临床研究类医学优秀论文 (27).doc

野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进及其鉴定作者：林观平，李树梅，熊亮，周克元 作者单位：广东医学院生物化学与分子生物学教研室,广东湛江 524023;四川省攀枝花市十九冶医院妇产科, 四川攀枝花 617023;赣南医学院预防医学教研室，江西赣州 341000 【摘要】 目的 为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法 用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrackCMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coli BJ5183（Ad1 cells），以获得重组腺病毒质粒，经限制酶Pac线性化后，转染293细胞, 检测PTEN蛋白的表达，并以AdPTEN感染人乳腺癌MCF7细胞后, 测其感染率。结果 获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(AdPTEN)，受AdPTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变，经PCR对传代的AdPTEN分析证实得到目的基因PTEN，荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。AdPTEN感染的人乳腺癌MCF7细胞, 感染率达80%90%。结论 PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建，方法较简便、快速，且生成的病毒滴度高、感染率高。 【关键词】 重组腺病毒；PTEN；基因治疗基金项目：广东省重点学科建设资助项目( 编号:GX 9307)Improvement of construction of wildtype PTEN gene recombinant adenovirus expression vector and its identificationLIN Guanping, LI Shumei, XIONG Liang, ZHOU Keyuan(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China) Abstract:Objective To improve the construction of adenovirus expression vector harbouring widetype tumor suppressor gene PTEN. Methods PTEN gene was inserted into the shuttle vector pAdTrackCMV containing green fluorescence protein (GFP) gene, the recombinant plasmid containing adenovirus backbone vector pAdEasy1 was then transformed into E. coli (BJ5183). PTEN protein expression in the recombinant was determined after Pac I linearization and 293 cell transfection, and its infection rate was detected by human breast cancer cell line MCF7 infection. Results Recombinant adenovirus expression vector AdPTEN was obtained. The transfected 293 cells showed cytopathic effect. PTEN gene and protein expression and green fluorescence were observed in passage 293 cells. The infection rate of MCF7 cells was 80%90%. Conclusion Recombinant adenovirus expression vector AdPTEN can be constructed by homologous recombination with bacteria.The construction method is simple and rapid, and AdPTEN infection test exhibits high virus titer and infection rate. Key words: recombinant adenovirus; PTEN; gene therapy 基因治疗的关键是基因载体的选择，近年来广泛使用的是腺病毒(adenovirus, Ad)载体。其主要优点在于能够在哺乳动物及其他多种细胞进行基因转移和蛋白的高效表达, 且跟宿主细胞染色体不发生整合，是一种比较安全，转染效率又高的载体1。然而由于构建重组腺病毒载体的传统方法繁琐费时,对实验条件要求较高,并需要一定经验等因素而严重束缚了其应用。因此, 建立简单、快速的获得重组腺病毒的方法一直是Ad载体研究的热点和难点。1998年He等2首次报道了AdEasy系统, 该系统的最大改进是在大肠杆菌中完成同源重组，有效率高和成功率高的特点。我们采用该系统构建PTEN重组腺病毒表达载体，旨在短时间内能获得大量的重组腺病毒，为下一步进行肿瘤的PTEN基因治疗研究做准备。本文是对野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进。 1 材料与方法 1.1 材料 插入野生型PTEN基因的逆转录病毒载体pBPwt PTEN由美国加州大学Ludwig癌症研究所Furnari教授惠赠；穿梭载体pAdTrackCMV质粒和含有E1E3区联合缺失的腺病毒骨架质粒载体pAdEasy1的 E.coli BJ5183（Ad1 cells）由美国休斯霍华德医学院及John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠，其中pAdTrackCMV带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，在表达外源基因同时也能单独表达GFP，可用于重组腺病毒的快速筛选；E.coli XL10和包装细胞系腺病毒E1区转化的人胚肾293细胞及乳腺癌细胞MCF7为本教研室保存。限制性内切酶Pac及Pme购自NEB公司，其它限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara公司，lipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 方法1.2.1 PCR 扩增PTEN基因片段 根据野生型PTEN的cDNA序列设计一对特异性寡核苷酸引物：正向引物P1：AAGGTACCCCACCATGACAG，反向引物P2：GGGAAGCTTTCAGACTTTTGTA，分别带有Kpn和Hind 酶切位点。以pBPwtPTEN质粒为模板作PCR得到含有Kpn和Hind酶切位点的PTENcDNA序列，PCR产物用回收试剂盒纯化。PCR反应条件为：95 预变性 5min；94 变性30s，51 退火50s，72 延伸80s，循环35次，最后72 延伸 10 min。1.2.2 PTEN基因重组质粒 pAdTrackPTEN的构建及鉴定 分别用限制性内切酶Kpn和Hind 双酶切PCR产物和穿梭质粒pAdTrackCMV，酶切产物经胶回收试剂盒纯化后，将线性化的载体与PTEN片段按 13的摩尔比混合，用 T4 DNA连接酶于16连接过夜，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细菌，随机挑选卡那霉素（Kana）抗性菌落, 扩增后以碱裂解法小量提取质粒，用Kpn和Hind 双酶切和PCR筛选含PTEN基因片段的重组质粒pAdTrackPTEN一并送上海生物工程公司测序，测序结果与Genebank（AH005966）的一致。 1.2.3 在E.coli BJ5183中同源重组生成重组腺病毒质粒pAdPTEN用线性化的pAdTrackPTEN质粒转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coli BJ5183感受态菌（CaCl2法）。含重组质粒的BJ5183可在含Kana的LB平板上生长形成菌落，挑取1015个最小的菌落，扩增后以碱裂解法小量提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳与pAdEasy1比较大小(初筛)，选择较大的重组腺病毒质粒DNA用Pac酶切鉴定后，用正确的重组腺病毒质粒转化大肠杆菌XL10感受态细菌并扩增。1.2.4 重组腺病毒AdPTEN的包装和扩增 293细胞(2106)接种于60mm的培养皿中培养过夜，达 5070融合度时进行转染。取4g重组腺病毒质粒pAdPTEN，用限制性内切酶Pac进行酶切线性化，纯化后回收于20L水中。按lipofectamineTM2000操作说明书转染293细胞。定期用荧光显微镜监测 GFP 表达。转染后 710d用细胞刮匙刮取细胞转入 10mL离心管中，2000 r/min离心10min，弃上清。细胞团块用PBS重悬，反复冻融4次裂解细胞，短暂离心后收集病毒上清于20保存。取病毒上清的3050作二次感染293细胞， 荧光显微镜监测GFP表达。转染后35d即可收集重组腺病毒上清，可反复感染293细胞,扩增病毒至所需滴度。1.2.5 重组腺病毒AdPTEN的鉴定 检测GFP表达确认重组腺病毒包装成功。取1L病毒上清， 加入5L蛋白酶(20g/L)，55 反应1h后，煮沸5min，1000g离心1min，取1L上清以P1、P2引物做PCR鉴定，反应条件同前，同法处理空白对照腺病毒AdGFP。1.2.6 Western blot鉴定PTEN蛋白的表达 以5104接种293细胞于10cm塑料平板，约24h后，用AdPTEN感染细胞, 24h后离心收集细胞, 细胞沉淀及上清各加等体积的2上样缓冲液，100 煮沸5 min 后进行SDSPAGE，将靶蛋白从凝胶转移至PVDF膜。15%脱脂牛奶室温封闭1h后，加一抗（1400）于室温孵育2h，用TBS洗涤4次，每次15min；用HRP标记的二抗（12000）孵育1h，再用TBST(含0.05%Tween20)缓冲液洗涤4次，每次15min，使用发光试剂（ECL）显荧光，曝光显影，同时以正常293细胞作为对照。1.2.7 AdPTEN感染效率的测定 以1105 MCF7细胞接种于T25细胞瓶中, 24 h后，取50L AdPTEN病毒上清感染细胞3 h后，移去原培养基，加入新鲜培养基，37 继续孵育24 h，然后置于倒置荧光显微镜下观察。 2 结果 2.1 重组腺病毒基因组质粒的获得2.1.1 构建PTEN基因重组穿梭载体结果 取重组的pAdTrackPTEN用Kpn和Hind 双酶切鉴定，切下1220bp和9kb两条带，而空载体pAdTrackCMV只切出一条带,与预期结果相符，证明载体构建正确(图1A)。2.1.2 在大肠杆菌BJ5183内的同源重组结果 将限制酶Pme线性化后的重组穿梭质粒pAdTrackPTEN转化AD1 cells后， pAdEasy1与以线性化存在的重组穿梭质粒的同源序列发生基因重组，获得重组腺病毒质粒pAdPTEN，与pAdEasy1一起进行琼脂糖凝胶电泳(初筛)，片段较大的质粒用Pac酶切鉴定,重组腺病毒质粒被切下约30kb和4.5kb的两个片段(图1B)，说明已成功获得重组腺病毒质粒。 M：1kbMark;1：pAdTrackCMV；2：pAdTrackPTEN M：Hind ；1：pAdPTEN A.重组质粒Kpn和Hind 双酶切 B.重组质粒Pac酶切 图1 重组质粒限制酶切电泳图（略） 2.2 用重组腺病毒质粒pAdPTEN转染293细胞 用Pac酶切重组腺病毒DNA质粒，获得重组腺病毒基因组的DNA分子并转染293细胞，约经过714d后, 细胞出现肿胀、圆缩等典型的细胞形变(CPE)(图2B), 证明已得到重组腺病毒AdPTEN。 A.转染前正常293细胞B.转染后的细胞 图2 转染重组腺病毒质粒pAdPTEN前、后的293细胞形态（略） 2.3 重组腺病毒的鉴定及PTEN蛋白的测定2.3.1 GFP荧光检测结果 重组腺病毒感染293细胞后，用荧光显微镜观察发现,自感染24h起, GFP发出的荧光逐渐明显(图3)，这与预期结果相符。 A.病毒感染24h后的293细胞 B.病毒感染48h后的293细胞 图3 感染病毒后293细胞中GFP的表达（略）2.3.2 PCR检测目的基因PTEN结果 以二次感染后的AdPTEN为模板, 经PCR扩增到一条1.2kb的条带,与目的片段大小基本一致, 而AdGFP则没有目的片段(图4)，证实在AdPTEN基因组中有特异性的PTEN基因的整合。2.3.3 Western blot检测PTEN蛋白结果 SDSPAGE结果显示, AdPTEN感染293细胞24h后，在55 kD 处有明显条带出现（图5A）。Western Blot 见55 kD 处特异性的条带，而正常293细胞条带较细（图5B）。 M: DNA Marker; 1: AdGFP; 2: AdPTEN 图4 PCR鉴定重组腺病毒（略）M：protein marker;1：normal 293cells;2： virus supernatant 图5 SDSPAGE(A)及Western Blot结果(B)（略）2.3.4 AdPTEN感染效率的测定 通过荧光显微镜对不同视野下MCF7细胞的观察, AdPTEN感染率达到80%90%。 A、C、E 光镜下3个不同视野，B、D、F为荧光镜下A、C、E相对应视野的结果 图6 荧光显微镜测定AdPTEN感染效率（略） 3 讨论 肿瘤阻抑基因PTEN的表达产物具有双特异磷酸酶活性,可以负调控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/AKt信号转导途径，因而能抑制细胞的生长增殖。PTEN突变和缺失多见于前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌，胶质瘤等35。在某些PTEN突变或缺失的癌细胞中表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成，使细胞在G1期停滞和凋亡68，而且在一些正常表达PTEN蛋白的癌细胞中过表达也能抑制其生长和诱导细胞死亡9，这就提示PTEN基因用于癌症基因治疗有着重要意义。当前，基因治疗中广泛使用腺病毒载体。构建重组腺病毒的方法有许多种10，传统的方法中，实现重组的过程多是选择在真核细胞 (本法选择大肠杆菌细胞) 内完成, 还需同时将骨架质粒和穿梭质粒共转染293细胞，同源重组效率低，要获得滴度高的重组腺病毒有较大的难度，且不能完全避免野生型病毒的产生，需进行噬斑纯化，构建过程繁琐耗时。邱镇等11构建的PTEN重组腺病毒载体的方法跟本文的相似，但其需经氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，过程复杂、费时。我们采用AdEasy系统构建PTEN重组腺病毒表达载体, 最大特点是将在真核细胞改为在大肠杆菌中完成同源重组，同样可达Majhen等1报道的效果。此外，还可利用含不同抗生素的平板筛选重组子，简化了筛选工作。由于PTEN重组腺病毒带有GFP基因，因此可直接通过荧光显微镜监测病毒的生成、测定病毒滴度和对宿主细胞感染效率的检测。 因为方法简便、周期缩短, 我们很快就能获得PTEN重组腺病毒，用于感染人乳腺癌MCF7细胞, 感染率达80%90%,为进一步应用于肿瘤的基因治疗研究有着重要的意义。晋升网（）致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标。【参考文献】 1 Majhen D, AmbriovicRistov A. Adenoviral vectorshow to use them in cancer gene therapy? J. Virus Res,2006, 119(2):121133.2 He T C, Zhou S, Costada L T, et al. A simplified system for generating recombinant adenovirusesJ. Proc Natl Acad Sci USA,1998, 9(5):25092514.3 Cristofano A D,Pandolfi P P. The multiple roles of PTEN in tumor suppressionJ. Cell, 2000,100（4）:387390.4 Knobbe C B, Merlo A, Reifenberger G. PTEN signaling in gliomasJ. Neuro Oncol,2002,4（3）:196211. 5 Deocampo N D, Huang H, Tindall D J. The role of PTEN in the progression and survival of prostate cancerJ. Minerva Endocrinol, 2003, 28（2）:145153.6 Cheney I W，Johnson D E, Vaillancourt M T, et al. Suppression of tumorigenicity of glioblastoma cells by adenovirusmediated MMAC1/PTEN gene transfer J. Cancer Res, 1998, 58 (11): 23312334.7 Furnari F B, Huang H J, Cavenee W