法：利用机械和消化法获得细胞悬液后，接种于细胞培养皿内，贴壁型细胞很快就贴壁生长，形成单层细胞，这种培养方法即为单层细胞培养法。16大规模细胞培养技术：利用细胞工程技术建立大规模细胞培养系统生产生物制品的综合性技术称为大规模细胞培养技术。二、知识点1外培养细胞的主要类型及其生长特点生长方式及类型： 1）贴附生长型细胞。又可分为：成纤维样细胞；上皮样细胞；游走型细胞；多型性细胞。生长特点：这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附型生长，只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞。2）非贴附型细胞（悬浮生长型细胞），特点为有的细胞在培养时不贴附于支持物上而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞。2胞系的生长过程的主要阶段及其特征1 原代（初代）培养期从接种到第一次传代，一般持续14周，此期有细胞分裂，但不旺盛。2 传代期细胞增殖旺盛，约传代1050次。3 衰退期细胞增殖很慢或不增殖，开始逐渐衰退凋亡。3血清的主要用途及注意事项（1）维持体外细胞生长；（2）提供细胞生存、生长和增值所必需的激素和生长因子；（3）补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；（4）含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面粘附和铺展的生长基质成分；（5）还能为细胞提供载体蛋白，补充细胞外基质；（6）血清中还含有糠蛋白酶成分，起到中和作用；（7）为培养液提供良好的缓冲坏境；（8）血清还有一定的黏度，可以保护细胞免受机械损伤。4细胞培养液配置的技术要点（1）水：水对维持培养细胞的生命活动是十分重要的。在培养用液中任何对细胞有害的杂质都会影响培养细胞的生存。一般培养细胞用液需用新鲜三蒸水配制。（2）平衡盐液：由生理盐水和葡萄糖制成，用于维持细胞渗透压、调节培养液酸碱平衡。常用Hanks液和Earls液。（3）培养基pH调整液：常用不同浓度的NaHCO3液。（4）细胞消化液：主要有胰蛋白酶溶液和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。使用时通常将二者按不同比例混合。（5）抗生素溶液：常用抗生素有青、链霉素、卡那霉素和制菌霉素。（6）消化酶抑制剂：在无血清培养时加入消化酶抑制剂，可以保护细胞免受残留消化酶的过度消化作用带来的影响。（7）谷氨酰胺补充液：在细胞代谢过程中起重要作用，一般配置为100倍的浓缩液，配置时应加温至30。，完全溶解后过滤除菌，分装成小瓶-20储存。5原代细胞培养的方法、主要步骤、技术要点以及各自的适用范围（1）组织块培养法 组织切割成0.51mm3的小块后，由于组织块体积很小，在不加任何粘着剂的情况下，它们也能直接贴附于瓶壁上，然后细胞自组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片形成单层细胞。此方法程序比较简单，是当前各培养室常用的方法，特别适合于组织量少的原代培养。 （2）单层细胞培养法所有组织中都含有一定量的细胞间质(纤维、基质等)，妨碍细胞生长。用酶消化后，能除去间质，使组织松散，容易分离成单个细胞或较小的细胞团，接种后细胞易于生长。本法尤其适用于细胞建系和大量组织培养。（3）悬浮细胞培养对于悬浮生长的细胞如白细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等癌细胞，可直接接种进行原代培养。6贴壁细胞传代的主要方法及技术要点（1）方法：消化传代法；（2）技术要点：首先要吸去培养瓶中的原有培养液，加入消化液在37温箱或25以上坏境进行消化；当发现细胞胞质回缩，细胞间间隙增大后，可立即吸出或倒掉消化液，向瓶内注入Hanks液数ml把残留消化液冲掉；然后再加培养液，终止消化，将消化后的细胞稀释成一定浓度进行培养。7悬浮细胞传代的主要方法及技术要点（1）直接传代 技术要点直接传代应让悬浮细胞漫漫沉淀在瓶底后，将上清液吸掉l/22/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。（2）离心方法传代 技术要点在超净工作台内用小吸管(弯头)将培养瓶中的细胞吹打均匀，尤其是将那些半贴壁的细胞吹打起来； 吸入离心管中，塞紧橡皮塞，与另一离心管平衡后置离心机中1000rmin离心5分钟； 回到超净工作台操作，弃旧液体，加入适量培养液，用吸管打匀，制成悬液； 以(510)104个ml细胞密度传至新备的培养瓶或培养皿中，放入温箱继续培养；若只为了保留细胞，则吸取少量细胞悬液至另一瓶中，加入适量新培养液即可。8细胞冻存与复苏的技术要点及注意事项（1）冻存 冷冻保护液：含10%血清的培养液中加10%的甘油或7.5%10%的二甲基亚砜（DMSD）首先将细胞放入冷冻保护液进行预冷却，然后按1 ml/安瓶装瓶封口。再放入慢冻机按每分钟下降1 的速度缓慢冷冻至25 ，最后放入液氮。-90可保存6个月，-196几乎可无限期保存。细胞的冻容要选择合适的速度以防止细胞强烈收缩或胞内结冰。（2）复苏 迅速取出盛冰冻细胞的安瓶投入37水浴中，继而摇动安瓶使内容物在20-60秒内完全恢复悬液状态。复苏过程中要适当保持复温速率以防止细胞内结冰而造成细胞损失。9细胞培养的作用意义（1）有害物质的快速检测；（2）大面积皮肤烧伤的修复；（3）遗传病的产前诊断；（4）建立各种医学模型；（5）大量生产生物活性物质；（6）细胞与细胞之间的相互作用；（7）细胞内部与细胞外界之间的作用；（8）细胞内胞质的活动；（9）胞质与核质之间的流动第五章 细胞融合一、名词1细胞融合：用人工方法把同种或不同种的两个或两个以上的细胞，通过介导物作用，融合成一个细胞的技术。亦称体细胞杂交（somatic hybridization）。2 HAT培养基：指含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的选择培养液。3单克隆抗体：由单个杂交瘤细胞增值产生的克隆细胞群分泌的高纯度的抗体称为单克隆抗体。4基因定位：通过遗传杂交、绘制图谱或核酸探针杂交等手段确定基因在染色体上的相对和绝对位置。二、知识点1 HAT选择的原理一个亲本细胞株为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT），另一个亲本细胞株为胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK），在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的HAT选择培养液中，上述亲本细胞都无法生存，只有融合以后的杂种细胞才能生长，因此可有效地选择出杂种细胞。2细胞融合的主要应用（1）进行基因定位，绘制人类基因图；（2）诱导PC染色体；（3）体细胞杂种的致瘤性分析；（4）遗传缺陷的基因互补；（5）分化功能表达调控的研究；（6）淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体；（7）植物细胞的原生质体融合培育杂种植株；（8）核质相互作用关系；（9）基因治疗；（10）疾病诊断3融合体的基本类型及其筛选（1）类型：同核体同源原生质体的融合； 异核体非同源原生质体的融合； 多核体含有双亲不同比例核物质的融合。（2）筛选方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选法；生长特性筛选法。第六章 胚胎工程一、名词解释1胚胎工程：通过在生殖细胞、胚胎细胞水平上的显微操作技术，来定向控制、改造和创造新遗传性状的技术，是动物细胞工程的拓展和延伸。又称发育工程2体外受精/试管婴儿：是采用人工方法让卵细胞和精子在体外受精，并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿。3胚胎移植：指从某个体采胚或将试管内的受精卵（8细胞以上或囊胚期）移植到另一个体的输卵管或子宫中去的技术。4胚胎分割：采用显微操作技术，将早期胚胎切割成多份，再移植给受体母畜，达到实现同卵多胎后代的技术。5胚胎融合：又称胚胎嵌合。将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内继续发育形成一种嵌合体后代的技术。6嵌合体：用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，亦指染色体异常类型之一。有时也有同一器官出现不同性状的生物体的意思。7胚胎性别鉴定：指利用细胞生物学或分子生物学的方法识别胚体性状，有效控制动物后代性别比例的技术。8胚胎冷冻技术：指将动物的早期胚胎，通过使用特殊的保护剂和降温措施，使其长期保存在超低温坏境下的一项技术。9超数排卵：在母畜发情周期的适当时间用人工方法促使其有更多的卵泡发育、成熟、排卵的一项技术。10同步发情：指使供体和受体同步发情，即处于相同的生殖周期。二、知识点1胚胎工程的主要技术领域（1） 体外受精；（2） 胚胎移植；（3） 胚胎分割与融合；（4） 胚胎性别鉴定；（5） 胚胎冷冻技术；（6） 基因导入2体外受精的基本过程（1） 精子的采集及体外获能，精子获能分为体内获能与体外获能，体外获能第一步离心，第二步洗涤改变膜的渗透性；（2） 卵子回收及成熟培养；（3） 卵子和精子的体外受精（in vitro fertilization IVF），受精成功的标志至少是看受精；卵是否可以发育至囊胚期阶段（4） 受精卵的体外发育及体外培养。3试管婴儿的基本步骤（1）控制性超排卵；（2）监测卵泡；（3）取卵；（4）取精；（5）体外受精；（6）胚胎体外培养；（7）胚胎移植；（8）胚胎移植后补充黄体酮；（9）胚胎移植后第14天验晨尿和血确定是否妊娠；（10）妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位4胚胎工程的意义（1） 发挥优良母畜的繁殖能力胚胎移植技术是提高母畜繁殖潜力的有效方法，扩大良种雌性配子的推广利用。（超数排卵、同步发情）。 （2） 促进家畜改良的速度（泌乳高的奶牛、瘦肉型猪、毛肉兼用的细毛羊等）。（3） 作为胚胎操作的基础（卵子切割、性别控制、嵌合体制作、细胞核移植、转基因操作等）。（4） 保存遗传资源胚胎超低温冷冻技术的运用，给长期保存和运输、异地移植带来方便，还可用于建立“胚胎库”等。第七章 干细胞与组织工程一、名词1干细胞：即起源细胞，是一类未分化的细胞或原始细胞，具有自我更新和分化潜能的细胞。2胚胎干细胞：从早期胚胎中分离出来的干细胞，具有全能性。可以分化成任何组织类型的细胞。3成体干细胞：是成体组织内具有自我更新及分化产生1种或1种以上子代组织细胞的未成熟细胞。ES细胞：指桑椹球细胞，是将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”的增值传代，同时还保持全能型的胚胎干细胞。EC细胞：指畸胎瘤细胞，将小鼠附植体胚胎异位移植到肾脏的被摸下，得到一种能够连续传代的多潜能细胞系胚胎癌细胞或畸胎瘤。EG细胞：指生殖原基细胞，由原始生殖细胞培养分离得到。组织工程：是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的综合性生物工程。二、知识点1干细胞的分类与特点（1）按其分化潜能可分为三类全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞。多能干细胞具有分化成一种器官的多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。专能干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如表皮的基质细胞只能分化产生角化表皮细胞、精原细胞只能分化产生精子等，（2）按干细胞来源分为两类：胚胎干细胞：从早期胚胎中分离出来的干细胞，具有全能性。可以分化成任何组织类型的细胞。成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化产生1种或1种以上子代组织细胞的未成熟细胞。2目前已分离的胚胎细胞胚胎干细胞包括畸胎瘤细胞（EC）；桑椹球细胞（ES）；囊胚内细胞团（ES）；拟胚体细胞（ES）；生殖原基细胞（EG）等。 3成体干细胞的种类（1）神经干细胞；（2）血液干细胞；（3）骨髓间充质干细胞；（4）表皮干细胞；（5）生殖干细胞等。4干细胞研究的主要应用与意义（1）应用：组织或器官的修复与替换；基因治疗。 （2）意义：干细胞是目前国内外生命科学研究的热点和前沿课题。胚胎干细胞在临床医学、组织工程、克隆动物、转基因工程、生物学基础研究等领域具有重要的理论价值与应用潜力，其中人类胚胎干细胞在心肌梗死、心肌坏死、帕金森氏症、老年性痴呆症、脊髓损伤、皮肤烧伤等修复与治疗方面，具有广阔的应用前景。第八章 核移植技术与动物克隆一、名词1细胞重组：通过一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器，又称细胞拆合。2胞质体：除去细胞核后由细胞膜包裹的结构。3核质体：在得到胞质体的同时，离心收集排除的有完整细胞核，带有少量细胞质并围有完整细胞膜的结构便是核质体。4微细胞：含有一个微核（仅有一条或几条染色体）并带有薄层细胞质。5胚胎细胞克隆：用未分化的胚胎细胞进行核移植称为胚胎细胞克隆；用已分化的体细胞（即非生殖细胞）。进行核移植称之体细胞克隆。6同种体细胞克隆：将一种动物的体细胞核移植到同一种动物的去核卵母细胞中，这种技术即为同种体细胞克隆。7异种体细胞克隆：将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核卵母细胞中，这种技术即为同种体细胞克隆。8核移植技术：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵母细胞内的精细操作技术。包括胚胎核移植和体细胞核移植两种。二、知识点1细胞重组的方式与意义（1）方式：1）胞质体与完整细胞的融合形成胞质杂种；2）微细胞与完整细胞的融合形成微细胞异核体；3）胞质体与核体（小细胞）融合形成重组细胞（核质杂种（2）意义：1）研究核质关系；2）研究细胞器的功能及相互作用关系；3）研究细胞器的组装，甚至细胞的自我装配机理，以揭示细胞起源与进化的机制；4）结合基因转移技术，可人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞。2克隆研究的主要内容（1）供体细胞的来源和特性；（2）细胞质受体的来源和特性；（3）重构胚核质适应机；（4）克隆技术支持体系的研究；（5）重构胚胎的体内和体外培养技术；（6）克隆技术的使用化研究。3克隆的理论与技术基础（1）克隆的理论基础：细胞的全能性；（2）克隆的技术基础包括：核移植技术；胚胎移植技术等。4核移植的技术要点、应用与发展前景（1）技术要点： 受体体细胞的准备。受体为成熟的卵细胞。采用机械法（剥离）或化学法（胰蛋白酶）去卵膜，然后用玻璃微针挑出细胞核或紫外线照射使核物质分解以达到去核的目的。 供体细胞的准备。供体通常选用：胚胎细胞发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞；胚胎干细胞来自胚胎内细胞团成年动物体细胞。其共同的特性是细胞核具有全能性。 移核。选择合适的微吸管穿过透明带注入去核卵母细胞中，避免移入过多的细胞质、控制温度，短时间内完成。还可用供核细胞和卵母细胞的融合实现核转移。融合和激活。融合是指用某种方法使核与胞质融为一体的过程；激活是通过某种刺激使卵子内钙离子浓度升高，给卵一个启动信号，促使细胞周期的恢复。（2）应用：制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；培育优良品种，扩大育种种群；开展异种动物克隆，拯救濒危动物；与干细胞技术相结合，开展医疗性克隆；用核移植技术，研究生物学的基本问题。（3）前景：核移植技术正在不断被人们接受,并已用于治疗性克隆和动物实验研究。随着人们观念的改变和技术的不断完善,核移植技术的应用范围将不断扩大,具有广阔的应用前景。5“多莉”的制备步骤（克隆动物的制备程序） 核供体动物的选择与细胞核的获得核受体动物的选择与细胞核的移出供体核的移入及原核的取出胚泡的体外试管培养代母的选择与胚泡移入子宫克隆动物的体内发育与出生（见课本）。第九章 转基因动物与动物生物反应器一、名词1转基因动物：以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。2基因治疗：在基因水平上治疗疾病的方法。其手段包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。3基因打靶：通过DNA分子同源重组，特异性改变基因组中靶基因序列，以研究目标基因的体内功能或相关疾病发病机制的一种基因操作技术。4动物生物反应器：利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。二、知识点1遗传物质导入受体细胞的方法 （1）物理法：包括电穿孔法、显微注射法和裸露DNA直接注射法。 （2）化学法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙DNA沉淀法和脂质体载体包埋法。 （3）生物学方法：指病毒介导的基因转移。常用DNA病毒载体和反转录病毒载体。2转基因动物的制备方法（1）原核期胚胎显微注射法。在显微操作仪上直接将外源基因注射到受精卵的雄原核中。（2）反转录病毒感染法。先将外源基因重组到DNA病毒或RNA病毒上，再用此去感染着床前后的胚胎，从而将外源基因整合到胚胎基因组中。（3）胚胎干细胞方法（ES细胞途径）。指将外源基因导入胚胎干细胞，然后再将转化的ES细胞转移到宿主囊胚中发育成转基因动物或通过核移植结合克隆技术获得转基因动物。此项技术在转基因小鼠方面比较成功。（4）精子载体法。将成熟的精子与外源DNA共培养，DNA可进入精子头部，受精后便可发育成转基因动物。（5）人工酵母染色体（YAC）转基因法（6）受精前卵细胞显微注射法。是在反转录病毒法基础上进行的。先将外源基因克隆至反转录病毒载体，然后将其注入到受精前卵细胞的卵周腔，通过体外受精、胚胎移植，最后产下转基因动物。（7）其它方法。包括电脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、基因剔除和基因嵌入法等。第十章 动物染色体工程一、名词1染色体工程：按一定设计，有计划消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的方法技术。2人工染色体：指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。3 YAC染色体：利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆。二、知识点动物染色体加倍的技术（1）生物学方法采用胚乳培养和体细胞杂交等方法进行。（2）物理学方法包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。其原理是设法阻止第二极体的排出或第二次成熟分裂。（3）化学方法细胞松弛素B：抑制肌动蛋白聚合成微丝，阻止胞质分裂；秋水仙素：抑制纺锤体的形成，导致复制后的染色体不能移向两极，形成染色体的加倍。第十一章 植物组织培养一、名词1植物细胞工程：它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。 2植物组织培养：在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。3外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。4脱分化：已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。5再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。6愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。7胚状体：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。8大量元素：植物所需的浓度大于0.5mmol/l的元素为大量元素。9微量元素：植物所需的浓度小于0.5mmol/l的元素为大量元素。10器官发生途径：由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。11胚状体发生途径：在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。二、知识点1植物细胞工程的主要内容（1）植物细胞、组织和器官的培养；（2）花药培养技术；（3）植物原生质体的制备（4）植物原生质体的融合；（5）原生质体的摄入实验；（6）转基因植物的制作；（7） 染色体（组）的操作技术 2植物组织培养的理论基础细胞全能性。3植物细胞工程的技术手段（1）植物组织培养；（2）植物体细胞杂交4植物组织再分化的两条途径（1）器官发生途径；（2）胚状体发生途径。5植物组织培养的主要步骤与技术要点（1）主要步骤：实验材料的清洗和消毒；培养基的选择与配制；接种。（2）技术要点：1）实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。2）清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在接种之前，须经严格地灭菌。选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，又要易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长，还需考虑浓度和时间。3）培养基的选择和配制必须满足培养物的生长要求。4）接种过程必须严格进行无菌操作一防止杂菌污染。6影响植物细胞脱分化和再分化因素（1）内部因子：植物的遗传性状、生理状况。（2）外部因子：营养条件（植物激素、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的ph、渗透压、温度、湿度、光照等）。7愈伤组织有的特点及其在细胞工程中的重要性（1）特点：无组织结构；无明显极性，松散；相对未分化的细胞团。（2）重要性：愈伤组织的诱导是植物细胞体外再生的第一步，也是关键的一步。党组织从植物体上分离下来时，细胞一般处于静止状态，成为静止细胞，静止细胞的活化为细胞的分裂提供了物质保证。8愈伤组织再生植株的途径成熟细胞脱分化形成分生细胞，分生细胞分裂形成愈伤组织，愈伤组织进行再分化发生器官或胚状体发生，最后形成再生植株。9植物组织与动物细胞的超低温保存原理及方法的不同*超低温保存植物材料的原理与保存动物材料相同。在-196的超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止。因此，细胞、组织、器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。在降温冷冻过程中，如果细胞内的水发生结冰，也会造成植物细胞结构不可逆性的破坏而死亡。因此，同动物细胞低温保存一样，种质超低温保存成功的关键是在于降温冷冻过程避免细胞内结冻。需使用冷冻保存剂，选择合适的降温冷冻速度和化冻方式。10植物细胞的几种大规模培养系统的特点及其影响因素（1）悬浮细胞培养系统。大规模培养需生物反应器：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、旋转式生物反应器。（2）固定化培养系统。按支持物不同分：包埋式固定化培养系统；附着式固定化培养系统。（3）植物器官培养系统。根据不同的培养体系、不同的培养目的、确定不同类型的生物反应器，是该技术应用的核心。11生长素、细胞分裂素的生理作用及其在组织培养中的意义（1）生长素的生理作用：促进细胞生长和细胞分裂；诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；形成愈伤组织，促进生根；与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。 意义：组织培养中，生长素被用于诱导细胞的分离和跟的分化，其中，IBA和NAA广泛用于生根并能与细胞分裂素相互作用促进茎的伸长生长，2，4-D和2,4,5-T对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。（2）细胞分裂素类功能： 1）促进细胞的分裂和分化 ；2）诱导芽的分化 ；3）促进侧芽的萌发和生长 ；4）抑制衰老 意义：促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。第十二章 植物的快速繁殖一、名词植物快速无性繁殖：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性一致的植株，这一技术称为植 物快速无性繁殖技术。二、知识点1植物脱毒的方法（1）微茎尖培养法微茎尖培养法是目前最常用的脱毒方法，其机理是病原体在植物体内的分布是不均匀的，越靠近生长点，病毒浓度越低。对此机理的解释：能量竞争，传 导抑制，激素抑制，酶缺乏，抑制因子。（2）珠心组织培养法通过无毒的珠心组织培养可以获得无毒植株（3）热处理法热处理法是传统的消毒方法，其基本原理是植物细胞比病毒耐高温。用37温度热处理植物材料，在不损伤培养材料的前提下，抑制病毒的复制，钝化病毒的活性。2植物快繁技术的主要步骤（1）无菌母株制备；（2）不定芽增殖；（3）完整植株的形成；（4）再生植株的锻炼和驯化；（5）再生植株的鉴定。3植物脱毒时外植体的预处理途径：预处理包括光照、温度、生长调节物质。第十三章 体外单倍体诱导与单倍体育种一、名词花药培养：指将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。二、知识点1花药培养中外植体的选择（1）材料的遗传变异。不同物种之间花药培养的反应存在跟大差异，同一属内不同种或品种之间也存在诱导性的差异。母本材料的基因型是影响花药培养的关键因素，不同基因型植株的花药对培养的反应不同。花药培养的诱导率也与杂种优势有关，一般情况下杂种比纯种容易诱导。（2）母本生理状态的影响。母本生理状态直接影响花药培养力，母本的氮素营养水平是另一个重要的影响因素。（3）花粉发育时期。被子植物的花粉发育过程经历三个阶段，即第一期四分体时期、第二期单核期（小孢子阶段）、第三期双核期和三核期（雄配子体阶段）。单核期又分为单核早期、但和中期、单核晚期。2花药培养与花粉培养的不同点（1）从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。（2）从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。（3）从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干 扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。3花药培养中再生植株的形成途径与再生植株倍性的关系（1）形成途径：器官再生和胚状体再生。（2）倍性关系：花药培养是